無菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、 文件名：無菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作程序編號：SOP-QC-1101-A3起草人：審核人：批準(zhǔn)人：起草日期：審核日期：批準(zhǔn)日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量管理部發(fā)布日期：實施日期：分發(fā)范圍：QC1 目的建立一個無菌檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作程序，保證實驗的準(zhǔn)確性、可靠性。2 范圍適用于原料、輔料及成品的無菌檢查。3 職責(zé)微生物檢驗員遵照執(zhí)行。4 內(nèi)容 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原 料 、輔料及其他品種是否無菌的一種方法 。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌檢查應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，試驗環(huán)境必須達(dá)到無菌檢查的要求，檢驗全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生

2、物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（ 區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。4.1 培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌的培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。4.1.1 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可按以下處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或成品培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225°C、避

3、光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一 般 在 3 周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。4.1.1.1 硫乙酵酸鹽流體培養(yǎng)基胰酪胨 15. 0g 氯化鈉 2. 5g酵母浸出粉 5. 0g 新 配 制 的 0. 1 % 刃 天無水葡萄糖 5.0g 青 溶 液 1.0mlL-胱氨酸 0. 5g 瓊 脂 0. 75g硫乙醇酸鈉 0.5g 水 1000ml(或硫乙醇酸） （ 0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合 ，微溫溶解 ，調(diào)節(jié) p H 為弱堿性，煮沸 ，濾清 ，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)p H , 使 滅 菌 后 在 25的 p H 值為7.1 土0.2。分裝至適宜

4、的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（ 粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則 ，須經(jīng) 100°C水浴加熱至粉紅色消失（不釋過2 0分鐘） ，迅速冷卻 只限加熱 一次，并防止被污染。除另有規(guī)定外 ，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 30 35C培養(yǎng)。4.1.1.2 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪胨 1 7 . 0g 氯化鈉 5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物 3. 0g 磷酸氫二鉀 2. 5g葡萄糖/無水葡萄糖 2. 5g/2. 3g 水 1000m l除葡萄糖外，取上述成分，混合 ，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié) p H

5、 使滅菌后在2 5 的 p H 值 為 7. 3±0. 2，加入葡萄糖，分裝 ，滅菌 。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置202 5 培養(yǎng)。4.1.1.3 中和或滅活用培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。4.1.1.4 0.5% 葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）胨 1 0 . 0g 氯化鈉 5 . 0g牛肉浸出粉 3 . 0g 水 1000m l葡萄糖 5. 0g除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào) 節(jié) p H 為弱堿性，煮沸 ，加入葡萄糖溶解后，搖勻 ，濾清

6、 ，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在 25的p H 值 為 7. 2士0.2，分裝，滅菌。4.1.1.5 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨 15.0g 瓊脂 1 5 . 0g大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g 水 1000m l氯化鈉 5.0g除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) p H 使滅菌后在 25的p H 值為7.3士0.2，加入瓊脂 ，加熱溶化后 ，搖勻 ，分裝，滅菌。4.1.1.6 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物 水 1000m l和胰酪胨等量混合物 10. 0g葡萄糖 20.0g除葡萄糖外，取上述成分，混合 ，微溫溶解，調(diào)節(jié) p H使滅菌后在25的 p H 值為5. 6 士 0.2，加

7、入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌 。4.1.1.7 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基動物組織胃蛋白酶水解物 瓊脂 15.0g和胰酪胨等量混合物 1 0 . 0g 水 1000m l葡萄糖 40.0g除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) p H 使滅菌后在25°C的 p H 值 為 5. 6士0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻 ，分裝，滅菌。4.1.2 培養(yǎng)基的適用性檢查無 菌 檢 查 用 的 硫 乙 醉 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 和 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 等 應(yīng) 符 合 培 養(yǎng) 基 的 無 菌 性 檢 查 及 靈 敏 度 檢 查 的 要 求 。 本 檢

