胰蛋白酶活性測定

1、實驗一胰蛋白酶活性測定實驗?zāi)康模赫莆諟y定胰蛋白酶濃度、活性、比活的原理與方法.實驗原理：胰蛋白酶相對分子量23.7KD,主要水解肽鏈中堿性氨基酸與其它氨基酸相連接的肽鍵,此外還能水解堿性氨基酸形成的酯鍵,如把人工合成的N-苯甲酰-L-精經(jīng)酸乙酯(N-benzuyl-L-argineethylester,BAEE)水解為H-苯甲酰L精氨酸(BA).H-5NHi2)34-Noc2HH-HKH=Nd巾胰蛋白酶,Ca2+-pH8.0BAEE黑帕fi&BA+C2HqH乙醇胰蛋白酶所催化的上述反響中,產(chǎn)物BA對253nm的光吸收遠(yuǎn)大于BAEE,因此可以在實驗起始點把253nm的消光值調(diào)為零,然后記錄反響體

2、系對253nm的消光值的增量,并把這個增量作為測定胰蛋白酶的活性指標(biāo).醒活單位定義：在底物BAEE濃度Immol/L,光程1cm,波長253nm,溫度25叱,測量體積3mL.條件下吸光值每分鐘遞增0.001(AA/min=0.001)為1個BAEE酶活單位.胰蛋白酶制劑中蛋白質(zhì)濃度含義：胰蛋白的含量一般E陛表達(dá).這個值的含義是：濃度為1%酶蛋白,在1cm光徑下,對紫外280nm的消光值.不同廠家、不同產(chǎn)品的Ei%值有很大差異.E1%值越高,說明酶制劑中酶蛋白含量越高O由于酶制劑中蛋白質(zhì)含量各不相同,所以用酶制劑配制EK的蛋白質(zhì)溶液時,根據(jù)廠家對產(chǎn)品的的測定值配制溶液.在本實驗中,胰蛋白酶酶蛋白

3、樣品采用SIGMA公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,生產(chǎn)公司對展品的描述是對280nm紫外吸收值15.3,配制胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液可根據(jù)廠家的這個說明.器材以試劑：器材,電子天平,紫外分光光度計,微量加樣器.試劑：標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶,N-苯甲酰-L-精然酸乙酯,HCI.Tris.1.胰蛋白酶活性測定：1)配制Ei%的胰蛋白酶溶液每組取E,=15.3的胰蛋白酶樣品10mg放到1ml去離子水中,充分溶解后,放入冰中保存.2根據(jù)表1的要求配制試驗體系所需其它各種溶液.3根據(jù)表1的順序進(jìn)行測定標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的活性.表1腴蛋白酶活性測定加樣順序試劑步驟1：空白調(diào)零步驟2：樣品測定0.1mol/LTris-HCl緩沖液,pH8.0,2

4、.0mmol/LBAEE1.5mL1.5mL1.5mL1.5mL25預(yù)熱5min25預(yù)熱5min胰蛋白酶：10mg/niL蒸馀水0gL10gL10rL0|1L充分搖勻充分搖勻步驟1：AA253nm/min步驟2：AA253.nm/min調(diào)0記錄在步驟2樣品測定中,參加酶液后立即蓋上蓋迅速混勻計時,每半分鐘讀數(shù)一次,共讀34min.測得的結(jié)果要使4人253面/1限制在0.050.100之間為宜,假設(shè)偏離此范圍那么要適當(dāng)增減酶量52-20HL之間,空白試驗相應(yīng)增減等體積水后重新測定,一直到“253師/01皿值落在0.050.100之間為止.3分別求算:1標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶溶液濃度10mg/mL的酶活和比

5、活:計算方法：i胰蛋白語活性單位數(shù)計算:胰蛋白酶活力單位BAEE電位/,nL=0.001x酶液參加體積成x稀釋倍數(shù)ii胰蛋白酶比活計算:用BAEE單位數(shù)/mg胰蛋白酶表示比活胰蛋白前比活水加皮單位臉=射液活力反!左單位也酶液蛋白含量mg冠x甑液參加體積位稀釋倍數(shù)實驗二胰蛋白酶動力學(xué)測定實驗?zāi)康模撼醪秸莆找韵聨讉€酶動力學(xué)參數(shù)測定與求算方法：米氏常數(shù)Km,最大反響速度Vmax,轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat,特異性常數(shù)Kcat./Km.實驗原理：胰蛋白酶遵守米氏方程,可以通過測定底物濃度與反響速度間的關(guān)系測定與求算這個酶的諸動力學(xué)參數(shù).胰蛋白酶可以水解堿性氨基酸的按基所生成的肽鍵、酰胺建和酯鍵.在本實驗中,利用胰

