流式細(xì)胞術(shù)描述課件

1、流式細(xì)胞術(shù)描述流式細(xì)胞術(shù)Flow cytometry，F(xiàn)CM 第一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述1. 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備。術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備。2. 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)個(gè)(zhg)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。術(shù)。基本概念基本概念第二頁(yè)

2、，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理第二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求(yoqi)(yoqi)第四節(jié)第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用第三頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 一、一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)與功能與功能 二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語(yǔ)二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語(yǔ) 三、三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理流式細(xì)胞術(shù)基本原理 四、四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)(jbn)

3、結(jié)構(gòu)與原理結(jié)構(gòu)與原理第四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本(yngbn)設(shè)置設(shè)置n1. 常用對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性(yngxng)對(duì)照空白對(duì)照補(bǔ)償對(duì)照n2.一套完整的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本設(shè)置第五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述陰性(ynxng)對(duì)照 作用是調(diào)節(jié)各熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)，將儀器歸零，即確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值n免疫球蛋白同型對(duì)照免疫球蛋白同型對(duì)照（同型抗體為沒(méi)有(mi yu)特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白。反映待測(cè)標(biāo)本對(duì)抗體非特異性結(jié)合的 水平）n陰性細(xì)胞對(duì)照陰性細(xì)胞對(duì)照（用已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于確定抗體的特異性

4、）第六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述陽(yáng)性(yngxng)對(duì)照 即用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞(xbo)（陽(yáng)性細(xì)胞(xbo)）細(xì)胞(xbo)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于檢測(cè)抗體是否有問(wèn)題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。第七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述空白對(duì)照 即不進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞。有些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)同樣被激發(fā)(jf)而產(chǎn)生自發(fā)熒光?？瞻讓?duì)照的主要作用用于確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測(cè)染色方法是否成功。第八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述補(bǔ)償(bchng)對(duì)照 由于光譜的重疊(chngdi)，對(duì)于多色分析樣本必須設(shè)置補(bǔ)償對(duì)照。補(bǔ)償對(duì)照主要用于多色分析時(shí)熒光光譜重疊(chngdi)的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。 補(bǔ)償對(duì)照是將用于

5、多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)，一一進(jìn)行單色標(biāo)記，以測(cè)定熒光信號(hào)的重疊并作適當(dāng)調(diào)節(jié)。第九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述2.一套完整一套完整(wnzhng)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本設(shè)置的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本設(shè)置 流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是利用細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光細(xì)胞標(biāo)記前后的熒光(ynggung)強(qiáng)度改強(qiáng)度改變變來(lái)確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎(chǔ)熒光域來(lái)確定細(xì)胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用于確定其基礎(chǔ)熒光域值的對(duì)照（如空白對(duì)照或陰性對(duì)照），又要有已標(biāo)記的待測(cè)樣本。一套值的對(duì)照（如空白對(duì)照或陰性對(duì)照），又要有已標(biāo)記的待測(cè)樣本。一套完整的流式樣本設(shè)置可根據(jù)

6、其不同的標(biāo)記方法進(jìn)行如下設(shè)置。完整的流式樣本設(shè)置可根據(jù)其不同的標(biāo)記方法進(jìn)行如下設(shè)置。 直接標(biāo)記樣本直接標(biāo)記樣本 對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（同型抗體對(duì)照）對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（同型抗體對(duì)照）和待測(cè)樣本。對(duì)于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)和待測(cè)樣本。對(duì)于直接標(biāo)記多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照。照。 間接標(biāo)記樣本間接標(biāo)記樣本 對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（一抗同型抗體對(duì)照）和待對(duì)于單色樣本應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照（一抗同型抗體對(duì)照）和待測(cè)樣本。測(cè)樣本。 對(duì)于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照，一般不建議使用。對(duì)于多色樣本，在單色基礎(chǔ)上另加補(bǔ)償對(duì)照，一

7、般不建議使用。第十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理n1.1.流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分析的基本原理n2.2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理n3.3.流式細(xì)胞儀熒光流式細(xì)胞儀熒光(ynggung)(ynggung)補(bǔ)償設(shè)置補(bǔ)償設(shè)置第十一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述1.流式細(xì)胞術(shù)分析(fnx)的基本原理n前向散射與側(cè)向散射是細(xì)胞前向散射與側(cè)向散射是細(xì)胞的固有屬性，暫稱為物理屬的固有屬性，暫稱為物理屬性。性。n熒光信號(hào)熒光信號(hào)(xnho)是人們通過(guò)不是人們通過(guò)不同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞上，是人為屬性，

