生物樣品預(yù)處理技術(shù)

1、生物體內(nèi)藥物分析的特點生物體內(nèi)藥物分析的特點 常規(guī)藥物分析：常規(guī)藥物分析：原料藥物和藥物制劑分析原料藥物和藥物制劑分析 真?zhèn)舞b別、純度檢查、含量測定真?zhèn)舞b別、純度檢查、含量測定 共存雜質(zhì)、制劑輔料、復(fù)方藥物共存雜質(zhì)、制劑輔料、復(fù)方藥物 生物體內(nèi)藥物分析：復(fù)雜生物樣品的微量分析生物體內(nèi)藥物分析：復(fù)雜生物樣品的微量分析 藥物濃度低藥物濃度低 樣品采量少樣品采量少 干擾成分多干擾成分多 研究對象研究對象 血樣血樣 尿液尿液 唾液唾液 膽汁膽汁 組織器官組織器官預(yù)處理方法預(yù)處理方法 分離分離 純化純化 濃集濃集實驗結(jié)果實驗結(jié)果 測定測定 動物實驗動物實驗 方法學(xué)考察和驗證方法學(xué)考察和驗證 樣品前處理樣

2、品前處理 樣品分析樣品分析 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 具體考慮生物體內(nèi)藥物分析的研究對象即生具體考慮生物體內(nèi)藥物分析的研究對象即生物體內(nèi)樣品，則需要從生物樣品來源、樣品種物體內(nèi)樣品，則需要從生物樣品來源、樣品種類和檢測組分三方面來討論。類和檢測組分三方面來討論。1. 生物樣品來源：決定于研究的目的生物樣品來源：決定于研究的目的 人體與動物人體與動物 2. 生物樣品種類：如體液、器官、組織和排泄物等生物樣品種類：如體液、器官、組織和排泄物等3. 檢測組分：即生物樣品中的藥物及其代謝物等檢測組分：即生物樣品中的藥物及其代謝物等生物樣品來源生物樣品來源臨床前臨床前 吸收試驗吸收試驗 組織分布試驗組織分布試驗

3、 代謝代謝 排泄排泄 毒代動力學(xué)毒代動力學(xué)臨床臨床 臨床藥代動力學(xué)臨床藥代動力學(xué) 制劑生物利用度及生物等效性制劑生物利用度及生物等效性 生物樣品種類生物樣品種類選取的一般原則：生物樣品種類選取的一般原則： （1）必須是能夠反映出濃度與藥物效應(yīng)）必須是能夠反映出濃度與藥物效應(yīng) 之間關(guān)系；之間關(guān)系； （2）易于獲得；）易于獲得； （3）便于處理，適合于分析；）便于處理，適合于分析； （4）根據(jù)不同目的與要求進行選取。）根據(jù)不同目的與要求進行選取。 生物樣品種類可分為生物樣品種類可分為 均勻生物樣品：均勻生物樣品： 血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽

4、汁、 乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等體液乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等體液 呼出氣體呼出氣體 非均勻生物樣品：非均勻生物樣品： 心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮或睪丸、心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮或睪丸、 脂肪、肌肉、皮膚等器官、組織脂肪、肌肉、皮膚等器官、組織 糞便排泄物糞便排泄物生物樣品種類檢測組分即生物樣品中的藥物及其代謝物等即生物樣品中的藥物及其代謝物等 （1 1）原形藥物的測定；）原形藥物的測定； （2 2）游離藥物的監(jiān)測；）游離藥物的監(jiān)測； （3 3）活性代謝產(chǎn)物的監(jiān)測；）活性代謝產(chǎn)物的監(jiān)測； （4 4）藥物對映體的監(jiān)測；）藥物對映體的監(jiān)測； （5

5、5）作用部位藥物濃度的測定；）作用部位藥物濃度的測定； （6 6）體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測定。）體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測定。一、生物樣品的一般處理原則一、生物樣品的一般處理原則 生物樣品貯存生物樣品貯存 生物樣品均勻化生物樣品均勻化 結(jié)合物水解結(jié)合物水解 生物基質(zhì)的性質(zhì)生物基質(zhì)的性質(zhì) 測定對象的性質(zhì)測定對象的性質(zhì)一、生物樣品的一般處理原則一、生物樣品的一般處理原則 生物樣品的貯存生物樣品的貯存 采集哪種生物樣品：血漿、血清、全血、尿、組織采集哪種生物樣品：血漿、血清、全血、尿、組織血漿酯酶引起的水解血漿酯酶引起的水解血漿樣品血漿樣品加入酯酶抑制劑加入酯酶抑制劑微生物導(dǎo)致的腐敗微生物導(dǎo)致的腐敗尿液樣品尿液樣