8、查 可 在 供 試 品 的 無 菌 檢 查 前 或 與 供 試 品 的 無 菌 檢 查同 時 進(jìn) 行 。4.1.3 無 菌 性 檢 查 每 批 培 養(yǎng) 基 隨 機 取 不 少 于 5 支 (瓶 ） ，置 各 培 養(yǎng) 基 規(guī) 定 的 溫 度 培 養(yǎng) 14天 ，應(yīng) 無 菌 生 長 。4.1.4 靈敏度檢查4.1.4.1 菌 種 培 養(yǎng) 基 靈 敏 度 檢 查 所 用 的 菌 株 傳 代 次 數(shù) 不 得 超 過 5代 (從 菌 種 保 存 中 心 獲 得 的 干 燥 菌 種 為 第 0 代 ） ，并 采用 適 宜 的 菌 種 保 藏 技 術(shù) 進(jìn) 行 保 存 ，以 保 證試 驗菌 株 的 生 物 學(xué)

9、特 性 。金 黃 色 葡 萄 球 菌 （ Staphylococcus aureus ) C M C C ( B)26 003銅 綠 假 單 胞 菌 （ Pseudomonas aeruginosa ) C M C C ( B)10 104枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis） CMCC(B)63 501生孢 梭 菌 (Clostridium sporogenes) CMCC(B)64 941白 色 念 珠 菌 (Candida albicans) CMCC(F)98 001黑 曲 霉 (Aspergillus niger) CMCC(F) 98 0034.1.4.2

10、菌 液 制 備 接 種 金 黃 色 葡 萄 球 菌 、 銅 綠 假 單 胞 菌 、 枯 草 芽 孢 桿 菌 的 新 鮮 培 養(yǎng) 物 至 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 中 或 胰 酪 大 豆 胨 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 上 ，接 種 生 孢 梭 菌 的 新 鮮 培 養(yǎng) 物 至 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 中 ，30 35°C培 養(yǎng) 18 24小 時 ； 接 種 白 色 念 珠 菌 的 新 鮮 培 養(yǎng) 物 至 沙 氏 葡 萄 糖 液 體 培 養(yǎng) 基 中 或 沙 氏 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 上 ，20 25° C培 養(yǎng) 24 48小 時 ，上 述 培 養(yǎng)

11、 物 用 PH7. 0 無 菌 氣 化 鈉 -蛋 白 胨 緩 沖 液 或 0. 9%無 菌 氯 化 鈉 溶 液 制 成 每 lm l含 菌 數(shù) 小 于 l00cfu(菌 落 形 成 單 位 ） 的 菌 懸 液 。 接 種 黑 曲 霉 的 新 鮮 培 養(yǎng) 物 至 沙 氏 葡 萄 糖 瓊 脂 斜 面 培 養(yǎng) 基 上 ，20 25培 養(yǎng) 5 7 天 ，加 入 3 5m l含 0. 05% (m l/m l) 聚 山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 無 菌 氯 化 鈉 -蛋 白 胨 緩 沖 液 或 0. 9 % 無 菌 氯 化 鈉 溶 液 ，將 孢 子 洗 脫 。 然 后 ，采用 適 宜 的 方 法

12、 吸 出 孢 子 懸 液 至 無 菌 試 管 內(nèi) ，用 含 0.05% (m l/m l)聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 無 菌 氯 化 鈉 -蛋 白 胨 緩 沖 液 或 0. 9 % 無 菌 氯 化 鈉 溶 液 制 成 每 lm l含 孢 子 數(shù) 小 于 l00cfu的 孢 子 懸 液 。菌 懸 液 若 在 室 溫 下 放 置 ，應(yīng) 在 2 小 時 內(nèi) 使 用 ； 若 保 存 在 2 8° C可 在 24小 時 內(nèi) 使 用 。 黑 曲 霉 孢 子 懸 液 可 保 存 在 28，在 驗 證 過 的 貯 存 期 內(nèi) 使 用 。4.1.4.3 培 養(yǎng) 基 接 種 取 每 管 裝

13、 量 為 12ml的 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 7 支 ，分 別 接 種 小 于 l00cfu 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 、 銅 綠 假 單 胞 菌 、 生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 種 作 為 空 白 對 照 ，培 養(yǎng) 3 天 ； 取 每 管 裝 量 為 9ml的 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 7 支 ，分 別 接 種 小 于 l00cfu的 枯 草 芽 孢 桿 菌 、 白 色 念 珠 菌 、 黑 曲 霉 各 2 支 ，另 1支 不 接 種 作 為 空 白 對 照 ，培 養(yǎng) 5 天 。 逐 日 觀 察 結(jié) 果 。4.1.4.4 結(jié) 果 判 定