8、暫稱為化學(xué)上，是人為屬性，暫稱為化學(xué)屬性。屬性。第十二頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述R1：淋巴細(xì)胞R2：?jiǎn)魏思?xì)胞R3：粒細(xì)胞R4：紅細(xì)胞裂解碎片(su pin)和少量血小板 將目的細(xì)胞群圈定將目的細(xì)胞群圈定(qun dn)（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以FSC或或SSC為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)分布圖表示出來(lái)，此圖中細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在與其熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)分布圖表示出來(lái)，此圖中細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在與其FSC或或SSC相應(yīng)的相應(yīng)的位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號(hào)弱或無(wú)、熒光信號(hào)強(qiáng)或有。位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號(hào)弱或無(wú)、熒光信號(hào)強(qiáng)或有。 第十三頁(yè)，共六十

9、六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，那么如何判斷特異性調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，那么如何判斷特異性熒光信號(hào)的有無(wú)？熒光信號(hào)的有無(wú)？ 需要設(shè)置陰性對(duì)照以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)需要設(shè)置陰性對(duì)照以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)(jch)熒光域值，并通過(guò)它熒光域值，并通過(guò)它來(lái)判斷待測(cè)樣本中是否有特異性熒光信號(hào)。來(lái)判斷待測(cè)樣本中是否有特異性熒光信號(hào)。 第十四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 首先通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性對(duì)首先通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值調(diào)至陰性照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值調(diào)至陰性致信區(qū)內(nèi)致信區(qū)內(nèi)(q ni)(q ni)，然后對(duì)陰性置，然后對(duì)陰性置信區(qū)進(jìn)行界定，大于陰性置信區(qū)信

10、區(qū)進(jìn)行界定，大于陰性置信區(qū)的熒光信號(hào)為特異性熒光信號(hào)。的熒光信號(hào)為特異性熒光信號(hào)。 對(duì)于流式樣本來(lái)說(shuō)，設(shè)置陰性對(duì)于流式樣本來(lái)說(shuō)，設(shè)置陰性對(duì)照是必須的，且陰性置信區(qū)一旦對(duì)照是必須的，且陰性置信區(qū)一旦設(shè)定，將作為后續(xù)樣本的陰、陽(yáng)性設(shè)定，將作為后續(xù)樣本的陰、陽(yáng)性判斷的基礎(chǔ)，不能隨意變動(dòng)。判斷的基礎(chǔ)，不能隨意變動(dòng)。第十五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述2.流式細(xì)胞術(shù)分選的基本原理1. 分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞/秒秒2. 分選純度分選純度: 99.5%左右左右(zuyu) 分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。3. 分選收獲率分選收獲率: 90-95%

11、 分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。分比。第十六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述3.3.流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償(bchng)(bchng)設(shè)置設(shè)置以以FITC、PE雙色分析為例：雙色分析為例：（1）先調(diào)節(jié)陰性對(duì)照管（即同型對(duì)照）先調(diào)節(jié)陰性對(duì)照管（即同型對(duì)照IgGFITC、IgGPE）：先將原補(bǔ)償）：先將原補(bǔ)償清零，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落清零，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落(qnlu)在在FITC和和PE雙陰性區(qū)。陰性雙陰性區(qū)。陰性對(duì)照的作用是，調(diào)節(jié)各熒光探測(cè)器合適的放大倍數(shù)，即歸零。對(duì)照的作用是，調(diào)節(jié)各熒光探測(cè)

12、器合適的放大倍數(shù)，即歸零。第十七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述（2）FITC標(biāo)記標(biāo)記(bioj)抗體抗體/IgGPE：(IgGPE為同型對(duì)照為同型對(duì)照) 此時(shí)電壓已通過(guò)陰此時(shí)電壓已通過(guò)陰性對(duì)照設(shè)定，絕不能變動(dòng)。當(dāng)性對(duì)照設(shè)定，絕不能變動(dòng)。當(dāng)PE探測(cè)器檢測(cè)到的探測(cè)器檢測(cè)到的FITC信號(hào)恰好完全消信號(hào)恰好完全消除時(shí)，補(bǔ)償便是正確的，即除時(shí)，補(bǔ)償便是正確的，即FITC單陽(yáng)性細(xì)胞的單陽(yáng)性細(xì)胞的PE信號(hào)與陰性對(duì)照的信號(hào)與陰性對(duì)照的PE信號(hào)一致。信號(hào)一致。 注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測(cè)管中，必須要有注：首先要知道雙陰性細(xì)胞的情況，其次是在檢測(cè)管中，必須要有FITC單陽(yáng)性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。單陽(yáng)

