固相萃取高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量

1、固相萃取-高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量 2009年09月03日 何 強 孔祥虹 李建華 張 瑩  摘要：建立固相萃取-高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量。樣品用乙腈提取，中性氧化鋁和活性炭固相萃取柱凈化，分析時采用Inertsil® ODS-3（25 cm × 4.6 mm，5m）色譜柱分離，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm，柱溫35 。結果表明，在0.02 mg·L-15.0 mg·L-1范圍內，吡蟲啉峰面積與濃度呈良好的線性關系（r=0.9999），枸杞子樣品中吡蟲啉能

2、得到良好的分離，回收率及重復性良好。該法可用于枸杞子中吡蟲啉殘留量的檢測。關鍵詞：枸杞子；吡蟲啉；高效液相色譜；固相萃取Determination of imidacloprid resi-due in Lycium by gradient RP-HPLC HE Qiang, KONG Xiang-hong, LI Jian-hua, ZHANG Ying Abstract Objective: To establish a method for the determination of imidacloprid in Lycium by gradient RP-HPLC. Sample pr

3、eparation involves extraction with acetonitrile. Final clean-up were performed on an Alumina Neutral SPE Column and an Active Charcoal column, using the column in tandem. Chromatographic analysis was performed on Inertsil® ODS-3（25cm × 4.6mm，5m）column. The gradient elution was used with a

4、flow rate of 0.1 mol·L-1. Mobile phase A: acetonitrile ; Mobile phase B: 0. 01 mol·L-1 potassium dihydrogen phosphate buffer（PH3.3）. ConCondition of the gradient elution: 0 15 min，A: 15%，1517 min, A from 15% to 30%, 1725 min, A: 15%; the detection wavelength was 246 nm. Imidacloprid in mea

5、sured samples was separated completely. The calibration curve was linear at the range of 0.0005 mg·L-10.1 mg·L-1 with good precision and accuracy. The method was applied to the determination of imidacloprid residues in Lycium. Key words: Lycium; imidacloprid; HPLC; solid phase extraction吡蟲

6、啉(Imidacloprid)是一種內吸性吡啶類殺蟲劑，化學名稱為1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有高效、低毒、廣譜的特點，并且對蚜蟲、飛虱、葉蟬等害蟲有特效。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實1，在寧夏枸杞種植區(qū)，該農藥是防治枸杞蚜蟲的首選藥劑，用量較大。近年來，測定吡蟲啉殘留的方法主要有高效液相色譜法和液質聯(lián)用法24，但前處理都比較復雜，分離效果不好。本文建立了梯度洗脫反相高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量。本方法準確、可靠，對枸杞子中吡蟲啉的分離良好，回收率及重復性均符合農藥殘留測定要求。1 儀器與試藥Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)

7、：配四元泵、DAD檢測器、自動進樣器及色譜數(shù)據(jù)處理工作站（美國Agilent公司）；旋轉蒸發(fā)儀（LABOROTA 4001，德國Heidolph公司）；ENVI- Carb固相萃取柱（3mL，美國SUPELCO公司）；SupelcleanTM LC-Alumina N固相萃取柱（3mL，美國SUPELCO公司）。吡蟲啉對照品（Sigma公司，純度99.2 %）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；水為超純水（PURELAB PULS超純水器制備）；其他試劑均為分析純。2 實驗方法2.1 色譜條件色譜柱：Inertsil® ODS-3（25cm × 4.6mm，5m）；流動相

8、：乙腈-水系統(tǒng)，010min乙腈從10%線性遞增至30%，1018 min乙腈再從30%線性遞減至10%；流速：1.0 mL·min-1；色譜柱溫度：35；檢測波長270 nm，參比波長300 nm；進樣量：50L。應用上述條件，取0.5mg·L-1的吡蟲啉對照品溶液進樣，色譜圖見圖1。     圖1吡蟲啉對照品HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of imidacloprid standard1. 吡蟲啉（imidacloprid）2.2 樣品的提取和凈化 樣品提取稱取充分粉碎的干燥枸杞子樣品2.0

