南方醫(yī)科大學(xué)肝糖原提取2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)二第3實(shí)驗(yàn)室

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專業(yè)年級(jí)： 級(jí)第二臨床醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué) 組 別： 第7實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱肝糖原的提取、鑒定、分離實(shí)驗(yàn)日期2016-12-29實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)第7實(shí)驗(yàn)室 指導(dǎo)老師陸遠(yuǎn)芳評(píng)分教師簽名批改日期1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 掌握組織樣品的制備方法并了解相關(guān)注意事項(xiàng)。2、 掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測(cè)定糖原含量的原理和操作方法以及相關(guān)注意事項(xiàng)3、 掌握正確使用可調(diào)微量取液器與刻度吸管的方法。4、 正確行使溶液轉(zhuǎn)移作業(yè)。5、 掌握分光光度計(jì)的正確用法。2、 實(shí)驗(yàn)原理1、肝糖原提取儲(chǔ)存于肝細(xì)胞內(nèi)的糖原在對(duì)肝細(xì)胞采用淹沒勻漿等方法破碎細(xì)胞并在低濃

2、度的三氯醋酸環(huán)境中讓肝組織中的酶被破壞、蛋白質(zhì)被沉淀析出后，能穩(wěn)定地保存在上清液中。以此讓糖原與其他組分分離。糖原溶于熱水而不溶于乙醇，故先用95%乙醇沉淀綠葉中的糖原，再溶于熱水中。2、糖原的鑒定糖原水溶液為乳樣光澤，遇碘變紅棕色。糖原葡萄糖長鏈分子間引力吸附碘分子后呈現(xiàn)出的顏色。糖原尚可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應(yīng)和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的的存在。反應(yīng)式如下：CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 + Cu2O (紅色)Cu(OH)2 = H2O

3、+ CuO (黑色)3、肝糖原定量濃酸中，糖原水解成葡萄糖，濃硫酸使葡萄糖進(jìn)一步脫水生成糠醛衍生物，即5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍(lán)色的化合物。該物質(zhì)在620nm處呈現(xiàn)最大吸收峰。糖含量于10100mg范圍內(nèi)時(shí)，溶液顏色的深淺正比于可溶性糖含量。利用此反應(yīng)下的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與同樣處置后的已知糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液比色，通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法即可計(jì)算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織宜先置于濃堿中加熱，以破壞其他成分，而保留肝糖原。3、 實(shí)驗(yàn)材料l 儀器：1、 普通離心機(jī)，室溫-100恒溫水浴箱（x2），722型分光光度計(jì)，精度為 10mg級(jí)電子天平2、 剪刀、

4、鑷子、研缽3、 試管架，離心管，試管4、 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l微量可調(diào)取液器5、 100ml容量瓶6、 白瓷反應(yīng)板l 試劑：雞肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、濃HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘試劑、班氏試劑、30%KOH溶液、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（50mg/L）蒽酮顯色劑4、 實(shí)驗(yàn)步驟l 肝糖原的提取加入5%CCl3COOH 1ml加入5%CCl3COOH 3ml加入蒸餾水2ml雞肝約1.5g，剪碎 研磨至乳狀研磨成肝勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心3min（4000r/min）取上清液加入5ml 95%乙醇，混

5、勻，靜置10min離心5min（4000r/min）取沉淀沸水浴2min，溶解沉淀+50% NaOH 0.2ml+班氏試劑0.2ml(4d)+濃HCl 0.2ml 糖原溶液1ml白瓷板中 沸水浴加熱15min，冷卻 加碘試劑0.1ml 加碘試劑0.1ml 蒸餾水 0.1ml 糖原溶液0.1ml糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液呈色對(duì)比 混勻沸水浴2min，觀察變化l 注意事項(xiàng)：1、 提取肝糖原時(shí)：向上清液中加入等量的95%乙醇后，必須混勻。因上清液為水溶液，密度比95%乙醇大，析出液分兩層。又：上清液已多于4ml，加入等量乙醇后，總量近9ml，混勻操作較困難，宜用傾倒混勻，或以玻棒攪拌混