13、性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。第十八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第十九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述（3）IgGFITC/PE標(biāo)記抗體：同理，將進(jìn)入FITC探測(cè)器的PE信號(hào)降至本底一致，前提是必須有PE單陽(yáng)性細(xì)胞和雙陰性細(xì)胞。（4）當(dāng)設(shè)置好以上(yshng)補(bǔ)償條件后，即補(bǔ)償調(diào)節(jié)完畢。第二十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述（5）進(jìn)行多色分析時(shí)，必須(bx)做各熒光間的補(bǔ)償。方法同上，先準(zhǔn)備各種標(biāo)記的熒光陰性對(duì)照，確定合適的電壓，并逐一調(diào)節(jié)各熒光標(biāo)記抗體，與其他熒光對(duì)照，然后調(diào)節(jié)特異性熒光對(duì)每個(gè)熒光的補(bǔ)償。第二十一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述二、流式細(xì)胞術(shù)的重要二、流式細(xì)胞術(shù)的重要(zhngyo)術(shù)語(yǔ)術(shù)

14、語(yǔ)n1.1.前向散射與側(cè)向散射前向散射與側(cè)向散射n2. Coulter2. Coulter效應(yīng)與電子體積效應(yīng)與電子體積(tj)(tj)n3.3.熒光信號(hào)及其面積與寬度熒光信號(hào)及其面積與寬度n4.4.光譜重疊與熒光補(bǔ)償光譜重疊與熒光補(bǔ)償n5.5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對(duì)照置信區(qū)間細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性對(duì)照置信區(qū)間第二十二頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述1.前向散射(snsh)與側(cè)向散射(snsh)前向散射光前向散射光 (forward scatter)(forward scatter)： FSCFSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)側(cè)向側(cè)向(c xin)(c xin)散射光（散

15、射光（side scatter)side scatter)： SSCSSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)第二十三頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第二十四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 利用前向角和利用前向角和測(cè)向角散射光可測(cè)向角散射光可以把外周血白細(xì)以把外周血白細(xì)胞分成胞分成(fn chn)三群，淋三群，淋巴細(xì)胞、單核巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。細(xì)胞和粒細(xì)胞。散射光的測(cè)定散射光的測(cè)定(cdng)第二十五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述2.Coulter效應(yīng)(xioyng)與電子體積 Coulter Coulter效應(yīng)原理：微小效應(yīng)原理：微小(wixio)(wixio

16、)粒子并不導(dǎo)電，但通粒子并不導(dǎo)電，但通過(guò)充滿電解液的小孔時(shí)可產(chǎn)生過(guò)充滿電解液的小孔時(shí)可產(chǎn)生電阻變化，細(xì)胞體積越大，電電阻變化，細(xì)胞體積越大，電阻的改變?cè)酱??？蓪㈦娮枳兓璧母淖冊(cè)酱??？蓪㈦娮枳兓涗洖殡娢蛔兓糜谖⑿∮涗洖殡娢蛔兓?，用于微?wixio)(wixio)粒子體積測(cè)量和計(jì)數(shù)粒子體積測(cè)量和計(jì)數(shù)上。采用這種方法計(jì)算該顆粒上。采用這種方法計(jì)算該顆粒的體積就是電子體積。的體積就是電子體積。第二十六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述3.熒光(ynggung)信號(hào)及其面積與寬度熒光信號(hào)被光電倍增管收集，形成信號(hào)脈沖，每個(gè)信號(hào)脈沖都有其高度、面積熒光信號(hào)被光電倍增管收集，形成信號(hào)脈沖，每個(gè)信號(hào)脈沖

17、都有其高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個(gè)與寬度。每種顏色的熒光占用一個(gè)(y )特定的檢測(cè)器，每種顏色的檢測(cè)器特定的檢測(cè)器，每種顏色的檢測(cè)器稱為一個(gè)稱為一個(gè)(y )熒光通道。熒光通道。脈沖高度表示熒光信號(hào)的強(qiáng)度，表示為脈沖高度表示熒光信號(hào)的強(qiáng)度，表示為FLn-Height，n為儀器的熒光收集器序數(shù)。為儀器的熒光收集器序數(shù)。脈沖面積（脈沖面積（FLn-A）是采用積分計(jì)算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準(zhǔn)確）是采用積分計(jì)算的熒光通量。（熒光脈沖面積比高度更能準(zhǔn)確反映反映DNA含量，用于含量，用于DNA倍體分析）倍體分析）脈沖寬度（脈沖寬度（FLn-W）反映熒光的分布，）反映熒光的分布，常用