9、g，加入10 mL水，劇烈振搖使之充分分散，加入34g NaCl和20mL乙腈，振搖提取10min，3000r/min 離心3 min，取上層乙腈層，下層再用15 mL×2的乙腈提取2次，合并提取液，40減壓蒸至近干，氮氣吹干，5 mL丙酮-正己烷（20:80）溶解。 樣品凈化中性氧化鋁柱串聯(lián)活性炭柱凈化：將中性氧化鋁柱先用5mL正己烷預淋洗，然后把“”中的提取液過柱，先用5mL丙酮-正己烷（20:80）洗滌，棄去洗滌液，再用10mL丙酮-正己烷（80:20）洗脫，洗脫時下面串聯(lián)活性炭柱，洗脫液40減壓旋轉蒸發(fā)至近干，氮氣吹干，1.0 mL乙腈-水（30:70）溶解，過0.45m的濾

10、膜，進樣檢測。3 實驗結果3.1 線性關系考察分別配制濃度為0.02, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mg·L-1的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，并以對照品濃度（X，mg·L-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線回歸方程：Y = 185.74 X +1.2102,r = 0.9999，在0.025.00 mg·L-1范圍內，吡蟲啉濃度與峰面積值有良好的線性關系。3.2 精密度與重復性取對照品和供試品溶液，連續(xù)進樣6次，對照品和供試品中吡蟲啉峰面積的R

11、SD分別為0.96%,1.28%精密度良好。按照“2.2”項下方法，平行稱取6份含吡蟲啉的枸杞子樣品，制備供試品溶液，依法進樣測定，計算含量，結果為0.095，0.086，0.089，0.10，0.098，0.091 mg·kg-1，RSD為5.69%，重復性良好。3.3 加樣回收率實驗為了考察方法的回收率，對15份枸杞子樣品進行加標回收實驗，加標水平為0.05，0.10，0.20 mg·kg-1，每個水平5個平行樣品，樣品及樣品加標的HPLC圖譜如圖2所示，檢測結果見表1。        &#

12、160;圖2  枸杞子樣品加標0.20g（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖Fig 2  HPLC chromatogram of Lycium with 0.20 g imidacloprid added (A) and without imidacloprid (B) 1. 吡蟲啉（imidacloprid）表1 方法回收率測定結果（n=5）Tab 1 Recovery of imidacloprid in Lycium (n=5)樣品含量(content)/mg·kg-1加標量(added)/ mg·kg-1測定值(measured)/ mg

13、3;kg-1平均回收率(average recovery)/ %RSD/ %0.0460.050.08987.26.290.100.13791.54.620.200.24095.93.063.4 檢測限按“2.1”項下色譜條件，將對照品溶液稀釋進樣，以10倍噪音（S/N = 10）計，本方法最小檢固相萃取-高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量 2009年09月03日 何 強 孔祥虹 李建華 張 瑩 摘要：建立固相萃取-高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量。樣品用乙腈提取，中性氧化鋁和活性炭固相萃取柱凈化，分析時采用Inertsil® ODS-3（25 cm × 4.6

14、mm，5m）色譜柱分離，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm，柱溫35 。結果表明，在0.02 mg·L-15.0 mg·L-1范圍內，吡蟲啉峰面積與濃度呈良好的線性關系（r=0.9999），枸杞子樣品中吡蟲啉能得到良好的分離，回收率及重復性良好。該法可用于枸杞子中吡蟲啉殘留量的檢測。關鍵詞：枸杞子；吡蟲啉；高效液相色譜；固相萃取Determination of imidacloprid resi-due in Lycium by gradient RP-HPLC HE Qiang, KONG Xiang-hong, L