6、勻。2、 糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產(chǎn)生的顏色與葡萄糖殘基數(shù)的多少有相關(guān)性。葡萄糖殘基20個(gè)以下時(shí)使碘呈紅色，20-30個(gè)之間碘呈紫色，60個(gè)以上時(shí)碘呈藍(lán)色。淀粉中因分支鏈長，呈藍(lán)色；肝糖原分枝葡萄糖殘基在20個(gè)以下（常為8-12個(gè)），吸附碘后為紅棕色。3、 糖原水解液中鑒定葡萄糖時(shí)，加班氏試劑不能過量，否則反應(yīng)液呈黑色渾濁，觀察不到應(yīng)有的結(jié)果。肝糖原定量測(cè)定雞肝 0.15 g+30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷卻，全部轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中加水至標(biāo)線，仔細(xì)混勻，獲得糖原提取液取3支干凈的試管，按下表操作：試劑（毫升）空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管蒸餾水1.0標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.0蒽

7、酮溶液（0.2%）2.52.52.5混勻，沸水浴10min后冷卻。在722型或721型分光光度計(jì)620nm波長處，用空 白管溶液調(diào)零，測(cè)定各管溶液的吸光度（A）.計(jì)算：肝糖原（g/100g肝組織）= × × × 1.11× 0.05 5、 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果討論雞肝肝糖原成分的定性測(cè)定步驟簡述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象雞肝約1.5g，剪碎兩次加入CCl3COOH研磨至乳狀研磨成肝勻漿肝臟碎片研磨之后呈灰黃色，兩次加入試劑后均無明顯變化全部轉(zhuǎn)入離心管中，離心3min（4000r/min）試劑分層：上層為透明無色液體，下層為灰黃色沉淀取上清液加入95%乙醇離心5min（4000r

8、/min）取沉淀試劑分層，上層液體無色透明，下層為白色沉淀沸水浴2min沉淀溶解雞肝提取液在白瓷板中的對(duì)照顯色反應(yīng)加入糖原與碘液的一側(cè)呈棕紅色反應(yīng)，對(duì)照組仍為黃色 雞肝提取液水解后加入班氏試劑再次水浴反應(yīng)加入班氏試劑溶液為藍(lán)色，再次水浴后，溶液中產(chǎn)生磚紅色沉淀雞肝肝糖原的定量測(cè)定步驟簡述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象雞肝0.15克沸水浴獲得白色懸濁液按要求配置三管對(duì)照溶液完全配置后均為黃色溶液沸水浴獲得一管黃色溶液，一管深藍(lán)色溶液，一管淺黃色溶液分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果見下文具體圖片見下文：l 糖原溶液加碘試劑后呈紅棕色，對(duì)照組則為黃色。糖原提取液組對(duì)照組糖原提取液組肝糖原定性實(shí)驗(yàn)中加入班氏試劑后的顯色反應(yīng)：l 加入蒽酮

9、溶液并且水浴過后的樣品管、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管（由左至右）l 將空白管在620nm處的A值設(shè)定為0，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管的分光光度值如下：空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管100.4390.028200.4800.169300.4850.031平均值00.4680.30(其中，樣品管第二組測(cè)得數(shù)據(jù)誤差較大，予以舍去)肝糖原= × 0.05 × × × 1.11 0.237（g/100g）討論：可以發(fā)現(xiàn)，本組在對(duì)肝糖原定性實(shí)驗(yàn)中都獲得了較明顯的反應(yīng)。其中，糖原加入碘液反應(yīng)之后呈現(xiàn)出紅棕色表明雞肝提取液中確有糖原存在。而在糖原水解后，產(chǎn)物加入班氏試劑反應(yīng)之后有磚紅色沉淀則表明雞肝提取液水解后獲得葡萄糖，此進(jìn)一步驗(yàn)證雞肝中存在糖原。在定量實(shí)驗(yàn)中，我組獲得的數(shù)據(jù)偏低，可能原因如下：1、 在實(shí)驗(yàn)過程中，糖原在濃硫酸中水解不充分，獲得樣品管顏色偏淺，最終