6、品加入防腐劑冷藏加入防腐劑冷藏 儲存條件儲存條件20：大部分藥物：大部分藥物80：阿莫西林等抗生素：阿莫西林等抗生素加穩(wěn)定劑：卡托普利等加穩(wěn)定劑：卡托普利等 立即測試：維生素立即測試：維生素C等等一、生物樣品的一般處理原則一、生物樣品的一般處理原則 生物樣品均勻化生物樣品均勻化 體液樣品：體液樣品：尿液、血漿尿液、血漿渦旋混勻渦旋混勻 固體樣品：固體樣品：組織、糞便組織、糞便加入適量溶劑進行高速勻漿加入適量溶劑進行高速勻漿一、生物樣品的一般處理原則一、生物樣品的一般處理原則 結(jié)合物水解結(jié)合物水解 相代謝產(chǎn)物如葡萄糖醛酸結(jié)合物、硫酸酯類結(jié)合物相代謝產(chǎn)物如葡萄糖醛酸結(jié)合物、硫酸酯類結(jié)合物 極性大、

7、親水性、不易于提取富集極性大、親水性、不易于提取富集 酸水解：酸水解：簡便、快速，不具備專一性，注意藥物是否簡便、快速，不具備專一性，注意藥物是否被破壞被破壞 酶水解：酶水解：- -葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，專一性強，時葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，專一性強，時間長，實驗費用高間長，實驗費用高二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 預(yù)處理的目的：預(yù)處理的目的： 去蛋白，釋放藥物去蛋白，釋放藥物 樣品純化和富集樣品純化和富集 滿足分析方法靈敏度的需要滿足分析方法靈敏度的需要 防止分析儀器的污染和劣化防止分析儀器的污染和劣化 滿足大量樣品分析的需要滿足大量樣品分析的需要 微量、快速微量、快速二、生物樣品

8、預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 常用的生物樣品預(yù)處理方法常用的生物樣品預(yù)處理方法 沉淀蛋白沉淀蛋白 液液萃取液液萃取 液固提取液固提取二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 沉淀蛋白沉淀蛋白 操作：操作： 50l血漿血漿150 l甲醇甲醇渦旋渦旋1min3500rpm離心離心10min取取上清液進樣分析上清液進樣分析 常用沉淀劑：常用沉淀劑： 與水能混溶的有機溶劑與水能混溶的有機溶劑甲醇、乙腈甲醇、乙腈 酸性沉淀劑酸性沉淀劑三氯醋酸、高氯酸三氯醋酸、高氯酸二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 應(yīng)用中注意問題：應(yīng)用中注意問題： 去蛋白后的上清直接進樣對色譜分離及色譜柱和儀去蛋白后

9、的上清直接進樣對色譜分離及色譜柱和儀器的影響器的影響v 色譜峰形色譜峰形v 液質(zhì)聯(lián)用分析中的基質(zhì)效應(yīng)液質(zhì)聯(lián)用分析中的基質(zhì)效應(yīng) 檢測靈敏度是否足夠檢測靈敏度是否足夠二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 液液萃取液液萃取 操作：操作： 血漿一定體積萃取溶劑血漿一定體積萃取溶劑振蕩振蕩/渦旋萃取渦旋萃取35min3500rpm離心離心10min取上清液氮氣下吹干取上清液氮氣下吹干流動相流動相復(fù)溶后進樣分析復(fù)溶后進樣分析 溶劑的選擇與純度的要求溶劑的選擇與純度的要求 有機溶劑相和水相的體積有機溶劑相和水相的體積 水相的水相的pH 值值二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 常用的液液萃取