15、I Jian-hua, ZHANG Ying Abstract Objective: To establish a method for the determination of imidacloprid in Lycium by gradient RP-HPLC. Sample preparation involves extraction with acetonitrile. Final clean-up were performed on an Alumina Neutral SPE Column and an Active Charcoal column, using the colu

16、mn in tandem. Chromatographic analysis was performed on Inertsil® ODS-3（25cm × 4.6mm，5m）column. The gradient elution was used with a flow rate of 0.1 mol·L-1. Mobile phase A: acetonitrile ; Mobile phase B: 0. 01 mol·L-1 potassium dihydrogen phosphate buffer（PH3.3）. ConCondition o

17、f the gradient elution: 0 15 min，A: 15%，1517 min, A from 15% to 30%, 1725 min, A: 15%; the detection wavelength was 246 nm. Imidacloprid in measured samples was separated completely. The calibration curve was linear at the range of 0.0005 mg·L-10.1 mg·L-1 with good precision and accuracy.

18、The method was applied to the determination of imidacloprid residues in Lycium. Key words: Lycium; imidacloprid; HPLC; solid phase extraction吡蟲啉(Imidacloprid)是一種內吸性吡啶類殺蟲劑，化學名稱為1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺。吡蟲啉具有高效、低毒、廣譜的特點，并且對蚜蟲、飛虱、葉蟬等害蟲有特效。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實1，在寧夏枸杞種植區(qū)，該農藥是防治枸杞蚜蟲的首選藥劑，用量較大。近年來，測定吡蟲

19、啉殘留的方法主要有高效液相色譜法和液質聯(lián)用法24，但前處理都比較復雜，分離效果不好。本文建立了梯度洗脫反相高效液相色譜法測定枸杞子中吡蟲啉殘留量。本方法準確、可靠，對枸杞子中吡蟲啉的分離良好，回收率及重復性均符合農藥殘留測定要求。1 儀器與試藥Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)：配四元泵、DAD檢測器、自動進樣器及色譜數(shù)據(jù)處理工作站（美國Agilent公司）；旋轉蒸發(fā)儀（LABOROTA 4001，德國Heidolph公司）；ENVI- Carb固相萃取柱（3mL，美國SUPELCO公司）；SupelcleanTM LC-Alumina N固相萃取柱（3mL，美國SUPELCO公司）。

20、吡蟲啉對照品（Sigma公司，純度99.2 %）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；水為超純水（PURELAB PULS超純水器制備）；其他試劑均為分析純。2 實驗方法2.1 色譜條件色譜柱：Inertsil® ODS-3（25cm × 4.6mm，5m）；流動相：乙腈-水系統(tǒng)，010min乙腈從10%線性遞增至30%，1018 min乙腈再從30%線性遞減至10%；流速：1.0 mL·min-1；色譜柱溫度：35；檢測波長270 nm，參比波長300 nm；進樣量：50L。應用上述條件，取0.5mg·L-1的吡蟲啉對照品溶液進樣，色譜圖見圖1。圖1吡

21、蟲啉對照品HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of imidacloprid standard1. 吡蟲啉（imidacloprid）2.2 樣品的提取和凈化 樣品提取稱取充分粉碎的干燥枸杞子樣品2.0g，加入10 mL水，劇烈振搖使之充分分散，加入34g NaCl和20mL乙腈，振搖提取10min，3000r/min 離心3 min，取上層乙腈層，下層再用15 mL×2的乙腈提取2次，合并提取液，40減壓蒸至近干，氮氣吹干，5 mL丙酮-正己烷（20:80）溶解。 樣品凈化中性氧化鋁柱串聯(lián)活性炭柱凈化：將中性氧化鋁柱先用5mL正己烷預淋洗，然后把“2.2.1