18、來(lái)區(qū)分雙連體細(xì)胞常用來(lái)區(qū)分雙連體細(xì)胞。第二十七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第二十八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述4.光譜(gungp)重疊與熒光補(bǔ)償 利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光(ynggung)(ynggung)通道的通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償”第二十九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述5.細(xì)胞基礎(chǔ)熒光域值與陰性(ynxng)對(duì)照置信區(qū)間對(duì)于對(duì)于(duy)流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會(huì)與待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)胞發(fā)生少流式樣本，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會(huì)與待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)胞發(fā)生少量非特異性結(jié)合，

19、在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號(hào)，這部分信號(hào)稱為基礎(chǔ)熒光量非特異性結(jié)合，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號(hào)，這部分信號(hào)稱為基礎(chǔ)熒光域值。域值。在流式標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，通常需要通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值在流式標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，通常需要通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值置于置于95%或或99%的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對(duì)照可信區(qū)間設(shè)定。的置信區(qū)間內(nèi)，作為陰性對(duì)照可信區(qū)間設(shè)定。第三十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)(jigu)與功與功能能n1. 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)n2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用第三十一頁(yè)

20、，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述2. 流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用流式細(xì)胞儀的基本功能與應(yīng)用(yngyng)n定性或定量分析功能定性或定量分析功能細(xì)胞膜：細(xì)胞膜：細(xì)胞表面抗原，表面糖類細(xì)胞表面抗原，表面糖類(tn li)(tn li)，表面受體，膜電位，表面受體，膜電位，膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對(duì)確定細(xì)胞的性質(zhì)及其功能重膜結(jié)合鈣離子，細(xì)胞表面電荷等，這對(duì)確定細(xì)胞的性質(zhì)及其功能重要。要。細(xì)胞質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)：各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、各種細(xì)胞成分，包括蛋白質(zhì)、RNARNA、各種細(xì)胞器中的特殊成、各種細(xì)胞器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子等。分、各種抗原、基因編碼蛋白、細(xì)胞因子等。細(xì)胞核

21、：細(xì)胞核：DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)等、蛋白質(zhì)等n分選功能分選功能可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來(lái)，可將具有特定性狀或功能的細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離出來(lái)，再進(jìn)行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：分選純度高（可達(dá)再進(jìn)行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：分選純度高（可達(dá)99%99%），分選），分選回收率高，可分選活細(xì)胞?；厥章矢?，可分選活細(xì)胞。第三十二頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述1. 流式細(xì)胞儀基本流式細(xì)胞儀基本(jbn)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)n流動(dòng)室與液流系統(tǒng)流動(dòng)室與液流系統(tǒng)n光源與光學(xué)系統(tǒng)光源與光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源激發(fā)光源光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)n信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)換信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)換(zhunhun)系統(tǒng)系統(tǒng)n計(jì)算機(jī)與分析系

22、統(tǒng)計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)第三十三頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述流動(dòng)流動(dòng)(lidng)室與室與液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)第三十四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述PMTPMTPMTPMT二分二分(r fn)鏡鏡帶通濾光片帶通濾光片激光激光(jgung)1234Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成，它由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成，它們分別將不同們分別將不同(b tn)波長(zhǎng)的光信號(hào)送入到不同波長(zhǎng)的光信號(hào)送入到不同(b tn)的探測(cè)器。濾光片主要分為四類：的探測(cè)器。濾光片主要分為四類：長(zhǎng)通濾光片長(zhǎng)通濾光片（LP）、短通濾光片（）、短通濾光片（SP）、帶通濾光）、帶通濾光片（片（BP

23、）和）和二分鏡二分鏡光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 第三十五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第三十六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第三十七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述激發(fā)光源n激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長(zhǎng)、單一方向(fngxing)、同步的穩(wěn)定光照n激光波長(zhǎng): 臺(tái)式機(jī)為固定波長(zhǎng)488nm, 633nm ，大型機(jī)波長(zhǎng)譜線寬包括325，457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm第三十八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)換信號(hào)收集與光電轉(zhuǎn)換(zhunhun)系統(tǒng)系統(tǒng) 主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號(hào)處理電路組成主要由光電轉(zhuǎn)換器件、