10、溶劑：常用的液液萃取溶劑：v 正己烷正己烷v 叔丁基甲醚叔丁基甲醚v 乙醚乙醚v 乙酸乙酯乙酸乙酯v 正丁醇正丁醇* 相似相容原理進行選用相似相容原理進行選用 沸點低、易于揮散和濃集沸點低、易于揮散和濃集 不易乳化、不影響紫外檢測不易乳化、不影響紫外檢測 體積選擇依實驗考察體積選擇依實驗考察極性增加二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 水相的水相的pH值值 水相水相pH值主要由藥物的值主要由藥物的pKa確定確定 對于堿性藥物最佳對于堿性藥物最佳pH值要高于值要高于pKa值值12個個pH單位單位 對于酸性藥物要低對于酸性藥物要低12個個pH單位單位 堿性藥物在堿性堿性藥物在堿性pH值、酸

11、性藥物在酸性值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)值介質(zhì)中提取中提取 血漿加入血漿加入1M NaOH進行堿化后用適合溶劑提取進行堿化后用適合溶劑提取二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 液液萃取的優(yōu)點：液液萃取的優(yōu)點： 選擇性高選擇性高 便于純化和富集便于純化和富集 操作方便操作方便 對儀器的污染小對儀器的污染小 缺點：缺點： 易產(chǎn)生乳化易產(chǎn)生乳化 操作費時，不易于自動化操作費時，不易于自動化二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 液固提取液固提取 固相萃取固相萃取 超聲提取超聲提取對于固體生物樣品，如糞便，組織等，對于固體生物樣品，如糞便，組織等，勻漿處理后，用合適的有機溶劑進行液固萃取

12、，渦勻漿處理后，用合適的有機溶劑進行液固萃取，渦旋振蕩提取或者超聲提取，上清液吹干或者進行第旋振蕩提取或者超聲提取，上清液吹干或者進行第二次液液萃取，以便進一步的純化富集二次液液萃取，以便進一步的純化富集二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 固相萃取固相萃取 操作：操作： 活化活化 上樣上樣 淋洗淋洗 洗脫洗脫 收集收集 直接進樣或者直接進樣或者濃縮后進樣濃縮后進樣與色譜理論相同與色譜理論相同二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處理方法 采用離心或者抽真空的辦法，以一定離心力或者流速，進行上樣、淋洗和洗脫二、生物樣品預(yù)處理方法二、生物樣品預(yù)處

13、理方法 固相萃取的優(yōu)點：固相萃取的優(yōu)點： 無乳化現(xiàn)象無乳化現(xiàn)象 使用溶劑安全價格低廉使用溶劑安全價格低廉 萃取效率高萃取效率高 處理速度快，具有一定通量處理速度快，具有一定通量 易于同時萃取出目標藥物及其代謝產(chǎn)物，包括極性易于同時萃取出目標藥物及其代謝產(chǎn)物，包括極性強的強的相代謝產(chǎn)物相代謝產(chǎn)物 MCX固相萃取柱固相萃取柱 反相作用和陽離子交換反相作用和陽離子交換作用作用 酸性環(huán)境中含氮堿性基酸性環(huán)境中含氮堿性基團與磺酸基結(jié)合團與磺酸基結(jié)合 酸性藥物呈分子狀態(tài)發(fā)酸性藥物呈分子狀態(tài)發(fā)生反相結(jié)合作用生反相結(jié)合作用示例示例 不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法 A：虎杖苷標準對

14、照品：虎杖苷標準對照品 由海王集團技術(shù)中心天然藥物室提供由海王集團技術(shù)中心天然藥物室提供 批號：批號：03050803 3，4，5-三羥基芪三羥基芪-3-D-葡萄糖苷葡萄糖苷 Mr390 B：二苯乙烯苷化學(xué)對照品：二苯乙烯苷化學(xué)對照品 由中國藥品生物制品檢定所提供由中國藥品生物制品檢定所提供 2，3，5，4-四羥基二苯乙烯四羥基二苯乙烯-D-葡萄糖苷葡萄糖苷 Mr406示例示例 不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法 SD大鼠血漿樣品：大鼠血漿樣品：乙腈乙腈沉淀蛋白沉淀蛋白；操作簡便快速，適用于大量樣品；色譜柱污；操作簡便快速，適用于大量樣品；色譜柱污染和不可逆堵塞染和不