22、”中的提取液過柱，先用5mL丙酮-正己烷（20:80）洗滌，棄去洗滌液，再用10mL丙酮-正己烷（80:20）洗脫，洗脫時下面串聯(lián)活性炭柱，洗脫液40減壓旋轉蒸發(fā)至近干，氮氣吹干，1.0 mL乙腈-水（30:70）溶解，過0.45m的濾膜，進樣檢測。3 實驗結果3.1 線性關系考察分別配制濃度為0.02, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 mg·L-1的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，并以對照品濃度（X，mg·L-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線回歸方程：Y =

23、 185.74 X +1.2102,r = 0.9999，在0.025.00 mg·L-1范圍內，吡蟲啉濃度與峰面積值有良好的線性關系。3.2 精密度與重復性取對照品和供試品溶液，連續(xù)進樣6次，對照品和供試品中吡蟲啉峰面積的RSD分別為0.96%,1.28%精密度良好。按照“2.2”項下方法，平行稱取6份含吡蟲啉的枸杞子樣品，制備供試品溶液，依法進樣測定，計算含量，結果為0.095，0.086，0.089，0.10，0.098，0.091 mg·kg-1，RSD為5.69%，重復性良好。3.3 加樣回收率實驗為了考察方法的回收率，對15份枸杞子樣品進行加標回收實驗，加標水平

24、為0.05，0.10，0.20 mg·kg-1，每個水平5個平行樣品，樣品及樣品加標的HPLC圖譜如圖2所示，檢測結果見表1。 圖2 枸杞子樣品加標0.20g（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of Lycium with 0.20 g imidacloprid added (A) and without imidacloprid (B) 1. 吡蟲啉（imidacloprid）表1 方法回收率測定結果（n=5）Tab 1 Recovery of imidacloprid in Lycium (n=5)樣品含量(content)/mg&#

25、183;kg-1 加標量(added)/ mg·kg-1 測定值(measured)/ mg·kg-1 平均回收率(average recovery)/ % RSD/ % 0.046 0.05 0.089 87.2 6.29 0.10 0.137 91.5 4.62 0.20 0.240 95.9 3.06 3.4 檢測限按“2.1”項下色譜條件，將對照品溶液稀釋進樣，以10倍噪音（S/N = 10）計，本方法最小檢出濃度為0.01 mg·L-1。以稱取2.0 g枸杞子樣品，定容1.00 mL計算，枸杞子中吡蟲啉殘留的最低檢出限為0.005 mg·kg-

26、1。3.5 樣品測定利用本方法測定了15批枸杞子樣品，提取回收率與色譜分離均良好，其中13批檢出含有吡蟲啉殘留，最低0.012 mg·kg-1，最高0.21 mg·kg-1，只有兩批未檢出。4討論4.1 提取凈化條件枸杞子富含多糖類物質，提取時容易粘結成團，影響提取效率，所以提取前一定要將枸杞子充分粉碎，提取時加入適量的水并劇烈振搖，使多糖類物質溶解，枸杞子基質充分分散，提高提取回收率。選用用乙腈作為提取溶劑，是因為乙腈極性較大，可以減少脂溶性雜質的萃出，而提取是在乙腈-水系統(tǒng)中進行，水溶性雜質的萃出也較少。稱樣量不大于2.5g，否則超過活性炭吸附容量，有較多雜質流出。提取

27、液的凈化考察了硅膠、Florisil硅土、C18、中性氧化鋁、活性炭等固相萃取柱，發(fā)現(xiàn)利用串聯(lián)中性氧化鋁和活性炭固相萃取柱凈化的效果較好，色譜干擾小。利用中性氧化鋁柱凈化時考察了洗脫溶劑的比例和體積，發(fā)現(xiàn)用20:80的丙酮-正己烷10mL洗脫未能將吡蟲啉從萃取柱上洗下，而且能夠觀察到萃取柱上有一明顯的黃色雜質色帶被洗下，用40:60的丙酮-正己烷10 mL洗脫，則有約60 %的吡蟲啉洗下，洗脫至20 mL未能洗脫完全，而用80:20的丙酮-正己烷10 mL可以將吡蟲啉完全洗下，通過色譜檢測，發(fā)現(xiàn)用40:60的丙酮-正己烷和80:20的丙酮-正己烷洗脫所得的溶液在吡蟲啉出峰位置的色譜峰基本相同，

