時間分辨熒光質(zhì)量控制及常見影響因素分析

1、時間分辨熒光時間分辨熒光質(zhì)量控制及常見影響因素分析質(zhì)量控制及常見影響因素分析 大同市第五醫(yī)院檢驗科-王躍平是以采用稀土離子標(biāo)記抗原或抗體、利用發(fā)光信號的強弱可對待分析物進行定量的檢測，其靈敏度可以達到10-18mol/孔。分離特異性及非特異性熒光分離特異性及非特異性熒光,零背景零背景,高高特異性特異性靈敏度高靈敏度高、線性范圍、線性范圍寬寬、重復(fù)性、重復(fù)性好好 零本底、靈敏度高線性范圍寬試劑有效期長試劑價格標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性好自動化高非開放性試劑系統(tǒng)、試劑價格過高。 標(biāo)記差異標(biāo)記差異污染污染免疫檢測分析質(zhì)量控制免疫檢測分析質(zhì)量控制 1 、方法標(biāo)準(zhǔn)化（）實驗方法分類決定性方法準(zhǔn)確度高，系統(tǒng)誤差小，測

2、值接近真值。用途：標(biāo)準(zhǔn)品檢測；參考方法評價 ( 一般不用于常規(guī)工作 )參考方法被決定性方法證實干擾因素少，測量結(jié)果可靠。用途：鑒定常規(guī)方法；質(zhì)控品定值 ( 有條件實驗室可用于常規(guī)工作 )常規(guī)方法有足夠的精密度、準(zhǔn)確性、特異性和適當(dāng)分析范圍。用途：經(jīng)方法評估和學(xué)術(shù)組織認(rèn)可后推薦為常規(guī)方法。例如： HBsAg 定量決定性方法紫外分光光度計測定蛋白參考方法高標(biāo)記率固相放免常規(guī)方法酶標(biāo)（）實驗方法選擇原則實用性：速度快、標(biāo)本用量少、操作簡便、安全可行?？尚判裕壕芏取?zhǔn)確度、敏感性、特異性均達到要求。（）方法的評估敏感性特異性診斷指數(shù)診斷效率陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值2 、試劑標(biāo)準(zhǔn)化（）分級 WHO 國際標(biāo)

3、準(zhǔn)品 WHO 國際參考品國家標(biāo)準(zhǔn)品按國際標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)品，效力單位與嚴(yán)格一致。研究室或廠家標(biāo)準(zhǔn)品暫時用于工作的標(biāo)準(zhǔn)品，自行效價，但有國際標(biāo)準(zhǔn)品后，必須標(biāo)化。免疫學(xué)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和參考品一般用國際標(biāo)準(zhǔn)品或國際參考品標(biāo)化的用于質(zhì)控的物質(zhì)。（）免疫常用國際標(biāo)準(zhǔn)品和參考品免疫學(xué)檢驗質(zhì)控常用國際標(biāo)準(zhǔn)品和參考品三、常用免疫質(zhì)控1 、質(zhì)控一般要求（）標(biāo)本收集及處理每種標(biāo)本有一定收集要求，應(yīng)與臨床醫(yī)生、負(fù)責(zé)取血者及運送標(biāo)本者交代清楚以便配合。有些標(biāo)本要求特殊，應(yīng)特別注意，例如測補體標(biāo)本不能存于室溫或 4 活化影響檢測。 HBeAg 不能反復(fù)凍融，破壞蛋白。（）儀器的校準(zhǔn)與標(biāo)定 在免疫檢測中酶標(biāo)儀是最常使用的儀器

4、，儀器的校準(zhǔn)一定要定時進行（一般使用頻繁不超過半年，一般使用不超過一年）。校準(zhǔn)應(yīng)在儀器購買時請廠家對性能光路等校準(zhǔn)并給出參數(shù)。此時，應(yīng)做功能校準(zhǔn)，選取定值校準(zhǔn)品（含不同滴度及陰、陽標(biāo)本） 4-5 天檢測。其中對實驗影響較大的加樣器及水浴用溫度計均應(yīng)進行計量校準(zhǔn)后使用，前者可采用稱重法校準(zhǔn)，后者可到國家計量單位進行。（）對照及質(zhì)控品對照（一般指陰、陽對照）最好使用與被測樣品同類物質(zhì)。質(zhì)控品一般可來自質(zhì)控控制單位（如：各級臨檢中心），必要時可自制，但最好應(yīng)與有溯源性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行比對。定量者可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。自身抗體等可使用國際通用陽性對照血清。質(zhì)控品一般應(yīng)包括高、中、低三種滴度。2 、免疫方法實驗的

