第二十三章 囊胚培養(yǎng)-孫正怡

1、囊胚培養(yǎng)北京協(xié)和醫(yī)院 婦產(chǎn)科 生殖中心孫正怡前言世界首例試管嬰兒成功妊娠的患者，移植的胚胎就是囊胚期胚胎。但是多年來(lái)IVF實(shí)踐中，大多數(shù)醫(yī)生仍然選擇在卵裂期進(jìn)行移植。這么做的主要原因是無(wú)法確保將胚胎進(jìn)行培養(yǎng)后能否形成囊胚。上世紀(jì)九十年代后，通過(guò)動(dòng)物胚胎的研究，人們對(duì)胚胎的營(yíng)養(yǎng)需求有了更深刻的理解，建立了序貫培養(yǎng)的概念，從而使得囊胚形成率有了大幅度改善，接受IVF治療的患者更易于從囊胚培養(yǎng)中獲益。囊胚培養(yǎng)的目的囊胚培養(yǎng)的最主要目的是改善IVF治療的妊娠率IVF。囊胚培養(yǎng)具有篩選胚胎的作用。經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)后，形成囊胚的胚胎，非整倍體比例明顯低于第三天胚胎。另外由于胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更好，也

2、有利于提高妊娠率。對(duì)于一名婦女經(jīng)過(guò)IVF治療得到的一批胚胎，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)可以篩選出發(fā)育潛能最好的一部分胚胎，從而使妊娠率保持一定水平的基礎(chǔ)上，減少移植和冷凍胚胎的數(shù)量，減少多胎的發(fā)生，并降低治療費(fèi)用。囊胚培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)與風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)勢(shì)囊胚的種植率高于卵裂期胚胎，從而可以減少移植胚胎數(shù)量，移植時(shí)內(nèi)膜與胚胎發(fā)育更為同步，Papanikolaou 等發(fā)現(xiàn)HCG日P值升高對(duì)第三天的植入率有不良影響，而到了第5天，影響明顯減小。第三天極度黃素化的內(nèi)膜狀態(tài)會(huì)影響卵裂期胚胎發(fā)育到囊胚。而囊胚受這種影響則較小。子宮腔內(nèi)pH值較輸卵管內(nèi)低。早期胚胎對(duì)酸度的適應(yīng)能力較差，而囊胚對(duì)酸度的適應(yīng)功能較好。因此在囊胚期時(shí)移植，胚胎

3、的存活率較高。染色體異常比例下降。Day3的“優(yōu)質(zhì)胚胎”，有60左右發(fā)育為囊胚，40不能發(fā)育為囊胚，卵裂期的優(yōu)質(zhì)胚胎，有60可能為非整倍體，而發(fā)育到囊胚的胚胎，非整倍體率降為30左右。進(jìn)行囊胚培養(yǎng)由于培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，利于PGD的進(jìn)行，尤其是結(jié)合使用array CGH等較為先進(jìn)的診斷技術(shù)，可以大大提高胚胎的種植率。風(fēng)險(xiǎn)取消移植：由于至今仍缺乏有效的指標(biāo)判斷卵裂期胚胎發(fā)育成囊胚的能力，所以，即使卵裂期胚胎形態(tài)良好，也難以避免無(wú)囊胚移植的風(fēng)險(xiǎn)。通常使用的預(yù)測(cè)指標(biāo)是卵裂球的數(shù)目和碎片的量，有文獻(xiàn)證實(shí)這兩種指標(biāo)和囊胚的形成率有一定關(guān)系。但是，患者之間囊胚形成的比例差異極大，因此，如果不加篩選的進(jìn)行囊胚培養(yǎng)

