DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷史與

1、 在2002年4月，美國(guó)科學(xué)雜志 ，登載了一篇長(zhǎng)達(dá)14頁的論文尤其引人注目水稻（秈稻）基因組的工作框架序列圖。 2004年12月，水稻基因組“精細(xì)圖”全部完成 2004年12月10日，中國(guó)科學(xué)家在世界上率先完成的家蠶基因組“框架圖”及基因組生物學(xué)分析成果在世界科學(xué)類權(quán)威的學(xué)術(shù)期刊Science雜志上發(fā)表。 2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜完成的大熊貓基因測(cè)序。 第一代DNA測(cè)序技術(shù) 三種測(cè)序方法的原理第二代DNA測(cè)序技術(shù) 三個(gè)測(cè)序平臺(tái)的工作原理及操作步驟第三代DNA測(cè)序技術(shù) 單分子測(cè)序的特點(diǎn)及應(yīng)用前景第一代DNA測(cè)序技術(shù)成熟的DNA測(cè)序技術(shù)始于20世紀(jì)70

2、年代中期。1977年Maxam 和Gilbert報(bào)道了通過化學(xué)降解測(cè)定DNA序列的方法。同一時(shí)期, Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法 20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)將DNA測(cè)序帶入自動(dòng)化測(cè)序的時(shí)代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNADNA測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)。化學(xué)降解法 在該方法中,一個(gè)末端被放射性標(biāo)記的DNA片段在5組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別被部分降解,其中每一組反應(yīng)特異地針對(duì)某種堿基。因此生成5組放射性標(biāo)記的分子,每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子,其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA片段上的位置。最后,各組混合物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,再通過放射自顯

3、影來檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸( dNTP,其中的一種用放射性P32標(biāo)記)存在條件下復(fù)制時(shí),在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP) ,因?yàn)殡p脫氧核苷沒有3 -OH,所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長(zhǎng),若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后,分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳,分離長(zhǎng)短不一的核酸片段,長(zhǎng)度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3端的雙脫氧核苷,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。熒光自動(dòng)測(cè)序

4、技術(shù) 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理,用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記,并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè),從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。第二代DNA測(cè)序技術(shù) 羅氏454 公司的GS FLX測(cè)序平臺(tái) Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái) AB I公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái) 454測(cè)序技術(shù)具體步驟 文庫(kù)準(zhǔn)備：將基因組DNA 打碎成300 -800 bp長(zhǎng)的片段(若是snRNA或PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)入下一步) ,在單鏈DNA的3端和5 端分別連上不同的接頭。 連接：帶有接頭的單鏈DNA 被固定在DNA 捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶一個(gè)單鏈DNA片段。隨后擴(kuò)增試劑將磁珠

5、乳化,形成油包水的混合物,這樣就形成了許多只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。 擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增(乳液PCR, emulsion PCR) ,從而排除了其它序列的競(jìng)爭(zhēng)。整個(gè)DNA 片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言,擴(kuò)增產(chǎn)生幾百萬個(gè)相同的拷貝。乳液PCR終止后,擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。 測(cè)序：攜帶DNA 的捕獲磁珠被放入PTP板中進(jìn)行測(cè)序。PTP孔的直徑(29m)只能容納一個(gè)磁珠(20m) 。放置在4個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的4種堿基,依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板,每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì),就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在

6、ATP 硫酸化酶和熒光素酶的作用下,釋放出光信號(hào),并實(shí)時(shí)地被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì),就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào);由此一一對(duì)應(yīng),就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。454測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)速度快 一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)10 h，獲得4 6 億個(gè)堿基對(duì)。比傳統(tǒng)的Sanger 測(cè)序的方法快100 倍;讀長(zhǎng)長(zhǎng) 單條序列的讀長(zhǎng)平均可達(dá)到450 bp;通量高 每個(gè)反應(yīng)可以得到超過100萬個(gè)序列讀長(zhǎng);準(zhǔn)確度高 讀長(zhǎng)超過400 bp 時(shí)，單一讀長(zhǎng)的準(zhǔn)確性可以超過99% ;可以進(jìn)行Pair-End 測(cè)序研究。Solexa測(cè)序技術(shù)的原理 基本原理是將基因組DNA打碎成約100 -