15、可逆堵塞 組織和排泄樣品：組織和排泄樣品：0.5mol/L磷酸二氫鈉酸化樣品后，乙酸乙酯磷酸二氫鈉酸化樣品后，乙酸乙酯 正丁醇正丁醇5 1進行進行液液萃??；液液萃?。籔D較大的親水性，常規(guī)溶劑萃取效率很低，較大的親水性，常規(guī)溶劑萃取效率很低，故選擇混合溶劑來提取；富集使得靈敏度提高；吹干時間長故選擇混合溶劑來提??；富集使得靈敏度提高；吹干時間長 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245示例示例 不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法 犬血漿樣品犬血漿樣品：固相萃取固相萃取 0.5mol/L磷酸二氫鈉酸化樣品后，上柱，磷酸二氫鈉酸化樣品后，上

16、柱，20甲醇甲醇淋洗后用淋洗后用100甲醇洗脫，吹干后流動相溶解進樣；同時可以甲醇洗脫，吹干后流動相溶解進樣；同時可以獲得獲得II相代謝產(chǎn)物的富集；易于自動化相代謝產(chǎn)物的富集；易于自動化 色譜柱：色譜柱：DiamonsilTM C18（5m ，2004.6mm） 分析柱前備有分析柱前備有Supelco保護柱保護柱 流動相：甲醇流動相：甲醇-水（水（35 65） 流流 速：速：1.0ml/min 紫外檢測波長：紫外檢測波長：290nm(0.0005aufs) 柱柱 溫：溫：251 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245示例示例 不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法不同

17、生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法 蛋白沉淀蛋白沉淀（SD大鼠血漿）大鼠血漿） 固相萃取固相萃?。ㄈ獫{）（犬血漿）示例示例 不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法不同生物樣品中虎杖苷預(yù)處理方法 液液萃?。I組織）液液萃取（腎組織） 液液萃?。蛞海┮阂狠腿。蛞海┮嘿|(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求 基質(zhì)效應(yīng)的存在基質(zhì)效應(yīng)的存在 基質(zhì)效應(yīng)可認為是樣品中分析物周圍所有成分的集基質(zhì)效應(yīng)可認為是樣品中分析物周圍所有成分的集體干擾行為體干擾行為 除分析物外樣品中所有其它成分所引起的分析誤差，除分析物外樣品中所有其它成分所引起的分析誤差，尤指來自生物樣品中尤指來自生物樣品中未知的或性質(zhì)不確定的成分或未

18、知的或性質(zhì)不確定的成分或體系特性體系特性(如粘密度、離子強度、表面張力等如粘密度、離子強度、表面張力等)所引所引起的干擾起的干擾 基質(zhì)效應(yīng)的程度在不同動物、不同個體來源的樣品基質(zhì)效應(yīng)的程度在不同動物、不同個體來源的樣品之間和在同種基質(zhì)處于不同時期樣品之間都會呈現(xiàn)之間和在同種基質(zhì)處于不同時期樣品之間都會呈現(xiàn)一定的差別一定的差別液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求 不同樣品預(yù)處理技術(shù)對基質(zhì)效應(yīng)的影響不同樣品預(yù)處理技術(shù)對基質(zhì)效應(yīng)的影響 采用柱后灌注法研究采用柱后灌注法研究待測化合物待測化合物預(yù)處理后血漿預(yù)處理后血漿樣品進樣樣品進樣液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求甲

19、醇沉淀蛋白甲醇沉淀蛋白Oasis Oasis 固相萃取固相萃取叔丁基甲醚叔丁基甲醚 液液萃取液液萃取正常離子信號強度正常離子信號強度離子信號增強離子信號增強離子信號抑制離子信號抑制液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求離子抑制嚴重離子抑制嚴重離子增強且不穩(wěn)定離子增強且不穩(wěn)定J Chromatogr B,850(2007):101J Chromatogr B,850(2007):101108108液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求液質(zhì)聯(lián)用對樣品預(yù)處理的要求 選擇合適的樣品預(yù)處理條件選擇合適的樣品預(yù)處理條件合適的蛋白沉淀劑合適的蛋白沉淀劑合適的固相萃取柱合適的固相萃取柱合適的萃取溶劑合適的萃