28、所以選用80:20的丙酮-正己烷。利用活性炭固相萃取柱可以除去色素類物質，使色譜基線更加平穩(wěn)，而利用80:20的丙酮-正己烷10mL洗脫時，吡蟲啉在活性炭柱上基本無吸附。4.2 色譜條件的選擇枸杞子樣品基質十分復雜，雖然經過凈化處理，仍然含有較多的雜質，所以要通過梯度系統(tǒng)洗脫，才能夠獲得良好的分離，而且通過實驗發(fā)現(xiàn)，在梯度洗脫時，吡蟲啉在乙腈比例降低階段（1018min）出峰比在乙腈比例升高階段（010min）出峰的分離情況要好，但出峰時間太晚則峰形變寬，靈敏度降低。檢測波長選用吡蟲啉的最大紫外吸收波長270 nm，因為吡蟲啉的出峰位置后存在一小的干擾峰，而且最大吸收波長在300nm，而吡蟲啉

29、在300nm基本無紫外吸收，所以選用300nm為參比波長，既可以有效的屏蔽掉干擾峰，又不影響吡蟲啉的靈敏度。參考文獻1ChP (2005). Vol (中國藥典2005年版. 一部) S. 2005: 174.2Kumar J., Prasad B. R., Singh V. S., et al. Imidacloprid residues in rice grains and strawJ. Annals of Plant Protection Sciences, 2005 ,13(1)：249-251.3Ralf SchÖning, Richard Schmuck. Analyt

30、ical determination of imidaclop-rid and relevant metabolite residues by LC MS/MS J. Bulletin of Insectology, 2003, 56(1): 41-50.4Keh Chuh Ting, Eddie Guangming Zhou, Nirmal Saini. Determination of Imidacloprid in Fruits and Vegetables by Liquid Chromatography with Diode Array and Nitrogen-Specific C

31、hemiluminescence DetectionJ. Journal of AOAC.（原載陜西檢驗檢疫科技2008第2期)出濃度為0.01 mg·L-1。以稱取2.0 g枸杞子樣品，定容1.00 mL計算，枸杞子中吡蟲啉殘留的最低檢出限為0.005 mg·kg-1。3.5 樣品測定利用本方法測定了15批枸杞子樣品，提取回收率與色譜分離均良好，其中13批檢出含有吡蟲啉殘留，最低0.012 mg·kg-1，最高0.21 mg·kg-1，只有兩批未檢出。4討論4.1 提取凈化條件枸杞子富含多糖類物質，提取時容易粘結成團，影響提取效率，所以提取前一定要將枸

32、杞子充分粉碎，提取時加入適量的水并劇烈振搖，使多糖類物質溶解，枸杞子基質充分分散，提高提取回收率。選用用乙腈作為提取溶劑，是因為乙腈極性較大，可以減少脂溶性雜質的萃出，而提取是在乙腈-水系統(tǒng)中進行，水溶性雜質的萃出也較少。稱樣量不大于2.5g，否則超過活性炭吸附容量，有較多雜質流出。提取液的凈化考察了硅膠、Florisil硅土、C18、中性氧化鋁、活性炭等固相萃取柱，發(fā)現(xiàn)利用串聯(lián)中性氧化鋁和活性炭固相萃取柱凈化的效果較好，色譜干擾小。利用中性氧化鋁柱凈化時考察了洗脫溶劑的比例和體積，發(fā)現(xiàn)用20:80的丙酮-正己烷10mL洗脫未能將吡蟲啉從萃取柱上洗下，而且能夠觀察到萃取柱上有一明顯的黃色雜質色帶被洗下，用40:60的丙酮-正己烷10 mL洗脫，則有約60 %的吡蟲啉洗下，洗脫