7、200個(gè)堿基的小片段,在片段的兩個(gè)末端加上接頭( adap ter) 。將DNA片段變成單鏈后通過接頭與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)而使一端被固定在芯片上。另外一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ),也被固定住,形成橋狀結(jié)構(gòu)。通過30輪擴(kuò)增反應(yīng),每個(gè)單分子被擴(kuò)增大約1 000倍,成為單克隆的DNA簇,隨后將DNA簇線性化。 在下一步合成反應(yīng)中,加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。在DNA合成時(shí),每一個(gè)核苷酸加到引物末端時(shí)都會(huì)釋放出焦磷酸鹽,激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反應(yīng)板表面,在讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類后,將這些熒光基團(tuán)化學(xué)切割,恢復(fù)3端黏性,隨后添加第

8、二個(gè)核苷酸。如此重復(fù),直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣,統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果,就可以得知每個(gè)模板DNA 片段的序列。Solexa測(cè)序技術(shù)路線：Solexa測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)通量高。目前一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G 的數(shù)據(jù);準(zhǔn)確率高。98. 5% ，同時(shí)也有效地解決了多 聚重復(fù)序列的讀取問題;成本低。低于傳統(tǒng)Sanger 測(cè)序技術(shù)成本的1% ;DNA 序列的讀取長(zhǎng)度不斷增加，當(dāng)前單條序列讀長(zhǎng)可達(dá)到150 bp;可以進(jìn)行Pair-end( PE) 雙向測(cè)序，PE 文庫(kù)插入片段大小范圍可由150 bp 到10 kb。正確選擇插入片段長(zhǎng)度有利于高重復(fù)序列含量基因組的組裝，這進(jìn)一步擴(kuò)展

9、了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。SOLiD測(cè)序技術(shù)路線 SOLiD測(cè)序技術(shù)的具體步驟 文庫(kù)準(zhǔn)備：SOL iD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板:片段文庫(kù)( fragment library) 或配對(duì)末端文庫(kù)(mate2paired library) 。片段文庫(kù)就是將基因組DNA打斷,兩頭加上接頭,制成文庫(kù)。配對(duì)末端文庫(kù)是將基因組DNA打斷后,與中間接頭連接,環(huán)化,然后用EcoP15酶切,使中間接頭兩端各有27 bp的堿基,最后加上兩端的接頭,形成文庫(kù)。 擴(kuò)增：SOLiD用的是與454技術(shù)類似的乳液PCR對(duì)要測(cè)序的片段進(jìn)行擴(kuò)增。在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物,進(jìn)行乳液PCR ( emulsion

10、PCR) 。PCR反應(yīng)結(jié)束后,磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同一DNA模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。 微珠與玻片連接：乳液PCR完成之后,變性模板,富集帶有延伸模板的微珠,微珠上的模板經(jīng)過修飾,可以與玻片共價(jià)結(jié)合。SOL iD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠,在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面, SOL iD測(cè)序反應(yīng)就在SOL iD玻片表面進(jìn)行。每個(gè)磁珠經(jīng)SOL iD 測(cè)序后得到一條序列。 連接測(cè)序：SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。探針的5端用4種顏色的熒光標(biāo)記,探針3端第1、2位堿基是ATCG 4種堿基中的任何兩種堿基組成的堿

11、基對(duì),共16 種堿基對(duì),因此每種顏色對(duì)應(yīng)著4種堿基對(duì)。3 - 5位是隨機(jī)的3個(gè)堿基。6 - 8位是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。單向SOL iD測(cè)序包括5輪測(cè)序反應(yīng),每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng),得到原始顏色序列。SOL iD序列分析軟件根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列,然后與SOLiD 原始顏色序列進(jìn)行比較。由于雙堿基編碼規(guī)則中一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì),前面堿基對(duì)的第二個(gè)堿基是后面堿基對(duì)的第一個(gè)堿基,所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起連鎖的解碼錯(cuò)誤,改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。SOL iD序列分析軟件可以對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行自動(dòng)校正,最后“解碼”成原始序列。因?yàn)镾OL iD系統(tǒng)采用了