14、 空 白 對 照 管 應(yīng) 無 菌 生 長 ，若 加 菌 的 培 養(yǎng) 基 管均 生 長 良 好 ，判 該 培 養(yǎng) 基 的 靈 敏 度 檢 查 符 合 規(guī) 定 。4.2 稀釋液、沖洗液及其制備方法稀 釋 液 、 沖 洗 液 配 制 后 應(yīng) 采 用 驗 證 合 格 的 滅 菌 程 序 滅 菌 。4.2.1 0.1 % 無 菌 蛋 白 胨 水 溶 液 取 蛋 白 胨 l.0 g，加 水 1000m l,微 溫 溶 解 ，濾 清 ，調(diào) 節(jié) p H 值 至 7.1 士 0.2，分 裝 ，滅 菌 。 4.2.2 pH 7.0無 菌 氯 化 鈉 - 蛋 白 胨 緩 沖 液 取 磷 酸 二 氫 鉀3.56g，無

15、 水 磷 酸 氫 二 鈉 5 .77 g ,氯 化 鈉 4. 30g, 蛋 白 胨l.00g，加 水 1000m l,微 溫 溶 解 ，濾 清 ，分 裝 ，滅 菌 。根 據(jù) 供 試 品 的 特 性 ，可 選 用 其 他 經(jīng) 驗 證過 的 適 宜 的 溶 液 作 為 稀 釋 液 、 沖 洗 液 (如 0.9% 無 菌氯化 鈉 溶 液 ） 。如 需 要 ，可 在 上 述 稀 釋 液 或 沖 洗 液 的 滅 菌 前 或 滅 菌 后 加 入 表 面 活 性 劑 或 中 和 劑 等 。4.3 方法適用性試驗進(jìn) 行 產(chǎn) 品 無 菌 檢 查 時 ，應(yīng) 進(jìn) 行 方 法 適 用 性 試 驗，以 確 認(rèn) 所 采用

16、 的 方 法 適 合 于 該 產(chǎn) 品 的 無 菌 檢 查 。 若 檢 驗 程 序 或 產(chǎn) 品 發(fā) 生 變 化 可 能 影 響 檢 驗 結(jié) 果 時 ，應(yīng) 重 新 進(jìn) 行 方 法 適 用 性 試 驗。方 法 適 用 性 試 驗 按 “供 試 品 的 無 菌 檢 查 ” 的 規(guī) 定 及 下 列 要 求 進(jìn) 行 操 作 。 對 每 一 試 驗 菌 應(yīng) 逐 一 進(jìn) 行 方 法 確 認(rèn) 。4.3.1 菌 種 及 菌 液 制 備 除 大 腸 埃 希 菌 （ Escherichia coli ) CMCC(B)44 102 外 ，金 黃 色 葡 萄 球 菌 、枯 草 芽 孢 桿 菌 、生 孢 梭 菌 、 白

17、色 念 珠 菌 、 黑 曲 霉 的 菌 株 及 菌 液 制 備 同 培 養(yǎng) 基 靈 敏 度 檢 查 。 大 腸 埃 希 菌 的 菌 液 制 備 同 金 黃 色 葡 萄 球 菌 。4.3.2 薄 膜 過 濾 法 取 每 種 培 養(yǎng) 基 規(guī) 定 接 種 的 供 試 品 總 量 按 薄 膜 過 濾 法 過 濾 ，沖 洗 ，在 最 后 一 次 的 沖 洗 液 中 加 入 小 于 l00cfu的 試 驗 菌 ，過 濾 。 加 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 或 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 至 濾 筒 內(nèi) 。 另 取 一 裝 有 同 體 積 培 養(yǎng) 基 的 容 器 ，加 入 等 量 試