20、取溶劑 不同不同QC濃度下，對目標化合物引起的基質(zhì)效濃度下，對目標化合物引起的基質(zhì)效應(yīng)方向相同、數(shù)值相近應(yīng)方向相同、數(shù)值相近 對內(nèi)標化合物引起的基質(zhì)效應(yīng)與目標化合物對內(nèi)標化合物引起的基質(zhì)效應(yīng)與目標化合物相差較小、方向一致相差較小、方向一致 在以上條件滿足的基礎(chǔ)上，做到樣品快速預(yù)處理在以上條件滿足的基礎(chǔ)上，做到樣品快速預(yù)處理6%Analysis6%Sample collection61%Sample preparation27661627%Data processing分析過程中的時間消耗分布分析過程中的時間消耗分布三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展 沉淀蛋白后過濾沉淀蛋白后過

21、濾96孔蛋白沉淀板p蛋白沉淀蛋白沉淀p沉淀后離心取上清液沉淀后離心取上清液p沉淀后過濾得上清液沉淀后過濾得上清液Siroccop操作不同操作不同p傳統(tǒng)傳統(tǒng)p50l血漿血漿+200l甲醇（含內(nèi)標甲醇（含內(nèi)標20ng/ml）振搖振搖5min 離心離心15min 取取上清進樣上清進樣pSiroccop200l甲醇（含內(nèi)標甲醇（含內(nèi)標20ng/ml）+ 50l血漿血漿振搖振搖5min 真空抽濾真空抽濾直接直接進樣進樣樣品前處理樣品前處理樣品前處理樣品前處理p減少移液步驟減少移液步驟p減少交叉污染減少交叉污染p減少離心等環(huán)節(jié)，節(jié)省時間減少離心等環(huán)節(jié)，節(jié)省時間三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方

22、法發(fā)展 與傳統(tǒng)的蛋白沉淀相比具有以下優(yōu)點：與傳統(tǒng)的蛋白沉淀相比具有以下優(yōu)點： 引起較小的紫外檢測和質(zhì)譜檢測的干擾引起較小的紫外檢測和質(zhì)譜檢測的干擾 節(jié)約預(yù)處理時間，具有較大樣品通量節(jié)約預(yù)處理時間，具有較大樣品通量 便于實現(xiàn)自動化，便于與便于實現(xiàn)自動化，便于與96孔自動進樣器匹配孔自動進樣器匹配 引起柱壓的較小波動，保護色譜柱引起柱壓的較小波動，保護色譜柱 過濾過濾 離心離心 96孔板樣品前處理孔板樣品前處理 50 l血漿血漿+甲醇甲醇150 l（含內(nèi)標（含內(nèi)標 1 g/ml）振搖振搖5 min2500 g下離心下離心15 min 離心結(jié)束后準確移取上層清液離心結(jié)束后準確移取上層清液100 l至

23、另一至另一96孔板（孔板（350 l），用），用100 l流動相稀釋混勻后置進樣器上進樣流動相稀釋混勻后置進樣器上進樣LC-MS/MS分析分析流動相流動相空白血漿空白血漿標準曲線標準曲線QC樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品空空樣品前處理樣品前處理p采用采用SiroccoSirocco蛋白沉淀板進行前處理和傳統(tǒng)蛋白沉淀的比較蛋白沉淀板進行前處理和傳統(tǒng)蛋白沉淀的比較p離子抑制程度減輕，去除了大多數(shù)極性小的內(nèi)源性物質(zhì)離子抑制程度減輕，去除了大多數(shù)極性小的內(nèi)源性物質(zhì)p絕對回收率提高絕對回收率提高4646示例示例n仲胺仲胺N，顯示弱堿性，游離堿難溶于水，易溶于，顯示弱堿性，游離堿難溶于水，易溶于有機溶劑

24、，鹽可溶于水有機溶劑，鹽可溶于水H2NClClHCH2COHHNCCH3CH3CH3HCl鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅 (Clenbuterol Hydrochloride)苯乙胺類擬腎上腺素藥，苯乙胺類擬腎上腺素藥，-受體激動劑，用于平喘受體激動劑，用于平喘4747示例：示例：血漿血漿中中鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅的測定的測定n取血漿取血漿0.2ml，加入，加入0.1 mol/l NaOH 50l，渦旋混勻后，渦旋混勻后加入加入乙酸乙酯乙酸乙酯2ml液液萃取，渦旋提取液液萃取，渦旋提取3min，離心，離心，取乙酸乙酯層置于另一干凈離心管中，氮氣流下取乙酸乙酯層置于另一干凈離心管中，氮氣流下50水浴

