熱休克蛋白70在高壓氧預(yù)防減壓病中的作用機(jī)制

1、熱休克蛋白70 在高壓氧預(yù)防減壓病中的作用機(jī)制當(dāng)機(jī)體所處的環(huán)境氣壓發(fā)生快速大幅度變化時(shí)（如潛艇脫險(xiǎn)、 深水作業(yè)減壓上浮、高空飛行或太空艙外活動(dòng)） ，可引起溶解于組織的生理性惰性氣體溢出形成氣泡導(dǎo)致減壓?。?decompression sickness, DCS）的發(fā)生。氣泡栓塞部位的不同可導(dǎo)致皮膚瘙癢、出血、關(guān)節(jié)疼痛甚至呼吸困難、癱瘓、死亡等不同表現(xiàn)。脊髓和肺是 DCS氣泡的主要靶器官。高壓氧（hyperbaricoxygen, HBO）是治療 DCS的重要手段，目前已廣泛應(yīng)用于臨床上一氧化碳中毒、神經(jīng)損傷及糖尿病足等疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)， HBO預(yù)處理可有效預(yù)防脊髓、腦、肝臟等多種組織的缺血

2、缺氧性損傷。我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，18h 前單次 HBO暴露可通過誘導(dǎo)一氧化氮（nitricoxide, NO ）的生成降低大鼠DCS模型的發(fā)病率。然而，NO水平在 HBO暴露結(jié)束后短時(shí)間內(nèi)即恢復(fù)正常，何種機(jī)制介導(dǎo)了HBO暴露 18h 后的保護(hù)作用尚須深入研究。 高壓氧預(yù)適應(yīng)可引起適度的氧化應(yīng)激，通過動(dòng)員熱休克蛋白70（ heat shock protein70，HSP70）等保護(hù)性蛋白的生成抵御各類損傷， HSP70除了可發(fā)揮分子伴侶功能和參與細(xì)胞耐熱保護(hù)外，還可通過抗凋亡、抗氧化等功能對(duì)抗組織細(xì)胞損傷。因此，HSP70很可能作為 HBO暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白起到預(yù)防DCS的作用。本課題旨在

3、研究HSP70在 HBO預(yù)防 DCS損傷中的作用，深入探索HBO預(yù)防DCS的機(jī)制，研究從在體、離體兩方面展開，其中在體研究包括以下三方面：研究 HBO預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠 DCS模型氣泡生成的影響。氣泡生成是 DCS發(fā)生的主要因素。在高氣壓暴露前18h 分別給予大鼠 HBO（ 280kPa-60min，n=10）或常壓空氣（ n=10）預(yù)暴露，隨后以“ 700kPa-90min空氣暴露、 3min 減壓”方案制備減壓病模型。通過超聲二維影像連續(xù)探測(cè)減壓后2h 內(nèi)通過大鼠右心系統(tǒng)的氣泡量，發(fā)現(xiàn)HBO并不影響 DCS氣泡生成量及生成速率， 提示 HBO預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用并不是通過減少氣泡生成量實(shí)現(xiàn)的。觀察H

4、BO預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠肺與脊髓HSP表達(dá)的影響。SD大鼠以 280kPa-60min 方案純氧暴露后， 分別在暴露后即刻、 6、12、18、24、30h （n=6）取肺與脊髓，通過Western-blot及免疫組化檢測(cè)HSP27、70和 90 蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn) HBO暴露 18h 后 HSP70表達(dá)達(dá)到高峰，隨后下降，HSP27和 90 變化不顯著。HBO暴露前給予 HSP70拮抗劑槲皮素及 NO合酶抑制劑 L-NAME（ NG-nitro-L-arginine-methylester ）均可顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示HBO通過 NO誘導(dǎo) HSP70的表達(dá)。探索 HSP70在 HBO預(yù)防 DC