18、 驗 菌 ，作 為 對 照 。 置 規(guī) 定 溫 度 培 養(yǎng) ，培 養(yǎng) 時 間 不 得 超 過 5 天 ，各 試 驗 菌 同 法 操 作 。4.3.3 直 接 接 種 法 取 符 合 直 接 接 種 法 培 養(yǎng) 基 用 量 要 求 的 硫 乙 酵 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 6 管 ，分 別 接 入 小 于 l00cfu的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 、 大 腸 埃 希 菌 、 生 孢 梭 菌 各 2 管 ，取 符 合 直 接 接 種 法 培 養(yǎng) 基 用 量 要 求 的 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 6 管 ，分 別 接 入 小于 l00cfu的 枯 草 芽 孢 桿 菌 、 白 色 念

19、 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 管 。其 中 1 管 接 人 每 支 培 養(yǎng) 基 規(guī) 定 的 供 試 品 接 種 量 ，另 1 管 作 為 對 照 ，置 規(guī) 定 的 溫 度 培 養(yǎng) ，培 養(yǎng) 時 間 不 得 超 過 5 天 。4.3.4 結(jié) 果 判 斷 與 對 照 管 比 較 ，如 含 供 試 品 各 容 器 中 的 試 驗 菌 均 生 長 良 好 ，則 說 明 供 試 品 的 該 檢 驗 量 在 該 檢 驗 條 件 下 無 抑 菌 作 用 或 其 抑 菌 作 用 可 以 忽 略 不 計 ，照 此 檢 查 方 法 和 檢 查 條 件 進(jìn) 行 供 試 品 的 無 菌 檢 查 。 如 含 供 試

20、品 的 任 一 容 器 中 的 試 驗 菌 生 長 微 弱 、 緩 慢 或 不 生 長 ，則 說 明 供 試 品 的 該 檢 驗 量 在 該 檢 驗條 件 下 有 抑 菌 作 用 ，應(yīng) 采用 增 加 沖 洗 量 、 增 加 培 養(yǎng) 基 的 用 量 、 使 用 中 和 劑 或 滅 活 劑 、 更 換 濾 膜 品 種 等 方 法 ，消 除 供 試 品 的 抑 菌 作 用 ，并 重 新 進(jìn) 行 方 法 適 用 性 試 驗。方 法 適 用 性 試 驗 也 可 與 供 試 品 的 無 菌 檢 查 同 時 進(jìn) 行 。4.4 供試品的無菌檢查無 菌 檢 查 法 包 括 薄 膜 過 濾 法 和 直 接 接 種

21、 法 。 只 要 供 試 品 性 質(zhì) 允 許 ，應(yīng) 采用 薄 膜 過 濾 法 。 供 試 品 無 菌 檢 查 所 采用 的 檢 查 方 法 和 檢 驗條 件 應(yīng) 與 方 法 適 用 性 試 驗確 認(rèn) 的 方 法 相同 。無 菌 試 驗過 程 中 ，若 需 使 用 表 面 活 性 劑 、 滅 活 劑 、 中 和 劑 等 試 劑 ，應(yīng) 證明 其 有 效 性 ，且 對 微 生 物 無 毒 性 。4.4.1 檢 驗 數(shù) 量 檢 驗 數(shù) 量 是 指 一 次 試 驗所 用 供 試 品 最 小 包 裝 容 器 的 數(shù) 量 ，成 品 每 亞 批 均 應(yīng) 進(jìn) 行 無 菌 檢 查。 除 另 有 規(guī) 定 外 ，出

22、廠產(chǎn) 品 按 表 1 規(guī) 定 ； 上 市 產(chǎn) 品 監(jiān) 督 檢 驗按 表 2 規(guī) 定 。 表 1、表 2 中 最 少 檢 驗 數(shù) 量 不 包 括 陽 性 對 照 試 驗 的 供 試 品 用 量 。4.4.2 檢 驗 量 是 指 供 試 品 每 個 最 小 包 裝 接 種 至 每 份 培 養(yǎng) 基 的 最 小 量 （ g 或 m l)。 除 另 有 規(guī) 定 外 ，供 試 品 檢 驗 量 按 表 3 規(guī) 定 。 若 每 支 (瓶 )供 試 品 的 裝 量 按 規(guī) 定 足 夠 接 種 兩 種 培 養(yǎng) 基 ， 則 應(yīng) 分 別 接 種 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 和 胰 酪 大 豆 胨 液 體