4、，會(huì)導(dǎo)致大量的取消移植。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可能會(huì)導(dǎo)致基因甲基化修飾異常的風(fēng)險(xiǎn)增加。但由于目前此類疾病發(fā)生比例極低，相關(guān)報(bào)道還不足以證實(shí)囊胚培養(yǎng)與甲基化異常疾病之間的關(guān)系。性別比（男性增加）改變：有多篇文獻(xiàn)提示囊胚移植后男性嬰兒比例增加，但是也有一些文獻(xiàn)的結(jié)果不支持這一結(jié)論。性別比改變的機(jī)制也沒(méi)有完全闡明，是培養(yǎng)液造成的，還是不同性別的胚胎形態(tài)質(zhì)量不同，仍不確定。單卵雙胎：自然妊娠的單卵雙胎幾率約為200330分之一，有報(bào)道認(rèn)為囊胚培養(yǎng)增加單卵雙胎的幾率（Behr 2000）。單卵雙胎導(dǎo)致流產(chǎn)、先天畸形（高達(dá)10）、雙胎輸血綜合癥、甚至聯(lián)體雙胎，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物單卵雙胎的基因印記異常發(fā)生率更加增高。囊胚

5、培養(yǎng)導(dǎo)致單卵雙胎比例增加可能與培養(yǎng)導(dǎo)致透明帶改變，從而影響孵出有關(guān)。囊胚培養(yǎng)的方法培養(yǎng)方案與其他細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的技術(shù)，由于技術(shù)復(fù)雜已經(jīng)基本被淘汰。目前最常用的囊胚培養(yǎng)的方法是序貫培養(yǎng)。所謂序貫培養(yǎng)是根據(jù)體外培養(yǎng)的胚胎在不同發(fā)育時(shí)期代謝需求的不同，依次采用適合該時(shí)期營(yíng)養(yǎng)需要的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。目前世界范圍內(nèi)各個(gè)主要的培養(yǎng)液生廠商均有相應(yīng)的囊胚培養(yǎng)液商品化供應(yīng)。在取卵后72小時(shí)，經(jīng)過(guò)胚胎形態(tài)評(píng)估后，將卵裂期胚胎按照形態(tài)分組，類似形態(tài)的胚胎放置在同一囊胚培養(yǎng)液的液滴中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)大氣中氧氣的濃度為21%，在氧氣濃度未加控制的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，氧氣濃度約為20%，雖然在此條件下，卵裂期胚胎也有相當(dāng)?shù)谋?/p>

6、例能夠形成囊胚，但是如果采用低氧培養(yǎng)，將氧氣濃度降至5%，囊胚形成率能夠有一定程度的提高，而且囊胚質(zhì)量會(huì)有明顯改善。集合培養(yǎng)集合胚胎培養(yǎng)是指在單個(gè)培養(yǎng)液滴內(nèi)將多個(gè)胚胎放在一起培養(yǎng)。胚胎分泌的一些生長(zhǎng)因子具有自分泌和旁分泌作用，利于胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，但不如集合培養(yǎng)的胚胎生存力強(qiáng)，胚胎量多時(shí)比少時(shí)易于培養(yǎng)。 鼠胚試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)當(dāng)10個(gè)左右的胚胎一起培養(yǎng)，可以獲得更好的卵裂率及囊胚形成率。人胚胎的集合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)相比，致密化率及囊胚形成率均有提高。集合培養(yǎng)組獲得的囊胚質(zhì)量更好，因此得到的囊胚活產(chǎn)率更高。推薦的集合培養(yǎng)方法是在30ul50ul囊胚培養(yǎng)液液滴內(nèi)放置35枚胚胎。囊胚的觀察方法及形態(tài)學(xué)評(píng)分囊胚

7、培養(yǎng)過(guò)程中，囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分非常重要，評(píng)分后便于衡量囊胚的質(zhì)量，選擇移植或冷凍的胚胎。目前世界范圍內(nèi)主要采用的評(píng)分方法是Gardner和Schoolcraft在1999介紹的評(píng)分方法，該方法對(duì)囊胚的擴(kuò)張狀態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層 (TE)進(jìn)行評(píng)分，2011年的伊斯坦布爾共識(shí)(Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011)，對(duì)囊胚的評(píng)價(jià)采用的主要還是這種評(píng)分方法。雖然胚胎發(fā)育到囊胚后，非整倍體的比例下降，但是仍存在一定比例的非整倍體胚胎，而囊胚的形

