BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)

1、BIFCBimolecular Fluorescence ComplementationAlba Espargar ColomProtein Fragment ComplementationoTamb anomenats: Interaction trapping.oPermeten observar interacci entre protenes in vivo.oClasses:oUbiquitinaoDihidrofolat reductasao-galactosidasaoGFP (green fluorescent protein)oDetection of transient p

2、rotein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation:The Abl-SH3 caseM. Morell et al. Proteomics 2007,7,1023-1036 Estudiar en detall la habilitat del mtode BIFC per detectar interaccions transitries.The Abl-SH3 case Domini SH3:Domini implicat en la regulaci negativa de lactivitat

3、quinasa mitjanant interaccions transitries entre protenes. oC-Abl tyrosine kinase: regula diferenciaci cellular i apoptosi, sent responsable de molts senyals extracellulars (factors de creixement, adhesi cellular i citoquines) i intracellulars (dany DNA, estrs oxidatiu)Interaccions estudiadesoDomini

4、 SH3 interacciona amb polipptids rics en prolina, seguint el motiu PXXP:oBRCA1: cncer de mama tipus 1oPRDX1: peroxiredoxinaop41: pptid ric en prolina + mutantsoWT (Tyr4)oTyr4ArgoTyr4PheoTyr4TrpoTyr4GlyBimolecular Fluorescent ComplementationoC-Abl-SH3: fusionada a lextrem C-terminal (156-238) amb un

5、linker de seqncia SGGGSGGS i clonada en pBAT-4 (ampR)oPptid p41: fusionat a lextrem N-terminal (1-155) amb un linker de seqncia SGGGS i clonat en pET28-a(+) (kanR)Transformaci de cllules competents dEscherichia coli BL21(D3)Esquema basat en les estructures obtingudes per X-ray Experiments amb p41oCl

6、lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP o p-p41-NYFP individualment.Fragments individuals de YFP no sn funcionalsoCllules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-p41-NYFP La majoria de les cllules tenen fluorescncia.oCllules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-NYFPNecessitat de dues protenes per la rec

7、onstituci de YFPoAnlisi de lespectre demissi de fluorescncia on sobserva el pic a 523 nm, lespectre caracterstic de la YFP nativaEstructura de Abl-SH3 interaccionant amb P41oPro54 i Trp36 sn dos residus molt ben conservats en el domini SH3, situats en el centre hidrofbic. oJuga un paper molt importa

8、nt en la interacci amb els pptids rics en prolina.oPro54Leu redueix significativament la uni del domini Abl-SH3 amb els lligandsContrast de fases (esquerra) i fluorescncia (dreta)Western blot:(1)c-Abl-SH3-CYFP(2)C-Abl-SH3-P45L-NYFPMutants de p41oConstrucci de 5 mutants de p41 en la posici 4 (importa

9、nt per la interacci amb Abl-SH3)oTrp4, Phe4, Tyr4, Arg4 i Gly4oEs va transformar amb una barreja dels 5 a igual concentraci juntament amb c-Abl-SH3-CYFP Western BlotTyrArgPheGlyTrpEstabilitat de la reconstituci de la YFPUna vegada YFP est reconstituda s molt estableSeguiment de les interaccions mitj

10、anant citmetre de fluxo1: control negatiu Abl-SH3-CYFPo2: control positiu YFPo3: Abl-SH3-CYFP + NYFPo4: Abl-SH3-CYFP + p41-NYFPo5: Abl-SH3-CYFP + p41-Gly4-NYFPoRelaci en % de Abl-SH3-CYFP+p41-NYFP / Abl-SH3-CYFP+p41-Gly4-NYFPoNegre: 20/80oGris fosc: 10/90oGris clar: 5/95oMitjanant el citmetre de flu

11、x podem observar la presncia de bons lligands encara que es trobin a una concentraci molt baixa.oCitmetre de flux s molt rpid, altament sensible per tant una bona tcnica per avaluar les interaccions transitries mitjanant BIFC.ConclusionsoBIFC: mtode de visualitzaci directe dinteraccions febles entre

12、 protenes intracellulars. Bon mtode per detectar interaccions fortes per tamb febles.oNo necessita cap assaig enzimtic per detectar la seva activitat.oLassaig s suficientment sensible per detectar interaccions entre protenes que estan poc expressades en bactria.oUna vegada els dos fragments de YFP e

13、stan units sn molt estables, aix pot ser la ra de lelevada sensibilitat, ja que el complex pot emetre fluorescncia durant molt temps (setmanes)ConclusionsoLes diferncies de fluorescncia observades entre els diferents mutants de p41 determina que s un mtode capa de diferenciar lligands dalta i baixa afinitat.oLa combinaci de BIFC amb el citmetre de flu