23、培 養(yǎng) 基 。 采用 薄 膜 過 濾 法 時 ，只 要 供 試 品 特 性 允 許 ，應(yīng) 將 所 有 容 器 內(nèi) 的 全 部 內(nèi) 容 物 過 濾 。4.4.3 陽 性 對 照 應(yīng) 根 據(jù) 供 試 品 特 性 選 擇 陽 性 對 照 菌 ： 無 抑 菌 作 用 及 抗 革 蘭 陽 性 菌 為 主 的 供 試 品 ，以 金 黃 色 葡 萄 球 菌 為 對 照 菌 ； 抗 革 蘭 陰 性 菌 為 主 的 供 試 品 以 大 腸 埃 希 菌 為 對 照 菌 ； 抗 厭 氧 菌 的 供 試 品 ，以 生 孢 梭 菌 為 對 照 菌 ； 抗 真 菌 的 供 試 品 ，以 白 色 念 珠 菌 為 對 照 菌

24、 。 陽 性 對 照 試 驗 的 菌 液 制 備 同 方 法 適 用 性 試 驗，加 菌 量 小 于 l00cfu，供 試 品 用 量 同 供 試 品 無 菌 檢 查 時 每 份 培 養(yǎng) 基 接 種 的 樣 品 量 。 陽 性 對 照 管 培 養(yǎng) 72小 時 內(nèi) 應(yīng) 生 長 良 好 。4.4.4 陰 性 對 照 供 試 品 無 菌 檢 查 時 ，應(yīng) 取 相應(yīng) 溶 劑 和 稀 釋 液 、 沖 洗 液 同 法 操 作 ，作 為 陰 性 對 照 。 陰 性 對 照 不 得 有 菌 生 長 。4.4.5 供試品處理及接種培養(yǎng)基操 作 時 ，用 適 宜 的 消 毒 液 對 供 試 品 容 器 表 面 進(jìn)

25、 行 徹 底 消 毒 ，如 果 供 試 品 容 器 內(nèi) 有 一 定 的 真 空 度 ，可 用 適 宜 的 無 菌 器 材 (如 帶 有 除 菌 過 濾 器 的 針 頭 ） 向 容 器 內(nèi) 導(dǎo) 人 無 菌 空 氣 ，再 按 無 菌 操 作 啟 開 容 器 取 出 內(nèi) 容 物 。除 另 有 規(guī) 定 外 ，按 下 列 方 法 進(jìn) 行 供 試 品 處 理 及 接 種 培 養(yǎng) 基 。4.4.5.1 薄膜過濾法薄 膜 過 濾 法 一 般 應(yīng) 采用 封 閉 式 薄 膜 過 濾 器 。 無 菌 檢 查 用 的 濾 膜 孔 徑 應(yīng) 不 大 于 0.45m，直 徑 約 為 50mm。 根 據(jù) 供 試 品 及 其

26、溶 劑 的 特 性 選 擇 濾 膜 材 質(zhì) 。 使 用 時 ，應(yīng) 保 證 濾 膜 在 過 濾 前 后 的 完 整 性 。水 溶 性 供 試 液 過 濾 前 應(yīng) 先 將 少 量 的 沖 洗 液 過 濾 ，以 潤 濕 濾 膜 6 油 類 供 試 品 ，其 濾 膜 和 過 濾 器 在 使 用 前 應(yīng) 充 分 干 燥 。為 發(fā) 揮 濾 膜 的 最 大 過 濾 效 率 ，應(yīng) 注 意 保 持 供 試 品 溶 液 及 沖 洗 液 覆 蓋 整 個 濾 膜 表 面 。 供 試 液 經(jīng) 薄 膜 過 濾 后 ，若 需 要 用 沖 洗 液 沖 洗 濾 膜 ，每 張 濾 膜 每 次 沖 洗 量 一 般 為 100ml，