24、放大器和信號(hào)處理電路組成n光電轉(zhuǎn)換器件主要功能光電轉(zhuǎn)換器件主要功能(gngnng)(gngnng)是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電流是將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電流信號(hào)。由光電二極管和光電倍增管（信號(hào)。由光電二極管和光電倍增管（PMTPMT）來(lái)執(zhí)行。）來(lái)執(zhí)行。n放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。n信號(hào)處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號(hào)轉(zhuǎn)變成脈沖信號(hào)、數(shù)信號(hào)處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號(hào)轉(zhuǎn)變成脈沖信號(hào)、數(shù)字信號(hào)最終傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理。字信號(hào)最終傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行處理。第三十九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述計(jì)算機(jī)與分析計(jì)算機(jī)與分析(fnx)系統(tǒng)系統(tǒng)n計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用于控制整個(gè)儀器的運(yùn)行，數(shù)據(jù)(

25、shj)采集和數(shù)據(jù)(shj)分析。n各公司所產(chǎn)的流式細(xì)胞儀都有自己特有的分析系統(tǒng)。第四十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析n一、參數(shù)前向散射光前向散射光FSC: 反映顆粒的大小反映顆粒的大小(dxio)側(cè)向散射光側(cè)向散射光SSC: 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度熒光熒光FL: 細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少細(xì)胞被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少n二、數(shù)據(jù)的顯示與分析n三、設(shè)門第四十一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述二、數(shù)據(jù)的顯示(xinsh)與分析n1.單參數(shù)單參數(shù)(cnsh)直方圖直方圖n2.二維散點(diǎn)圖二維散點(diǎn)圖n3.二維等高線圖二維等高線圖n4

26、.假三維圖假三維圖n5.三維圖三維圖第四十二頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 以分布直方圖以分布直方圖( distribution histogram )( distribution histogram )來(lái)顯示，橫軸為該參來(lái)顯示，橫軸為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以(ky)(ky)是線性的，也可是線性的，也可以以(ky)(ky)是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。1.1.單參數(shù)單參數(shù)(cnsh)(cnsh)直方圖直方圖第四十三頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述看圖技巧：看圖技巧：1.1.先看

27、橫、縱坐標(biāo)，了解檢測(cè)目的；先看橫、縱坐標(biāo)，了解檢測(cè)目的；2.2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)；看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)；3.M13.M1的確定的確定(qudng)(qudng)是根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光是根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光信號(hào)大于基礎(chǔ)熒光域值（信號(hào)大于基礎(chǔ)熒光域值（M1M1），表示陽(yáng)性（），表示陽(yáng)性（M2M2）；）；4.4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測(cè)目的物一般用各數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測(cè)目的物一般用各MarkerMarker區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用平均熒光區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用平均熒光強(qiáng)度表示；強(qiáng)度表

28、示；5.5.幾個(gè)直方圖的比較，關(guān)鍵看幾個(gè)直方圖的比較，關(guān)鍵看MarkerMarker（M1M1、M2M2）的位置以及細(xì)胞數(shù)。）的位置以及細(xì)胞數(shù)。第四十四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系(gun x)(gun x)，橫、，橫、縱坐標(biāo)分別代表兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)縱坐標(biāo)分別代表兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。值的細(xì)胞。2.二維散點(diǎn)圖二維散點(diǎn)圖第四十五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述看圖技巧：1.先看x，y軸，了解代表參數(shù)的意義；2.再看其四個(gè)象限，并了解各象限意義；3.比較

29、幾個(gè)散點(diǎn)圖時(shí)，關(guān)鍵看四象限劃分區(qū)間的位置以及各象限散點(diǎn)的密度；4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測(cè)目的物一般(ybn)用各象限區(qū)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)占門內(nèi)細(xì)胞百分比或用平均熒光強(qiáng)度表示。第四十六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 用等高線來(lái)表示細(xì)胞用等高線來(lái)表示細(xì)胞(xbo)(xbo)數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞(xbo)(xbo)數(shù)相數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。3.二維等高線圖二維等高線圖第四十七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 縱軸與橫軸分別代表縱軸與橫軸分別代表(dibio)(dibio)被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)數(shù),Z,Z軸為細(xì)胞數(shù)。軸為細(xì)胞數(shù)。4