6、蛋白酶水解酰胺鍵活性的性質(zhì),以苯甲酰-L-精氨酰-對硝基苯胺(BAPA)作底物測定這個酶的動力學(xué)參數(shù),反響式如下：反響最適pH8.1,最適溫度25o反響產(chǎn)物之一：對硝基苯胺(p-Nitroaniline,4-NA)呈黃色,對405nm波長光的摩爾吸光系數(shù)為9870,但底物BAPA和另一個產(chǎn)物BA對405nm波長的光根本不吸收,因此本實驗測定光波的波長設(shè)在405nm上,把起始反響的吸光值調(diào)為0,記錄消光值的變化.L-BAPA最大濃度低于5xlOmol/L時這個酶促反響符合米氏方程,可用Hanes作圖法求動力學(xué)參數(shù),Hanes作圖法是單倒數(shù)作圖法,把米氏方程變形為：在實驗中設(shè)定一系列底物濃度SJ,

7、測定每一個底物濃度條件下的反響速度Vi.然后用Si/Vi對作圖,可以得到一條線段,線段在y軸的截距是Km/Vmax,線段的延長線在X軸的截距是-Km,據(jù)此可以得到Km和Vmax值：Kcat=Vmax/E(oEJ是酶的初始濃度,己在實驗設(shè)定為己知,因此Kcat可以得出；特異性常數(shù)Km/Kcat可根據(jù)上述數(shù)計算出來.器材與試劑：器材：756紫外-可見分光光度計,恒溫水浴鍋,分析天平,秒表,容量瓶,移液器.試劑：1. O.lmol/LpH8.1的TrisHCI緩沖液0.4%CaCl2：取O.2mol/LTrisMr=121.14100mL與0.2mol/LHCI52.4mL混勻,參加0.8gCaCb

8、,蒸儲水定容至U200mLpH值需用計pH校正.2. Immol/LDL-BAPAMr=434.9水溶液：稱取4349mgBAPA,蒸播水溶解并加熱到800C以上,完全溶解后置冰水中冷卻,定容到100mL.這個濃度為lmmol/L的DL-BAPA溶液命名為第六組母液,根據(jù)逐步稀釋原那么配制以下溶液濃度系列：0.8mmoI/L第五組母液,25mL：0.6mmol/L25mL,第四組母液；0.4mmol/L25mL.第三組母液:0.2mmol/L10mL,第二組母液:0.1mmol/L10mL,第一組母液.3. 60%V/V乙酸溶液4. 胰蛋白酶溶液,該酶的比活1.0x104BAEE單位/mg蛋白

9、實驗步驟：1 .計算胰蛋白酶加樣體枳：在本實驗中參加胰蛋白酶的量是601咯,實驗1已經(jīng)測到胰蛋白酶的比活和濃度吃/pL,根據(jù)這些值計算參加體系的酶液體積的數(shù).2 .實驗溶液系統(tǒng)：本實驗有6組實驗組成.實驗順序根據(jù)表2的加樣程序執(zhí)行.表2.測定Km和Vmax值加樣表組BAPA母液濃度(mmol/L)參加BAPA母液mL參加Tris-HCI(mL)參加胰蛋白的gL參加60%乙皎mL反響體系底物BAPA濃度L*S1)=AA儂nm9870x1060x2表2列出的是6個實驗,鑒于目前實驗室尚沒有12個槍頭的加樣,所以每一個實驗都可獨立進(jìn)行.需要特別注意：1比活大于1.0xlHBAEEu/mgprotei

10、n的胰蛋白酶制劑,純度范圍是90%100%,一般可達(dá)到95%97%在計算動力學(xué)參數(shù)時,如無特殊精確要求,可根據(jù)胰蛋白酶100%的近似值計算.在本試驗中,可根據(jù)濃度胰蛋白酶濃度10ing/ml,純度100%,每個試管要求參加質(zhì)量數(shù)60圈,計算出每個試管參加的胰蛋白酶溶液微升數(shù).2在進(jìn)行動力學(xué)參數(shù)計算時,要進(jìn)行胰蛋白酶質(zhì)量-摩爾數(shù)轉(zhuǎn)換,如無特殊要求,也可以把腴蛋白酸純度近似為100%.3如果有求精確,但產(chǎn)品說明沒有給出胰蛋白酶在固形物中的百分含量,就需配制一定濃度的固形物溶液,首先測定蛋白質(zhì)濃度,通過求算蛋白質(zhì)總量,得到蛋白質(zhì)在酶制劑中的重量比.然后通過雙向電泳,圖像掃描,把掃描結(jié)果輸入計算軟件,根據(jù)軟件步驟,求算胰蛋白酶在全部蛋白樣品中的百分比.把實驗設(shè)定的每一個Si和測定到的對應(yīng)的Vi換算成Si/Vi后,填入表3,作圖求Km,Vmax表3.Hanes作圖的數(shù)據(jù)Si/V|：SJ/W0枚3S/MSs/Vs島勺6倒：庖四島0一用S/v對S作圖可得到一條線段,線段與軸的截距是Km/Vmax,線段延長線與x軸的截