27、且 總 沖 洗 量 不 得 超 過 1000ml，以 避 免 濾 膜 上 的 微 生 物 受 損 傷 。4.4.5.1.1 水 溶 液 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，直 接 過 濾 ，或 混 合 至 含 不 少 于 100ml適 宜 稀 釋 液 的 無 菌 容 器 中 ，混 勻 ，立 即 過 濾 。 如 供 試 品 具 有 抑 菌 作 用 ，須 用 沖 洗 液 沖 洗 濾 膜 ，沖 洗 次 數(shù) 一 般 不 少 于 三 次 ，所 用 的 沖 洗 量 、 沖 洗 方 法 同 方 法 適 用 性 試 驗。 除 生 物 制 品 外 ，一 般 樣 品 沖 洗 后 ，1 份 濾 器 中 加 人 100ml

28、硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 ，1 份 濾 器 中 加 入 100ml胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 。 生 物 制 品 樣 品 沖 洗 后 ，2 份 濾 器 中 加 入 100ml硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 ，1 份 濾 器 中 加 人 100ml胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 。4.4.5.1.2 水 溶 性 固 體 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，加 適 宜 的 稀 釋 液 溶 解 或 按 標(biāo) 簽 說 明 復(fù) 溶 ，然后 照 水 溶 液 供 試 品 項 下 的 方 法 操 作 。4.4.5.1.3 非 水 溶 性 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，直 接

29、過 濾 ； 或 混 合 溶 于 適 量 含 聚 山 梨 酯 80或 其 他 適 宜 乳 化 劑 的 稀 釋 液 中 ，充 分 混 合 ，立 即 過 濾 。 用 含 0_1% 1%聚 山 梨 酯 8 0 的 沖 洗 液 沖 洗 濾 膜 至 少 3 次 。 加 人 含 或 不 含 聚 山 梨 酯 8 0 的 培 養(yǎng) 基 。 接 種 培 養(yǎng) 基 照 水 溶 液 供 試 品 項 下 的 方 法 操 作 。4.4.5.1.4 可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品 取規(guī)定 量 ，混 合 至 適 量 的 無 菌 十 四 烷 酸 異 丙 酯 中 ，劇 烈 振 搖 ，使 供 試 品 充 分 溶 解 ，如

30、果 需 要 可 適 當(dāng) 加 熱 ，但 溫 度 不 得 超 過4 4°C ,趁 熱 迅 速 過 濾 。 對 仍 然 無 法 過 濾 的 供 試 品 ，于 含 有 適 量 的 無 菌 十 四 烷 酸 異 丙 酯 中 的 供 試 液 中 加 人 不 少 于 100ml的 稀 釋 液 ，充 分 振 搖 萃 取 ，靜 置 ，取 下 層 水 相 作 為 供 試 液 過 濾 。 過 濾 后 濾 膜 沖 洗 及 接 種 培 養(yǎng) 基 照 非 水 溶 性 制 劑 供 試 品 項 下 的 方 法 操 作 。4.4.5.1.5 無 菌 氣（ 噴 ） 霧 劑 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，將 各 容 器 置

31、一 20° C 或 其 他 適 宜 溫 度 冷 凍 約 1 小 時 ，取 出 ，以 無 菌 操 作 迅 速在 容 器 上 端 鉆 一 小 孔 ，釋 放 拋 射 劑 后 再 無 菌 開 啟 容 器 ，并 將 供 試品 轉(zhuǎn) 移 至 無 菌 容 器 中 混 合 ，供 試 品 亦可 采用 其 他 適 宜 的 方 法 取 出 。 然 后 照 水 溶 液 或 非 水 溶 性 制 劑 供 試 品 項 下 的 方 法 操 作 。4.4.5.1.6 裝 有 藥 物 的 注 射 器 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，將 注 射 器 中 的 內(nèi) 容 物 （若 需 要 可 吸 人 稀 釋 液 或 標(biāo) 簽 所 示

