氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)

1、氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)1氨基酸1.1結(jié)構(gòu)特征l 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸：至少有一羧基（carboxyl）和一氨基連接在同一個(gè)碳原子上（該碳原子稱為-碳原子）。l 注意，脯氨酸含亞氨基。l 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸是20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（可能含有非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸經(jīng)修飾而形成的）。最近又發(fā)現(xiàn)了兩種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。l 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中，1806年發(fā)現(xiàn)第一種氨基酸天冬酰胺，1938年發(fā)現(xiàn)最后一種蘇氨酸。l -碳采用sp3雜化，鍵角109.5°。l -碳是手性中心（大多數(shù)情況下，只有-碳是手性中心；甘氨酸無(wú)手性，因R基為H）。其絕對(duì)構(gòu)型采用D,L系統(tǒng)，建立在L-甘油醛（L-glyceraldehydes）和D-甘油醛

2、的結(jié)構(gòu)之上。l D、L構(gòu)型與其實(shí)際的旋光性無(wú)關(guān)。l 到目前為止在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸都是L的（酶的活性位點(diǎn)是不對(duì)稱的，即酶促反應(yīng)是在手性環(huán)境下進(jìn)行的），D僅存在于細(xì)菌細(xì)胞壁上的短肽和抗生素小肽。1.2分類l 非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸是標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的衍生物（derivative）。l 根據(jù)R基的不同性質(zhì)將氨基酸進(jìn)行分類，按其極性或在生理pH（近7.0）下與水相互作用的趨勢(shì)分為5類：非極性脂肪族、芳香族、極性不帶電、帶正電（堿性）、帶負(fù)電（酸性）。l 非極性脂肪族：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸。（衣架涼鞋餅干異亮、甲硫、亮、纈、丙、甘）l 芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。（食老本（粵語(yǔ)）

3、色、酪、苯丙）l 極性不帶電：絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺。（詩(shī)書(shū)伴琴譜絲、書(shū)、半胱、脯；天凍先安谷天冬、酰胺、谷）l 帶正電：賴氨酸、精氨酸、組氨酸。（組隊(duì)來(lái)京晉見(jiàn)組、賴、精、堿性）l 帶負(fù)電：天冬氨酸、谷氨酸。（天上的谷子很酸天、谷、酸性、都是氨酸）l 酪氨酸苯環(huán)上有羥基；絲氨酸和蘇氨酸有羥基；半胱氨酸有巰基可成對(duì)形成二硫鍵；組氨酸是唯一一個(gè)具接近的pKa值電離側(cè)鏈的氨基酸，常作為質(zhì)子供體和受體；天冬氨酸和谷氨酸都有兩個(gè)羧基。l 含芳香族R基的氨基酸能強(qiáng)烈吸收紫外光，使許多蛋白質(zhì)在280nm處有特征性強(qiáng)烈吸收。1.3 化學(xué)屬性滴定曲線（titration curve

4、s）l 氨基酸是兩性物質(zhì)。脫氫時(shí)先脫羧基再脫氨基。對(duì)于含單一-羧基、-氨基和不離子化的氨基酸而言，羧基脫氫后氨基脫氫前為等電點(diǎn)（isoelectric point）。pI（pK1pK2）/2l 只有組氨酸的R基（pKa6.0）在中性pH下提供顯著緩沖能力。l 所有非末端殘基的-羧基、-氨基共價(jià)形成了肽鍵，不發(fā)生離子化，對(duì)于多肽總的酸堿行為無(wú)貢獻(xiàn)。特征反應(yīng)l 茚三酮能使氨基酸顯藍(lán)色（脯氨酸顯黃色）1.4分離l 可用離子交換層析2 肽與蛋白質(zhì)2.1氨基酸鏈l 脫水縮合反應(yīng)（condensation reaction）的自由能差為5kcal/mol，但無(wú)法自發(fā)進(jìn)行。在標(biāo)準(zhǔn)生化條件下，平衡有利于向反應(yīng)

5、物移動(dòng)。為使反應(yīng)在熱力學(xué)上更為有利，羧基必須被化學(xué)修飾或活化，使羥基更易離去。l 肽鍵極穩(wěn)定（雖水解時(shí)放能，但活化能高），在無(wú)催化劑存在的水溶液中可維持1000年，在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下半衰期為7年。l 一般認(rèn)為，少于50個(gè)氨基酸縮合成肽稱寡肽，50100個(gè)的稱多肽（或相對(duì)分子質(zhì)量低于10000）l 20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的平均分子質(zhì)量為138，但在蛋白質(zhì)中，小分子量氨基酸在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，平均下來(lái)為128，脫水縮合時(shí)再脫去一分子水的18，剩下110。l 縮合時(shí)是從N-端開(kāi)始的，因此在書(shū)寫(xiě)時(shí)習(xí)慣將N-端放在左邊。l 短肽可構(gòu)成神經(jīng)遞質(zhì)、激素、抗生素等。2.2輔基l 有些蛋白質(zhì)除了氨基酸之外還含有其它永久