25、揮干，殘余物用水浴揮干，殘余物用50l 流動相流動相溶解后，取溶解后，取10l 進樣進樣LC-MS分析測定。分析測定。由于長期用藥的不良反應(yīng)等，由于長期用藥的不良反應(yīng)等，SFDA已經(jīng)于已經(jīng)于2011年停止生產(chǎn)、年停止生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸克侖特羅片，其他劑型及復(fù)方仍可以使用。銷售和使用鹽酸克侖特羅片，其他劑型及復(fù)方仍可以使用。4848示例：示例：豬肉豬肉中中鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅的測定的測定n鹽酸克侖特羅，俗稱鹽酸克侖特羅，俗稱瘦肉精瘦肉精，具有營養(yǎng)再分，具有營養(yǎng)再分配作用，被不法養(yǎng)殖戶用作藥物促生長添加配作用，被不法養(yǎng)殖戶用作藥物促生長添加劑，提高動物的瘦肉率劑，提高動物的瘦肉率n膳食暴露與

26、膳食暴露與食源性疾病食源性疾病4949示例：豬肉中示例：豬肉中鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅的測定的測定n取取500g有代表性的豬肉可食部分，用組織搗碎機充有代表性的豬肉可食部分，用組織搗碎機充分分搗碎均勻搗碎均勻；n取取2g 搗碎樣品，加入搗碎樣品，加入8ml乙酸鈉緩沖液乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)，再，再加入加入50l-葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶溶液芳基硫酸酯酶溶液，渦旋，渦旋混合，混合，37下避光下避光水浴震蕩水浴震蕩12h。樣品均勻化樣品均勻化綴合物水解綴合物水解5050示例：豬肉中示例：豬肉中鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅的測定的測定n然后加入然后加入0.1mol/l 高氯酸溶液

27、高氯酸溶液5ml，混勻，混勻，用高氯酸用高氯酸調(diào)調(diào)pH至至10.3，離心取，離心取上清液上清液，用氫氧化鈉調(diào)用氫氧化鈉調(diào)pH至至11，加入，加入10ml乙酸乙酯乙酸乙酯-異丙醇混合液和異丙醇混合液和10ml飽和氯飽和氯化鈉溶液化鈉溶液，震蕩，震蕩10min離心，離心，收集有機相，收集有機相，40下水下水浴氮吹浴氮吹，5ml乙酸鈉緩沖液乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)溶解，待凈化。溶解，待凈化。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH，進行液液萃取，進行液液萃取5151示例：豬肉中示例：豬肉中鹽酸克侖特羅鹽酸克侖特羅的測定的測定n取待凈化液過取待凈化液過MCX柱柱(3ml甲醇、甲醇、3ml水水活化活化，待凈化，待凈化液液上樣上

28、樣，再依次用，再依次用3ml水，水，3ml 2%甲醇甲醇-水溶液，水溶液，3ml甲醇淋洗，甲醇淋洗，5ml 5%氨水氨水甲醇溶液洗脫甲醇溶液洗脫)，洗脫液在，洗脫液在40水浴中用氮氣吹，濃縮至水浴中用氮氣吹，濃縮至1ml，再用，再用0.45m濾濾膜過濾，即獲得樣品溶液。膜過濾，即獲得樣品溶液。nMCX柱柱混和弱陽離子交換柱混和弱陽離子交換柱n疏水相互作用疏水相互作用+陽離子交換陽離子交換-兩種作用使藥物保留兩種作用使藥物保留固相萃取固相萃取5252n2g 豬肉豬肉 1ml進樣分析進樣分析FDA/WHO0.2g/kg日本日本0.05g/kg中國中國0.1g/kgFDA/WHO0.4 ng/ml日

29、本日本0.1 ng/ml中國中國0.2 ng/ml方法檢測限量方法檢測限量分析對照品的最低定量限分析對照品的最低定量限生物樣品取樣量多少生物樣品取樣量多少生物樣品前處理方法選擇生物樣品前處理方法選擇三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展 液相微萃取液相微萃取 微滴式微滴式現(xiàn)在常用離子液體為萃取劑，具有粘度大現(xiàn)在常用離子液體為萃取劑，具有粘度大, ,能懸掛成更大的能懸掛成更大的液滴液滴; ;且其揮發(fā)性小且其揮發(fā)性小, ,液滴不易損失液滴不易損失三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展 液相微萃取液相微萃取 中空纖維式中空纖維式將多孔性的中空纖維固定在進樣器的針頭上將多孔