32、 的 溶 劑 溶 解 ） 直 接 過 濾 ，或 混 合 至 含 適 宜 稀 釋 液 的 無 菌 容 器 中 ，然后 照 水 溶 液 或 非 水 溶 性 供 試 品 項 下 方 法 操 作 。 同 時 應(yīng) 采 用 適 宜 的 方 法 進(jìn) 行 包 裝 中 所 配 帶 的 無 菌 針 頭 的 無 菌 檢 查 。4.4.5.1.7 具 有 導(dǎo) 管 的 醫(yī) 療 器 具（輸 血、輸 液 袋 等） 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，每 個 最 小 包 裝 用 50 100ml沖 洗 液 分 別 沖 洗 內(nèi) 壁 ，收 集 沖 洗 液 于 無 菌 容 器 中 ，然 后 照 水 溶 液 供 試 品 項 下 方 法 操

33、 作 。同 時 應(yīng) 采用 直 接 接 種 法 進(jìn) 行 包 裝 中 所 配 帶 的 針 頭 的 無 菌 檢 查 。4.4.5.2 直接接種法直 接 接 種 法 適 用 于 無 法 用 薄 膜 過 濾 法 進(jìn) 行 無 菌 檢 查 的 供 試 品 ，即 取 規(guī) 定 量 供 試 品 分 別 等 量 接 種 至 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 和 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 中 。 除 生 物 制 品 外 ，一 般 樣 品 無 菌 檢 查 時 兩 種 培 養(yǎng) 基 接 種 的 瓶 或 支 數(shù) 相 等 ； 生 物 制 品 無 菌 檢 查 時 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 和 胰

34、 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 接 種 的 瓶 或 支 數(shù) 為 2 : 1 。 除 另 有 規(guī) 定 外 ，每 個 容 器 中 培 養(yǎng) 基 的 用 量 應(yīng) 符 合 接 種 的 供 試 品 體 積 不 得 大 于 培 養(yǎng) 基 體 積 的 10% ， 同 時 ，硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 每 管 裝 量 不 少 于 15ml，胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 每 管 裝 量 不 少 于 10ml。 供 試 品 檢 查 時 ， 培 養(yǎng) 基 的 用 量 和 高 度 同 方 法 適 用 性 試 驗。4.4.5.2.1 混 懸 液 等 非 澄 清 水 溶 液 供 試 品 取 規(guī) 定

35、量 ，等 量 接 種 至 各 管 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.2 固 體 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，直 接 等 量 接 種 至 各 管 培 養(yǎng) 基 中 。 或 加 入 適 宜 的 溶 劑 溶 解 ，或 按 標(biāo) 簽 說 明 復(fù) 溶 后 ，取 規(guī) 定 量 等 量 接 種 至 各 管 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.3 非 水 溶 性 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，混 合 ，加 入 適 量 的 聚 山 梨 酯 80或 其 他 適 宜 的 乳 化 劑 及 稀 釋 劑 使 其 乳 化 ，等 量 接 種 至 各 管 培 養(yǎng) 基 中 。 或 直 接 等 量 接 種 至 含 聚 山 梨 酯 80或

36、 其 他 適 宜 乳 化 劑 的 各 管 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.4 敷 料 供 試 品 取 規(guī) 定 數(shù) 量 ，以 無 菌 操 作 拆 開 每 個 包 裝 ，于 不 同 部 位 剪 取 約 l00mg或 lcm× 3cm的 供 試 品 ，等 量 接 種 于 各 管 足 以 浸 沒 供 試 品 的 適 量 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.5 腸 線、縫 合 線 等 供 試 品 腸 線 、 縫 合 線 及 其 他 一 次 性 使 用 的 醫(yī) 用 材 料 按 規(guī) 定 量 取 最 小 包 裝 ，無 菌 拆 開 包 裝 ，等 量 接 種 于 各 管 足 以 浸 沒 供 試 品 的

37、適 量 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.6 滅菌 醫(yī) 用 器 具 供 試 品 取 規(guī) 定 量 ，必 要 時 應(yīng) 將 其 拆 散 或 切 成 小 碎 段 ，等 量 接 種 于 各 管 足 以 浸 沒 供 試 品 的 適 量 培 養(yǎng) 基 中 。4.4.5.2.7 放 射 性 藥 品 取 供 試 品 1 瓶 （ 支 ） ，等 量 接 種 于 裝 量 為 7. 5ml的 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 和 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 中 。 每 管 接 種 量 為 0.2ml。4.4.5.2.8 培 養(yǎng) 及 觀 察 將 上 述 接 種 供 試 品 后 的 培 養(yǎng) 基 容 器 分