12、雙堿基編碼技術(shù),在測(cè)序過程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍,從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤,提供內(nèi)在的校對(duì)功能, 得到的原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94% ,而在15X 覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999% ,是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的SOLiD測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)可制備Mate-paired 文庫(kù)測(cè)序，插入片段范圍600 bp 10 kb;通量高，每臺(tái)SOLiDTM 4 System 測(cè)序儀在15 天內(nèi)能夠獲得100G的數(shù)據(jù)量;采用Primer reset 方式，保證了較低的噪音，失敗的Round 可以重做;測(cè)序時(shí)采用連接反應(yīng)，穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確性高，有效地解決了多聚核苷酸序列困難讀取的問題;每個(gè)DNA 堿

13、基檢測(cè)2次，這增加了序列讀取的準(zhǔn)確性;2-base encoding 可以用來鑒別SNP。三種第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比測(cè)序技術(shù)454454SolexaSolexaSOLiDSOLiD上市時(shí)間200520072007價(jià)格（萬美元，2007）504559單次反應(yīng)數(shù)據(jù)量0.42050讀長(zhǎng)（bp）40050*250優(yōu)勢(shì)長(zhǎng)讀長(zhǎng)低測(cè)序成本，高性價(jià)比高通量，高準(zhǔn)確度第三代DNA測(cè)序技術(shù) 第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫(kù)的時(shí)候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測(cè)序的讀長(zhǎng)普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納

14、米孔為標(biāo)志的第三代測(cè)序技術(shù)。 1. Helicos公司公司 Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，檢測(cè)上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測(cè)序。

15、Heliscope的讀取長(zhǎng)度約為30-35 nt，每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21-28 Gb。 2. Pacific Biosciences公司公司 Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的思想，以SMRT芯片為測(cè)序載體進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度為100 nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)

16、出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級(jí)）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（ 微秒級(jí)） 相比會(huì)很長(zhǎng)，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進(jìn)入熒光型號(hào)檢測(cè)區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。 3. Oxford Nanopore Technologies公司公司 Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號(hào)測(cè)序的技術(shù)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種以-溶血素為材料制作的納米孔

17、，在孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時(shí)，被切下來的單個(gè)堿基會(huì)落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。 中國(guó)機(jī)構(gòu)主要承擔(dān)和參與已完成的動(dòng)植物基因組測(cè)序項(xiàng)目 物種 國(guó)內(nèi)主要承擔(dān)機(jī)構(gòu) 人 中國(guó)科學(xué)院華大基因研究中心等 水稻 中國(guó)科學(xué)院華大基因研究中心等 家蠶 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所和 華大基因研究中心等 家雞 中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所和華大基因研究中心等 人 深圳華大研究院等 血吸蟲 南方基因中心等 黃瓜 深圳華大研究院等 大熊貓 深圳華大研究院等 螞蟻 深圳華大研究院等總結(jié)與展望總結(jié)與展望 三代測(cè)序技術(shù)的原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。 第一代測(cè)序技術(shù)第一代測(cè)序技術(shù)憑借其長(zhǎng)的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對(duì)新物種進(jìn)行基因組長(zhǎng)距框架的搭建以及后期GAP填補(bǔ)，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測(cè)序工作。 第二代測(cè)序技術(shù)中第二代測(cè)序技術(shù)中，454序列片段最長(zhǎng)，比較適合對(duì)未知基因組從頭測(cè)序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價(jià)位低的特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組的測(cè)序和重測(cè)序。Solexa雙末端測(cè)序(paired-end sequencing)可以為基因組進(jìn)一步拼接提供定位信