30、. .假三維圖假三維圖第四十八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述5.5.三維圖三維圖 任意選三個(gè)參數(shù)為任意選三個(gè)參數(shù)為x x，y y，z z軸，構(gòu)成一個(gè)三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)軸，構(gòu)成一個(gè)三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的空間各自參數(shù)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的空間(kngjin)(kngjin)，三維圖對(duì)比較復(fù)雜的亞群，三維圖對(duì)比較復(fù)雜的亞群的顯示更為直觀明了。的顯示更為直觀明了。第四十九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述三、設(shè)門流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過(guò)與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照進(jìn)行比較，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析的目的是通過(guò)與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照進(jìn)行比較，來(lái)確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率。完成這一過(guò)程的第

31、一來(lái)確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率。完成這一過(guò)程的第一步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，其術(shù)語(yǔ)為設(shè)門步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，其術(shù)語(yǔ)為設(shè)門（gatinggating）。）。設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。胞群，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。根據(jù)根據(jù)(gnj)(gnj)散射光設(shè)門散射光設(shè)門根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門根據(jù)某一細(xì)胞性狀設(shè)門組合設(shè)門組合設(shè)門第五十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述第五十一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 一、一、樣品樣品(yngpn)(yngp

32、n)制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 三、質(zhì)量控制三、質(zhì)量控制第三節(jié)第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫流式細(xì)胞儀免疫(miny)(miny)分析的技術(shù)要分析的技術(shù)要求求第五十二頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述一一、樣品、樣品(yngpn)(yngpn)制備制備流式細(xì)胞儀的樣品要求：流式細(xì)胞儀的樣品要求： 單細(xì)胞懸液，避免任何單細(xì)胞懸液，避免任何(rnh)(rnh)細(xì)胞沉積細(xì)胞沉積 被檢細(xì)胞或顆粒大小被檢細(xì)胞或顆粒大小0.20.240um40um 樣品中至少樣品中至少2000020000個(gè)細(xì)胞，濃度個(gè)細(xì)胞，濃度10105 5-10-

33、106 6個(gè)個(gè)/ /毫升毫升第五十三頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述（一）外周血淋巴細(xì)胞樣品（一）外周血淋巴細(xì)胞樣品(yngpn)(yngpn)的制備的制備 利用紅細(xì)胞裂解利用紅細(xì)胞裂解(li ji)液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞分析的二維散點(diǎn)圖第五十四頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來(lái)，然后離心漂洗。 懸浮懸浮(xunf)(xunf)培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備培養(yǎng)

34、細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。成單細(xì)胞懸液。（二（二) ) 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品培養(yǎng)細(xì)胞的樣品(yngpn)(yngpn)制備制備第五十五頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 機(jī)械法：機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。 酶處理酶處理(chl)法：法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學(xué)試劑處理法：化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。等。 表面活性劑處理法：表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。、皂素等。(三三)新鮮新鮮(xn xin)實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備第五十六頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 機(jī)械

35、法機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾團(tuán)塊等，如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾團(tuán)塊等，也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除(pich)(pich)團(tuán)塊和碎片團(tuán)塊和碎片的干擾。的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造成所測(cè)化學(xué)成份的不良影響。成所測(cè)化學(xué)成份的不良影響。FCMFCM所測(cè)細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；所測(cè)細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能

36、少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。以保證下一步的熒光染色處理不受影響。 第五十七頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述防止防止(fngzh)(fngzh)細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2 2、乙醇與甲醇保存法：、乙醇與甲醇保存法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。

37、( (四）單細(xì)胞懸液的保存四）單細(xì)胞懸液的保存(bocn)(bocn)第五十八頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光(ynggung)信號(hào)的產(chǎn)生信號(hào)的產(chǎn)生（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料熒光熒光(ynggung)染料染料 激發(fā)波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)（nm) 發(fā)射波長(zhǎng)（發(fā)射波長(zhǎng)（nm) 顏色顏色FITC 488 525 深藍(lán)色PE(RDI) 488 575 橙色(chn s)ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633

38、 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色第五十九頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光(ynggung)染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY5PECY5CY5488nm能量能量(nngling)傳遞染傳遞染料：料：第六十頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式： 結(jié)構(gòu)親和方式結(jié)構(gòu)親和方式 嵌入嵌入(qin r)結(jié)合方式結(jié)合方式 共價(jià)結(jié)合方式共價(jià)結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記(bioj)第六十一頁(yè)，共六十六頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)描述3、雙或多參數(shù)熒光抗體、雙或多參數(shù)熒光抗體(kngt)的組合標(biāo)記的組合標(biāo)記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色(chn s