6、連接的基團(tuán)（輔基，可以不止有一個(gè)），這樣的蛋白稱結(jié)合蛋白。輔基可以是脂類、糖類、金屬等。l 脫去輔基的蛋白稱apoprotein（脫輔基蛋白）2.3物種間的蛋白同源性l 在不同物種中，氨基酸序列的一些特定位置總被相同的殘基占據(jù)，這些殘基稱不變殘基。而另外一些位置則表現(xiàn)出可變性，這些殘基稱可變殘基。l 某些位置的替換大多發(fā)生在類似的殘基間，稱為保守替換。3蛋白質(zhì)的處理3.1分離和純化l 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性、分子量、帶電性、親和性（binding affinity）的不同，可分離、純化蛋白。柱層析就是利用這個(gè)原理來(lái)做的。高效液相層析（HPLC）利用高壓泵加速蛋白質(zhì)分子沿著柱子向下運(yùn)動(dòng)，通過(guò)減少過(guò)柱

7、時(shí)間，可限制蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，提高分辨率。l 分離純化的一般步驟：組織勻漿（homogenization）過(guò)濾（filtration）粗提?。╟rude extract）鹽析（salting out）離心（centrifugation）透析（dialysis）柱層析（column chromatography）l 鹽析常用硫酸銨，因其具有高度水溶性?？捎猛肝龇ㄈコ蛩徜@。l 分離純化時(shí)，一般先選擇廉價(jià)、簡(jiǎn)單的程序再選擇昂貴、復(fù)雜的程序。l 離子交換層析（ion-exchange chromatography）：利用一定pH下不同蛋白質(zhì)帶電的種類和電量存在差異，與柱介質(zhì)上的離子結(jié)合力不同來(lái)做的。

8、柱有陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂兩種。l 大小排阻層析（size-exclusion chromatography）：又稱凝膠過(guò)濾（gel-filtration），柱介質(zhì)有選擇孔徑的聚合物。大的蛋白質(zhì)比小的蛋白質(zhì)走得快（因小蛋白可以鉆小孔，路徑曲折）。l 親和層析（affinity chromatography）：通過(guò)結(jié)合特異性來(lái)分離蛋白質(zhì)。柱介質(zhì)上含有配體能特異性結(jié)合某些蛋白。l 疏水相互作用層析（hydrophobic interaction chromatography）：根據(jù)不同蛋白質(zhì)的疏水性的強(qiáng)弱來(lái)做的。溶液中高離子強(qiáng)度可增強(qiáng)蛋白質(zhì)與疏水性柱介質(zhì)之間的疏水作用，線性或階段降低離子強(qiáng)度可選擇性地

9、將樣品解吸。3.2電泳（electrophoresis）l 蛋白質(zhì)電泳普遍在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。大體上按照蛋白質(zhì)的荷質(zhì)比來(lái)移動(dòng)，蛋白質(zhì)的形狀對(duì)移動(dòng)也有影響。l 十二烷基磺酸鈉電泳（SDS-PAGE）常用來(lái)估測(cè)蛋白質(zhì)的純度和分子量。SDS結(jié)合蛋白質(zhì)的量基本與分子量成正比，結(jié)合的SDS提供大量負(fù)電荷使蛋白本身的電荷不明顯，使荷質(zhì)比相同，同時(shí)也改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象呈相同的形狀，于是移動(dòng)性完全由質(zhì)量來(lái)決定（小蛋白比較快）。電泳后再用考馬斯亮藍(lán)（與蛋白結(jié)合而不與膠結(jié)合）染色。若蛋白含有亞基，則會(huì)被分開(kāi)形成各個(gè)亞基的條帶。l 等點(diǎn)聚焦電泳（IEF）用來(lái)確定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。通過(guò)低分子量的有機(jī)酸堿混合物在外加電

10、場(chǎng)的凝膠中分布形成一個(gè)pH梯度。于是蛋白質(zhì)會(huì)移動(dòng)到與pI相等的pH處停下。l 雙向電泳結(jié)合等點(diǎn)聚焦和SDS電泳，能提高分辨率?？煞蛛x相同分子量而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)，或相同等電點(diǎn)而分子量不同的蛋白質(zhì)。l 電泳一般不用于純化大量蛋白質(zhì)，因電泳對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不利。3.3測(cè)序（sequencing）l 測(cè)序的一般步驟：分析氨基酸組分打開(kāi)二硫鍵（disulfide bond）切割長(zhǎng)肽為短肽短肽測(cè)序短肽排序定位二硫鍵。l 分析氨基酸組分：將肽鏈徹底水解（6mol/L HCl，110，24h），后用離子交換層析（或HPLC）分離，后根據(jù)吸收峰來(lái)確定組分和含量。l 打開(kāi)二硫鍵：可用過(guò)甲酸來(lái)氧化斷鍵，或用二硫蘇糖醇還原斷鍵再用碘乙酸來(lái)乙酰化防止再度形成二硫鍵。l 肽鏈切割：用溴化氰或蛋白酶來(lái)切割。胰蛋白酶切Lys，Arg（C）；胰凝乳蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（C）；胃蛋白酶切Phe，Trp，Tyr（N）；溴化氰切Met（C）。l 短肽測(cè)序：Edman法。l 短肽排序：比較多套片斷，推理得出原來(lái)