5、質(zhì)控（）實驗前特別要注意標(biāo)本要求不溶血、無乳糜，并注意貯存溫度。儀器應(yīng)做好校準(zhǔn)和標(biāo)定。其免疫分析儀在購買時應(yīng)注意到廠家提供的光路校準(zhǔn)及技術(shù)要求，（注意最好無漂移）。安裝后要進行功能校準(zhǔn)。定性校準(zhǔn)選陰性，高、中、低值陽性血清各 2 份連續(xù)進行 5天檢測。定量校準(zhǔn)在 96 孔板上選 20 處，隨機測定，結(jié)果與標(biāo)定值比較應(yīng)在 2SD 內(nèi)。加樣器應(yīng)定期校準(zhǔn)。水浴箱除對溫度計校準(zhǔn)外，每次實驗時溫度計均應(yīng)復(fù)測。（）實驗中 按校準(zhǔn)程序操作，不得隨意減省操作步驟。質(zhì)控分為室內(nèi)和室間質(zhì)控。一般室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)據(jù)工作量多寡決定間隔時間。質(zhì)控物質(zhì)可購買或自己標(biāo)定，但要注意應(yīng)有高、中、低值陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品。一定要設(shè)立

6、低值者。除定期開展質(zhì)控外，在實驗不穩(wěn)定時要及時做。特別注意要每月做圖總結(jié)。對失控應(yīng)有記錄并分析原因提出處理意見。在判斷失控上可使用 Westgard 規(guī)則，特別要注意以下幾種情況。： l 2S ：一質(zhì)控點在 2S 之外應(yīng)警惕。： R 4S ：連續(xù) 2 個質(zhì)控點相差 4S 。： 4 1S ：連續(xù) 4 個質(zhì)控點落同側(cè) 1S 之外。： X ：連續(xù) 7 個質(zhì)控點落均值一側(cè)。： 7 ：連續(xù) 7 個質(zhì)控點均或同一周期變化。（）實驗后質(zhì)控時還應(yīng)注意收集臨床資料，隨時調(diào)整。（）開展質(zhì)控特別應(yīng)注意的幾個問題試劑盒內(nèi)陰、陽對照與質(zhì)控不完全相等臨界值質(zhì)控品是保證實驗質(zhì)量的關(guān)鍵。作用：控制靈敏度，可測試劑盒靈敏度是否

7、達標(biāo)。：控制精密度，連測 20 次，可獲得均值 和標(biāo)準(zhǔn)差 SD 。做質(zhì)控圖，控制室內(nèi)精密度。室內(nèi)質(zhì)控不合格的失控處理：停止發(fā)放報告。：查找原因：質(zhì)控品是否有效，試劑、儀器及操作等，必要時重校準(zhǔn)儀器，做試劑比對。重新合格后報告負(fù)責(zé)人方能發(fā)出報告。關(guān)于室間質(zhì)控：如部、市均未開展室間質(zhì)評的試驗應(yīng)定時比對 )： 80 以下得分應(yīng)找原因及時糾偏。為什么要設(shè)置質(zhì)控規(guī)則？為什么要設(shè)置質(zhì)控規(guī)則？1.及時發(fā)現(xiàn)檢測系統(tǒng)問題2.能初步分析和找出失控原因3.能不斷的縮小CV（或）總誤差分析前的質(zhì)量控制是關(guān)鍵1、人員培訓(xùn) 操作人員必須具備一定的技術(shù)知識和經(jīng)驗，掌握免疫學(xué)的基本知識和原理2、標(biāo)本采集、標(biāo)本前處理因素分析前