38、別 按 各 培 養(yǎng) 基 規(guī) 定 的 溫 度 培 養(yǎng) 14天 ； 接 種 生 物 制 品 供 試 品 的 硫 乙 醇 酸 鹽 流 體 培 養(yǎng) 基 的 容 器 應(yīng) 分 成 兩 等 份 ，一 份 置 30 35°C培 養(yǎng) ，一 份 置 20 25培 養(yǎng) 。 培 養(yǎng) 期 間 應(yīng) 逐 日 觀察 并 記 錄 是 否 有 菌 生 長 。 如 在 加 人 供 試 品 后 或 在 培 養(yǎng) 過 程 中 ，培 養(yǎng) 基 出 現(xiàn) 渾 濁 ， 培 養(yǎng) 14天 后 ，不 能 從 外 觀上 判 斷 有 無 微 生 物 生 長 ，可 取 該 培 養(yǎng) 液 適 量 轉(zhuǎn) 種 至 同 種 新 鮮 培 養(yǎng) 基 中 ，培 養(yǎng) 3

39、 天 ，觀察 接 種 的 同 種 新 鮮 培 養(yǎng) 基 是 否 再 出 現(xiàn) 渾 濁 ； 或 取 培 養(yǎng) 液 涂 片 ，染 色 ，鏡 檢 ，判 斷 是 否 有 菌 。4.5 結(jié)果判斷陽 性 對 照 管 應(yīng) 生 長 良 好 ，陰 性 對 照 管 不 得 有 菌 生 長 。 否 則 ，試 驗無 效 。若 供 試 品 管 均 澄 清 ，或 雖 顯 渾 濁 但 經(jīng) 確 證 無 菌 生 長 ，判 供 試 品 符 合 規(guī) 定 ； 若 供 試 品 管 中 任 何 一 管 顯 渾 濁 并 確 證 有 菌 生 長 ，判 供 試 品 不 符 合 規(guī) 定 ，除 非 能 充 分 證 明 試 驗 結(jié) 果 無 效 ，即 生

40、長 的 微 生 物 非 供 試 品 所 含 。 當(dāng) 符 合 下 列 至 少 一 個 條 件 時 方 可 判 試 驗 結(jié) 果 無 效 ：4.5.1 無 菌 檢 查 試 驗 所 用 的 設(shè) 備 及 環(huán) 境 的 微 生 物 監(jiān) 控 結(jié) 果 不 符 合 無 菌 檢 查 法 的 要 求 。4.5.2 回 顧 無 菌 試 驗過 程 ，發(fā) 現(xiàn) 有 可 能 引 起 微 生 物 污 染 的 因素。4.5.3 供 試 品 管 中 生 長 的 微 生 物 經(jīng) 鑒 定 后 ，確 證 是 因 無 菌 試 驗 中 所 使 用 的 物 品 和 （ 或 )無 菌 操 作 技 術(shù) 不 當(dāng) 引 起 的 。試 驗 若 經(jīng) 確 認(rèn)

41、無 效 ，應(yīng) 重 試 。 重 試 時 ，重 新 取 同 量 供 試 品 ，依 法 檢 查 ，若 無 菌 生 長 ，判 供 試 品 符 合 規(guī) 定 ； 若 有 菌 生 長 ，判 供 試 品 不 符 合 規(guī) 定 。表 1 批出廠產(chǎn)品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數(shù)置供試品批 產(chǎn) 量 N ( 個 ）接 種 每 種 培 養(yǎng) 基 的 最 少 檢 驗 數(shù) 量注射劑大體積注射劑 ( l00 m l)100100N50050010% 或 4 個 ( 取 較 多 者 ）1 0 個2 % 或 2 0 個 （ 取 較 少 者 ）2 0 個 （ 生 物 制 品 ）2 % 或 1 0 個 ( 取 較 少 者 ）2 0 個 （ 生 物 制 品 ）凍 干 血 液 制 品