30、性的中空纖維固定在進樣器的針頭上, ,用于保護和容納用于保護和容納有機溶劑有機溶劑, ,同時由于纖維上的多孔性同時由于纖維上的多孔性, ,增加了溶劑與樣品接觸增加了溶劑與樣品接觸的表面積的表面積, ,從而提高了萃取率從而提高了萃取率三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展 固相微萃取固相微萃取 操作原理與操作原理與SPE 近似，操作方法迥然不同近似，操作方法迥然不同 SPME 以熔融石英光導(dǎo)纖維或其它材料為基體支持物，采取以熔融石英光導(dǎo)纖維或其它材料為基體支持物，采取“相似相溶相似相溶”的特點，在其表面涂漬不同性質(zhì)的的特點，在其表面涂漬不同性質(zhì)的高分子固定高分子固定相薄層相薄層，通

31、過直接或頂空方式，對待測物進行，通過直接或頂空方式，對待測物進行提取、富集、提取、富集、進樣和解析。進樣和解析。 SPME 的基本原理和萃取機制可以描述為待測物在介質(zhì)相和的基本原理和萃取機制可以描述為待測物在介質(zhì)相和/ 或頂空相、及萃取纖維相的分配平衡過程，在一定條件下或頂空相、及萃取纖維相的分配平衡過程，在一定條件下達動態(tài)平衡時，涂層吸附的待測物的量與樣品中的濃度成正達動態(tài)平衡時，涂層吸附的待測物的量與樣品中的濃度成正比，以此作為定量分析的依據(jù)比，以此作為定量分析的依據(jù)三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方

32、法發(fā)展三、生物樣品預(yù)處理方法發(fā)展 超濾法超濾法 使用一定孔徑的濾膜，在高速離心力作用下使分子量使用一定孔徑的濾膜，在高速離心力作用下使分子量小的游離藥物隨血漿中的水分一道通過濾膜，但濾膜小的游離藥物隨血漿中的水分一道通過濾膜，但濾膜能阻擋住血漿蛋白和與血漿蛋白相結(jié)合的藥物能阻擋住血漿蛋白和與血漿蛋白相結(jié)合的藥物v測定體內(nèi)游離藥物濃度測定體內(nèi)游離藥物濃度v測定藥時曲線上各點的測定藥時曲線上各點的 血漿蛋白結(jié)合率血漿蛋白結(jié)合率示例：示例：UF-LC/MS/MS方法的建立方法的建立 由于超濾有效的除去了血漿蛋白，血漿水樣品允許由于超濾有效的除去了血漿蛋白，血漿水樣品允許采用直接進樣方法，大大簡化了樣

33、品的處理過程采用直接進樣方法，大大簡化了樣品的處理過程 用于用于 直直 接接 進樣分析的超濾液由血漿在一定的離心進樣分析的超濾液由血漿在一定的離心超濾條件下獲得，為了與超濾條件下獲得，為了與LC/MS分析工作的匹配，分析工作的匹配，濾過液應(yīng)具備一定量的體積以降低分析對檢測靈敏濾過液應(yīng)具備一定量的體積以降低分析對檢測靈敏度的嚴格要求，度的嚴格要求，UF通常更多地在低離心速率通常更多地在低離心速率(300-3000 g和較長的時間內(nèi)和較長的時間內(nèi)(15-60 min)完成，延長濾過完成，延長濾過時間可以提高增加獲得的體積，但犧牲了樣品的分時間可以提高增加獲得的體積，但犧牲了樣品的分析效率。析效率。示例：示例：UF-LC/MS/MS方法的建立方法的建立不同離心力下，不同離心時間后，超濾液的體積和蛋不同離心力下，不同離心時間后，超濾液的體積和蛋白含量（樣品白含量（樣品3737制備）制備）13362g13362g，離心，離心3min3min，大于，大于99%99%的血漿蛋白被截留，濾的血漿蛋白被截留，濾液體積滿足液體積滿足LC/MS/MSLC/MS/MS分析要求分析要求示例：示例：UF-LC/MS/MS方法的建立方法的建立以上條件下，濾液直接進樣對色譜柱柱壓的影響較