8、質(zhì)量控制（分析前質(zhì)量控制（1）實驗室環(huán)境、設(shè)施和設(shè)備 1、充分合理的空間、良好的照明、空調(diào)及濕度維持設(shè)備 2、儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好。定期維護保養(yǎng)、年度校準(zhǔn)、方法性能驗證？分析前的質(zhì)量控制（分析前的質(zhì)量控制（2）理想的測定試劑和方法 1、質(zhì)量好的數(shù)據(jù) 2、標(biāo)準(zhǔn)的操作程序（SOP） 3、試劑的儲存（溫度記錄和失控處理，溫度計）標(biāo)本采集、標(biāo)本前處理因素標(biāo)本采集、標(biāo)本前處理因素1、標(biāo)本凝固不全（凝集血）2、標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響3、纖維凝塊（促凝劑或抗凝血）4、纖維蛋白（促凝劑或抗凝血）標(biāo)本凝固不全標(biāo)本凝固不全干擾與對策干擾與對策血液通常30min開始凝固，1824h完全凝固。日常檢驗時血液還沒完全凝固

9、就分離血清，此時分離出來的血清中殘留部分纖維蛋白原，檢測結(jié)果易造成假陽性次日復(fù)查時因血凝已完全，血清中不再具有纖維蛋白存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮詫Σ撸貉簶?biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清標(biāo)本管中添加物標(biāo)本管中添加物-干擾與對策干擾與對策 酶抑制劑（如疊氮化鈉（NaN3）可抑制辣根過氧化物酶活性）及快速分離的分離膠等均對免疫測定有一定干擾作用 如果在檢測中，更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進行分析，并應(yīng)采取相應(yīng)的措施排除干擾作用纖維凝塊纖維凝塊-干擾干擾纖維纖維凝塊是由于離心前血清凝固不完凝塊是由于離心前血清凝固不完全所致全所致如果纖維蛋白凝塊隨標(biāo)本分配到試管如果纖維蛋白凝塊隨標(biāo)本分配到試管中，血凝塊

10、產(chǎn)生大量的微顆粒物質(zhì)和中，血凝塊產(chǎn)生大量的微顆粒物質(zhì)和具有細胞凋亡（具有細胞凋亡（AP）活性的物質(zhì)）活性的物質(zhì)細胞凋亡細胞凋亡（AP）活性的物質(zhì)在酶反應(yīng)）活性的物質(zhì)在酶反應(yīng)會產(chǎn)生測試信號，導(dǎo)致假陽性結(jié)果會產(chǎn)生測試信號，導(dǎo)致假陽性結(jié)果微纖維微纖維-干擾干擾當(dāng)血液凝集不充分時產(chǎn)生不成熟纖維即微當(dāng)血液凝集不充分時產(chǎn)生不成熟纖維即微纖維纖維微纖維可與微粒和結(jié)合物連接，引起非特微纖維可與微粒和結(jié)合物連接，引起非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果異性反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果纖維凝塊或微纖維干擾纖維凝塊或微纖維干擾-對策對策采血采血后，正確的混勻，充分的凝集時間和離心后，正確的混勻，充分的凝集時間和離心離心前，血液凝集

11、完全十分重要離心前，血液凝集完全十分重要采血采血 顛倒混勻顛倒混勻 靜置靜置 離心離心 血清或血漿獲取血清或血漿獲取纖維凝塊或纖維干擾（纖維凝塊或纖維干擾（HBsAg)沒有顛倒混勻，顛倒混勻不徹底影響很大離心時間影響也很大，應(yīng)3000rpm離心15min分析中的質(zhì)量控制分析中的質(zhì)量控制 校準(zhǔn)：何時做？如何判斷？校準(zhǔn)失敗如何處理？ 首先進行外部質(zhì)控品的檢測，在控后，在進行患者標(biāo)本檢測 記錄失控數(shù)據(jù)，按照質(zhì)控規(guī)則判斷結(jié)果是否在控 失控：查找原因，重新檢查質(zhì)控 在控：逐一審核報告試劑質(zhì)量影響與對策試劑質(zhì)量影響與對策 試劑盒原材料的純度、組合、來源等也會造成結(jié)果的假陽性或假陰性 試劑靈敏度與特異性也存