8、態(tài)學(xué)評(píng)分并不能可靠地估計(jì)非整倍體現(xiàn)象的存在。觀察時(shí)間卵母細(xì)胞受精后第5天有可能發(fā)育到囊胚期，細(xì)胞間開(kāi)始形成囊腔，內(nèi)充滿液體。形成囊胚后，細(xì)胞出現(xiàn)首次分化，形成滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞兩種不同的細(xì)胞成分。滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞形成連續(xù)的一層，圍成一個(gè)球面，襯于透明帶內(nèi)側(cè)。在滋養(yǎng)細(xì)胞層內(nèi)側(cè)，可以看到明顯的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，質(zhì)量良好的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是個(gè)由許多細(xì)胞形成的致密細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)60個(gè)以上。但是由于不同質(zhì)量的胚胎發(fā)育速度不一致，有的胚胎有可能在受精后第6天、第7天甚至更晚才形成囊胚。已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)證實(shí)，較早形成的囊胚發(fā)育潛能可能較佳，移植后可以獲得更好的妊娠率，第7天及以后形成的囊胚，染色體異常的幾率增加。有

9、一些文獻(xiàn)認(rèn)為第5天和第6天形成的囊胚，如果質(zhì)量接近，則可以獲得類似的妊娠結(jié)局。第7天及更晚形成的囊胚依然有少數(shù)獲得妊娠并分娩正常新生兒的病例報(bào)告。目前國(guó)內(nèi)外的共識(shí)是囊胚的觀察時(shí)間應(yīng)該在受精后第5天第6天。觀察方法胚胎發(fā)育到囊胚階段后，隨著囊胚腔的擴(kuò)張，囊胚的直徑會(huì)逐漸增大，從受精卵的160um左右增加到180230um左右。透明帶逐漸變薄。在使用倒置顯微鏡觀察囊胚時(shí)，由于40物鏡的景深有限，僅能看清少數(shù)幾層細(xì)胞（20um左右）厚度內(nèi)的結(jié)構(gòu)，因此為了清楚而全面地觀察囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量，需要調(diào)整物鏡的高低，從囊胚的頂部觀察到底部，獲得囊胚質(zhì)量的全面印象。物鏡聚焦在囊胚中部可以看清滋養(yǎng)

10、細(xì)胞的側(cè)面，呈鐮刀狀、新月形或梭形，質(zhì)量好的滋養(yǎng)細(xì)胞層細(xì)胞大小較為一致，沿透明帶內(nèi)側(cè)均勻規(guī)則排列?？梢詫?duì)這一“赤道面”上的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行大小的測(cè)量和計(jì)數(shù)。聚焦在囊胚頂部或底部時(shí)，可以清楚地觀察到滋養(yǎng)細(xì)胞的正面，呈近似的圓形或多邊形，并能夠很容易觀察到滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核以及核仁。質(zhì)量良好的滋養(yǎng)細(xì)胞層，滋養(yǎng)細(xì)胞大小一致，近似六邊形，互相鑲嵌呈鋪路石樣。由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)往往位于囊胚的底部，將物鏡聚焦到此高度，可以清楚觀察到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的大小、細(xì)胞組成和折光情況，對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)大小進(jìn)行測(cè)量也比較容易 評(píng)分方法（一）囊胚腔擴(kuò)張的程度囊胚腔擴(kuò)張程度的判斷，對(duì)于下一步評(píng)價(jià)滋養(yǎng)細(xì)胞層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的質(zhì)量以及決定對(duì)囊胚的操作都非常

11、重要。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵化將囊胚的發(fā)育分為六個(gè)時(shí)期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。（二）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的大小與質(zhì)量，與種植率存在密切關(guān)系。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)微呈卵圓形，在囊胚發(fā)育到3期以后，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的大小變化不明顯。1期、2期的早期囊胚，由于囊腔較小，難以準(zhǔn)確區(qū)分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的界限。質(zhì)量良好的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)直徑通常在6080um左右