5、S過程中的作用。以“700kPa-90min 空氣暴露、3min 減壓”制備大鼠 DCS模型，暴露前 18h 給予常壓空氣、 HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、 HBO+L-NAME處理（ n=60）?？焖贉p壓后 1h 檢測(cè)肺和脊髓的氧化損傷水平（MDA、8-OHdG、H₂O₂）及凋亡情況（ caspase3、9 及 TUNEL凋亡細(xì)胞染色），發(fā)現(xiàn) DCS模型組氧化損傷及凋亡程度較正常對(duì)照明顯升高（P<0.05），HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷 （P<0.0

6、5），槲皮素及 L-NAME顯著拮抗了 HBO的保護(hù)效應(yīng)（它們各自單獨(dú)使用對(duì)DCS模型的上述指標(biāo)無(wú)影響） 。說明 HSP70的抗氧化、抗凋亡作用在HBO預(yù)防 DCS中發(fā)揮了作用。上述結(jié)果表明： 18h 前單次 HBO暴露對(duì)大鼠 DCS有明顯的預(yù)防作用，此效應(yīng)與 HSP70的抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。內(nèi)皮是DCS中最先受到氣泡損傷的組織，離體研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為對(duì)象，從以下三方面展開：觀察HBO預(yù)適應(yīng)對(duì) HUVEC表達(dá) HSP的影響。細(xì)胞以 280kPa-60min 方案 98.2%氧氣及 1.8%二氧化碳混合氣暴露（即280kPa 下暴露氣體中二氧化碳濃度為5%），分別在暴露后即

7、刻、 6、12、18、24、30、36、 42h （ n=6）收集細(xì)胞，通過Western-blot檢測(cè) HSP27、32、 70 和 90蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)HBO暴露 18h 后 HSP70表達(dá)達(dá)到高峰， HSP27、32 和 90 升高變化不顯著。L-NAME或槲皮素均可顯著抑制HSP70的表達(dá)，提示 NO介導(dǎo)了 HBO對(duì) HSP70的誘導(dǎo)。HSP70在 HBO預(yù)防氧化損傷中的作用。將HUVEC暴露于終濃度為250mol/L 的過氧化氫（ hydrogen peroxide，H₂O₂） 4h，暴露前

8、 18h 給予常壓空氣、 HBO（280kPa-60min）、HBO+槲皮素、 HBO+L-NAME處理（ n=6）。H₂O₂處理后檢測(cè)細(xì)胞氧化損傷程度（MDA、 SOD、GSH-Px）及細(xì)胞活力（ LDH、 CCK8），結(jié)果表明 H₂O₂明顯地?fù)p傷了 HUVEC，其氧化損傷指標(biāo)增高，細(xì)胞活性下降（P<0.05），HBO預(yù)暴露顯著降低了這些損傷（P<0.05），槲皮素及 L-NAME顯

9、著拮抗了 HBO的保護(hù)效應(yīng)（它們各自單獨(dú)使用對(duì)上述指標(biāo)無(wú)影響）。說明 HSP70的抗氧化作用在HBO預(yù)防細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮了作用。闡明 HBO誘導(dǎo) HSP70的分子機(jī)制。細(xì)胞以280kPa-60min 方案 98.2%氧氣及 1.8%二氧化碳混合氣暴露后，分別在暴露后即刻、 6、 12、18h 收集細(xì)胞，通過信號(hào)蛋白磷酸化芯片檢測(cè) Akt 、 ATF-2、BCR-Abl、CREB、HSP27、 ERK、JNK、p38、 NF-B、p53 及 STAT3通路磷酸化的表達(dá)程度，結(jié)果表明Akt 通路在 HBO暴露后 12h 表達(dá)增高， p38 通路在暴露后 6h 增高，當(dāng)使用 p38 抑制劑 SB203580后， HBO對(duì) HSP70的誘導(dǎo)被拮抗了。Akt 通路可介導(dǎo) HSP70的表達(dá)，說明 HBO產(chǎn)生 NO后可通過 p38 及 Akt 通路誘導(dǎo) HSP70表達(dá)增高。以上結(jié)果說明 HBO預(yù)適應(yīng)可通過 p38 及 Akt 通路促進(jìn) HSP70表達(dá)，并通過 HSP70的抗損傷作用預(yù)防了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