流式細(xì)胞術(shù)分析及應(yīng)用ppt課件

1、流式細(xì)胞術(shù)分析及應(yīng)用u流式細(xì)胞術(shù)的原理u流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用u流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)處理u流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備主 要 內(nèi) 容流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是集光電子物理，光電測量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。一、流式細(xì)胞術(shù)的原理現(xiàn)代流式細(xì)胞儀包括 液流系統(tǒng) 聚焦細(xì)胞以供檢測 光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)和收集光信號 電子系統(tǒng) 將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析 液流系統(tǒng) 液流系統(tǒng)將

2、樣本懸液聚焦在光源的中心處Sample Flow in Optical CuvetteSampleLaminarFlowLow Sample Flow Rate12 mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 mL/min樣品和鞘液流Injector TipSheath fluid流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)=激光 (Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照。=激光波長: 臺式機(jī)為固定波長488nm, 635nm ，大型機(jī)波長譜線寬包括 325，

3、 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm=光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡，濾波片，小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)至檢測器。流式細(xì)胞儀的光信號 散射光信號 熒光信號1. 散射光信號前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信號 細(xì)胞相對大小及其表面積。 側(cè)向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信號 細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性。前向角散射光 FSCFALS SensorLaser側(cè)向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser散射光 散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群

4、體的基本形態(tài)上的差異 -通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號 -散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Dot Plotlysed whole blood2. 熒光信號=熒光素吸收激光能量=熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動(dòng)能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子=熒光素與特異抗體結(jié)合=熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強(qiáng)Fluorochrome specificationCompensation二、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 細(xì)胞表型分析 胞內(nèi)蛋白的檢測 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞因子測定 分選 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測量 1.細(xì)胞表型分析2.胞內(nèi)蛋白的檢測3. 細(xì)胞周期的檢測CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀

5、酰亞胺脂） 4.細(xì)胞凋亡的檢測1、熒光信號的面積：對熒光光通量進(jìn)行積分、熒光信號的面積：對熒光光通量進(jìn)行積分 2 、DNA指數(shù)指數(shù)(DI)：相對：相對DNA含量含量= 樣品樣品G0/G1細(xì)胞細(xì)胞DNA含量平均數(shù)含量平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)二倍體標(biāo)準(zhǔn)二倍體DNA量的平均數(shù)量的平均數(shù)3、異倍體：非二倍體，包括近二倍體、異倍體：非二倍體，包括近二倍體、四倍體四倍體、多倍體多倍體、非整倍體非整倍體凋亡細(xì)胞的特點(diǎn) 在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變?。患?xì)胞膜皺折卷曲，密度

6、增高、細(xì)胞體積變小；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞 凋亡細(xì)胞的凋亡細(xì)胞的FSCFSC降低，降低，SSCSSC增加。增加。 細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹， FSCFSC增大，增大，SSCSSC也增大也增大Annexin V AssayAnnexin V AssayAnnexin V/PI雙染雙染活細(xì)胞為（活細(xì)胞為（Annexin V-/PI-）壞死細(xì)胞為（壞死細(xì)胞為（Annexin V+/PI+）凋亡細(xì)胞（凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）Annexin V Assay-能夠區(qū)分死亡與凋亡5、細(xì)胞因子測定+Antigen (cyt

7、okines)Fluorescence Detector antibodyCapture beads Capture antibodyBeadsBeads Provide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different intensitiesMultiplexed BeadsShades of a colorAntibody co

8、upled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector AntibodiesWashAnalyze on flow cytometerCBA Standard curves

9、6、細(xì)胞分選488 nm laser+-Charged PlatesCharged PlatesSingle cells sortedSingle cells sortedinto test tubesinto test tubesFALS SensorFluorescence detector 細(xì)胞分選三、流式細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)處理compensation分析軟件o 常用軟件 FlowJo Gating四、流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備p單細(xì)胞懸液，避免任何細(xì)胞沉積p被檢細(xì)胞或顆粒大小0.240ump樣品中至少20000個(gè)細(xì)胞，濃度105-106個(gè)/毫升抗體的選擇 首選直接標(biāo)記抗體 熒光分子 PE最強(qiáng)，適用

10、于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原 間接標(biāo)記：效果有時(shí)不太好實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)計(jì)空白對照：陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設(shè)同型抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性對照（單標(biāo)） 同型對照(Isotype)：使用與抗體相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于檢測由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。陽性對照：檢測陰性時(shí)表面分子檢測樣品制備將細(xì)胞樣本制成單細(xì)胞懸液，注意懸液內(nèi)不能有粘集，團(tuán)塊，盡量避免多的細(xì)胞碎片。調(diào)整細(xì)胞濃度為5104-1105個(gè)，用PBS洗兩次，用100ulPBS重懸細(xì)胞。加入適量Fc受體阻斷劑（與抗體匹配的動(dòng)物的血清或IgG），4

11、避光放置30分鐘。加入適量的特異性表面標(biāo)記熒光抗體或獨(dú)特型對照抗體，4避光放置30分鐘。用PBS洗兩遍，用200ul固定液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。胞內(nèi)分子檢測的樣品制備收集細(xì)胞，調(diào)至1106細(xì)胞/毫升。4%固定液重懸細(xì)胞，常溫或4避光放置30分鐘。PBS洗去固定液。穿膜液重懸細(xì)胞沉淀，4避光孵育30分鐘。PBS洗兩遍，加200ul穿膜液重懸細(xì)胞，常溫避光放置10分鐘。PBS洗一遍，100ul穿膜液重懸細(xì)胞，加入適量內(nèi)標(biāo)抗體或獨(dú)特型對照抗體，4避光孵育30分鐘。PBS洗兩遍，用200ulPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。謝 謝！后面內(nèi)容直接刪除就行資料可以編輯修改使用資料可以編輯修改使用主要經(jīng)營：網(wǎng)絡(luò)軟件設(shè)計(jì)、圖文設(shè)計(jì)制作、發(fā)布廣告等公司秉著以優(yōu)質(zhì)的服務(wù)對待每一位客戶，做到讓客戶滿意！致力于數(shù)據(jù)挖掘，合同