12、。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)較小、細(xì)胞連接松散或能觀察到退化壞死的細(xì)胞，則質(zhì)量不理想，種植率降低或染色體異常的可能性更大。因此，處于3至 6期的囊胚，應(yīng)對(duì)其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí)：A級(jí)：細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級(jí)：細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級(jí)：細(xì)胞數(shù)目很少。（三）滋養(yǎng)層細(xì)胞的分級(jí)由于滋養(yǎng)細(xì)胞的分裂速度比較快，因此曾有人認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量對(duì)于種植率影響不大，但是最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量，對(duì)種植率有重要影響，甚至多篇文獻(xiàn)認(rèn)為其質(zhì)量的好壞對(duì)種植率的影響大于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量的作用。3至 6期的囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞分級(jí)：A級(jí)：上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級(jí)：上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；

13、C級(jí)：上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成。（四）其它評(píng)價(jià)內(nèi)容人類囊胚分級(jí)系統(tǒng)的主觀性仍較強(qiáng)，迫切需要一個(gè)統(tǒng)一的量化指標(biāo)對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)界定。另外，在觀察囊胚時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)其他一些情況，未被包含在人類囊胚分級(jí)系統(tǒng)的描述中?！景櫩s的囊腔】 有時(shí)觀察囊胚時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)部分囊胚的囊腔塌陷，或稱為皺縮。此時(shí)難以對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)估。實(shí)際上，多數(shù)囊胚從早期發(fā)育到完全孵出（3期到6期）的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生多次囊胚的自然皺縮和恢復(fù)擴(kuò)張，但是皺縮狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間很短，通常不超過(guò)1小時(shí)，因此觀察到皺縮狀態(tài)的機(jī)會(huì)較少。對(duì)于這種囊胚，可以等待1小時(shí)，待囊腔擴(kuò)張后進(jìn)行重新評(píng)分。如能夠重新擴(kuò)張，則對(duì)種植率幾乎無(wú)影響?！舅?/p>

14、片】在卵裂期胚胎內(nèi)的碎片，有一部分在發(fā)育過(guò)程中吸收，但有部分在隨后的胚胎致密化過(guò)程中，被致密化的細(xì)胞團(tuán)排除在外，隨著囊腔的形成，被擠壓在滋養(yǎng)細(xì)胞層和透明帶之間，如果囊胚腔塌陷，則更容易分辨，這些碎片附著于透明帶。在隨后囊胚孵出的過(guò)程中，這些碎片殘留在透明帶內(nèi)，不參與后續(xù)的胚胎發(fā)育與著床。由于胚胎從受精后發(fā)育到囊胚的階段，來(lái)自卵母細(xì)胞提供的原生質(zhì)總量沒(méi)有增加，因此碎片的存在，往往伴隨著滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)量與形態(tài)評(píng)分的下降。【大細(xì)胞】部分胚胎在致密化過(guò)程中，還有可能將整個(gè)細(xì)胞排斥在外，或者包裹在其內(nèi)部，囊腔形成后，這些大細(xì)胞存在于囊胚內(nèi)或囊腔外。與碎片類似，這種情況，通常對(duì)種植率沒(méi)有明顯影響

15、，但是大細(xì)胞的存在，往往伴隨著囊胚滋養(yǎng)細(xì)胞層或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分的下降。1. GardenerDK， Schoolcraft WB. In vitro culture of human blastocyst. In: Jansen R, Mortimer D, eds. Towards Reproductive Certainty :Infertility and Genetics Beyond 1999. Carnforth:Parthenon Press, :3782. Guerif F, Le Gouge A, Giraudeau B, et al. Limited value of morp

16、hological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: a prospective study based on 4042 embryos. Hum Reprod 2007;22:1973-813. Gardner DK, Stevens J, Sheehan CB, et al. Morphological assessment of the human blastocyst. In: Elder KT, Cohen J, eds. Analysis of the Human Embryo. Londo