12、在一定的差異 試劑應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便、快速的優(yōu)良檢查試劑 國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質(zhì)量評估并定期公布評估結(jié)果 ，可作為選擇試劑的主要依據(jù) 對策：選擇高質(zhì)量的試劑是關(guān)鍵分析后的質(zhì)量控制分析后的質(zhì)量控制結(jié)果審核程序 陽性復(fù)檢（HIV、HCV和TP）肝炎標(biāo)志物結(jié)果分析及報告程序HIV1/2抗體初篩實驗結(jié)果報告程序與臨床的聯(lián)系和溝通室間室間質(zhì)量評價質(zhì)量評價EQA（1）參與室間質(zhì)控網(wǎng)：根據(jù)實驗室的具體情況而定 國際質(zhì)控網(wǎng) 國家質(zhì)控網(wǎng) 省級質(zhì)控網(wǎng) 市級質(zhì)控網(wǎng) 室間質(zhì)量評價室間質(zhì)量評價EQA（2）回報分析不合格PT結(jié)果 的調(diào)查張貼結(jié)果年度回顧分析常見影響因素和

13、常見影響因素和分析分析內(nèi)源性干擾 外源性干擾 其他因素內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾 類風(fēng)濕因子（RF） 自身抗體 補體 嗜異性抗體（如醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(S）抗體） 交叉反應(yīng)物質(zhì) 其他物質(zhì)內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾-RF IgG Fc段上抗原表位的一類自身抗體 患者體內(nèi)的RF能干擾許多免疫學(xué)檢測方法，IgG、IgM型RF可以與免疫檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體及標(biāo)記二抗的Fc段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性或假性升高 RF對不同檢測系統(tǒng)的干擾程度有所差異，影響程度并不與RF的濃度呈正比 目前臨床使用的免疫檢測試劑盒大部分沒有很好的防止RF干擾的措施，國外著名公司要好于國內(nèi)公司內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾自身抗體自身抗體

14、嗜靶抗原的自身抗體，如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等，能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在免疫檢測系統(tǒng)中均可對靶抗原的測定結(jié)果造成負(fù)性干擾 判斷嗜靶抗原的自身抗體對檢測的負(fù)干擾，因緊密結(jié)合患者的疾病診斷、病史、其他實驗室的結(jié)果綜合分析。如甲亢、甲低、1型糖尿病等內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾自身抗體自身抗體自身免疫病，如SLE、SS等感染性疾病會產(chǎn)生自身抗體，如梅毒、HIV等自身抗體干擾對策測定前標(biāo)本需用理化方法將免疫復(fù)合物解離后再測定 內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾補體補體 免疫檢測系統(tǒng)中捕獲抗體在向固相包被和標(biāo)記抗體的標(biāo)記過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其Fc段補體C1q分子結(jié)合位點暴露出來，使C1q可以將二者連接起來，從而造

15、成假陽性 一些公為了增加檢測的敏感性，使用鏈霉親和素包被固相，將捕獲抗體用親和素標(biāo)記，此過程中也可引起捕獲抗體的構(gòu)象發(fā)生改變，造成假陽性或假性升高其他物質(zhì)其他物質(zhì)-干擾與對干擾與對策策血脂質(zhì)過高和血粘度過大等，均對測定結(jié)果有干擾對策： 1、血脂層可用吸管吸取血脂層下血漿 2、血粘度過大導(dǎo)致儀器不測定，可采用手工法進行 3、采用另一種試劑測定內(nèi)源性干擾內(nèi)源性干擾 標(biāo)本溶血 標(biāo)本受細菌污染 標(biāo)本儲存時間過長溶血溶血干擾干擾 溶血的原因很多，只要有體外溶血和體內(nèi)溶血兩種 體外溶血可由物理因素（如機械性破壞、冰凍）、化學(xué)因素（如血樣接觸表面活性劑）和代謝因素（如遺傳病引起的血細胞脆性增加）引起 體外溶血可由物理因素（人工心臟瓣膜或大血管手術(shù)后）、生物因素（如惡性瘧疾）、毒素（如蜂毒素）和藥物毒性反應(yīng)等因素引起溶血溶血-干擾干擾標(biāo)本溶血可導(dǎo)致紅細胞的破壞、血紅蛋白、白細胞碎片和蛋白等釋放出來溶血對免疫檢測的作用不僅是游離血紅蛋白的影響，更多的是細胞碎片和蛋白質(zhì)等其溶血產(chǎn)物；血紅蛋白具有過氧化物酶活性，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，溶血因測定方法的不同可導(dǎo)致對免疫學(xué)檢測的正向或負(fù)向干擾，而影響大小也有所差異標(biāo)本受細菌污染標(biāo)本受細菌污染-干擾和對策干擾和對策 因菌體中可能含有內(nèi)源性過氧化物酶，因此，被細菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，也可產(chǎn)生非特異性顯