免疫組化技術(shù)

1、免疫組化技術(shù)第一頁，共72頁。主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、熒光的特征一、熒光的特征二、熒光素二、熒光素三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定五、免疫熒光組化染色方法五、免疫熒光組化染色方法六、熒光顯微鏡六、熒光顯微鏡七、非特異性熒光的消除方法七、非特異性熒光的消除方法 八、激光掃描共聚焦顯微鏡八、激光掃描共聚焦顯微鏡第二頁，共72頁。思考題：思考題： 1.1.什么叫熒光？什么叫熒光？ 2.2.常用熒光素有哪些特征？常用熒光素有哪些特征？ 3.3.標(biāo)記熒光抗體有哪二種主要的制備標(biāo)記熒光抗體有哪二種主要的制備方法？方法？第三頁，共72頁。 4. 4.免

2、疫熒光組化直接法、間接法的免疫熒光組化直接法、間接法的 原理和主要操作流程？原理和主要操作流程？ 5.5.觀察熒光組化片時應(yīng)注意哪些問題？觀察熒光組化片時應(yīng)注意哪些問題？ 6.6.非特異性熒光的消除方法有哪幾種？非特異性熒光的消除方法有哪幾種？第四頁，共72頁。一、熒光的特征一、熒光的特征 分子都含有電子，電子在不停地運動著。分子都含有電子，電子在不停地運動著。根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨

3、著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。第五頁，共72頁。第六頁，共72頁。激發(fā)激發(fā) 當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級，當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級， 這個過程叫激發(fā)。這個過程叫激發(fā)。發(fā)射發(fā)射 以輻身方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相以輻身方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相 應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。第七頁，共72頁。熒光熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻身激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻身方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很

4、短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。發(fā)射光，叫熒光。第八頁，共72頁。二、熒光素二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。射熒光。第九頁，共72頁。 1 1、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及基團，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。其降解產(chǎn)物易排除。第十頁，共72

5、頁。(2)(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。素質(zhì)量下降不多。(3)(3)標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化 性質(zhì)無影響。性質(zhì)無影響。(4)(4)結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。第十一頁，共72頁。(5)(5)熒光素容易溶解，溶解后不會和其熒光素容易溶解，溶解后不會和其 他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏 色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。第十二頁，共72頁。2.熒光素的種類熒光素的種類(1

6、)(1)異硫氰酸熒光黃（異硫氰酸熒光黃（FITCFITC）：分子量）：分子量390D390D，最大吸收光譜為最大吸收光譜為490490495nm495nm，最大發(fā)射光譜，最大發(fā)射光譜為為520520530nm530nm。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，分。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，分子量子量389.4389.4。第十三頁，共72頁。第十四頁，共72頁。(2)(2)四甲基異硫氰酸羅達明（四甲基異硫氰酸羅達明（TRITCTRITC）是）是羅達明的衍生物，易溶于水，最大吸收羅達明的衍生物，易溶于水，最大吸收光譜為光譜為550nm550nm，最大發(fā)射光譜為，最大發(fā)射光譜為620nm620nm，呈橙紅色熒光。呈橙紅色

7、熒光。第十五頁，共72頁。第十六頁，共72頁。第十七頁，共72頁。(3)(3)四乙基羅達明四乙基羅達明(RB200) (RB200) 呈褐紅色粉末呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長狀，溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜期保存。最大吸收光譜570nm570nm，最大發(fā)射，最大發(fā)射光譜光譜596596600nm600nm，呈明亮橙紅色熒光，呈明亮橙紅色熒光，分子量分子量580580，RB200RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)合，要先經(jīng)五氯化磷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成硫酰合，要先經(jīng)五氯化磷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成硫酰氯，再與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。氯，再與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。第十八頁，共7

8、2頁。第十九頁，共72頁。第二十頁，共72頁。(4)1-(4)1-二甲基氨基二甲基氨基-5-5-硫酰氯硫酰氯(5)4-(5)4-乙酰胺乙酰胺-4-4-異硫氰酸異硫氰酸-2-2-硫酸芪（硫酸芪（SITSSITS）(6)(6)得克薩斯紅（得克薩斯紅（Texas redTexas red）(7)(7)藻紅蛋白（藻紅蛋白（PEPE）(8)(8)花青（花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）第二十一頁，共72頁。三、熒光素標(biāo)記抗體的方法三、熒光素標(biāo)記抗體的方法(一一)FITC標(biāo)記抗體的方法標(biāo)記抗體的方法 1.Marsshall1.Marsshall法法(1)(

9、1)原理：當(dāng)原理：當(dāng)FITCFITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴氨酸要是抗體分子上的賴氨酸 - -氨基與氨基與FITCFITC上硫上硫碳胺鍵結(jié)合，一個碳胺鍵結(jié)合，一個IgGIgG分子中有分子中有8686個賴氨酸殘個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合基，一般最多能結(jié)合15152020個。個。第二十二頁，共72頁。熒光素?zé)晒馑谾ITC-NC N-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) S H H FITC- N C N - 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) H S H第二十三頁，共72頁。(2)(2)操作流程操作流程 抗體與熒光素比例為抗體與熒光素比例為50-100:150-100:1抗體的準備：抗體的準

10、備：20mg/ml20mg/ml，碳酸鹽緩沖液為總，碳酸鹽緩沖液為總 量的量的1/101/10。熒光素的準備：用分析天平準確稱取熒光素的準備：用分析天平準確稱取 0.01mgFITC/1mg0.01mgFITC/1mg抗體?？贵w。結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體 溶液中。溶液中。第二十四頁，共72頁。 透析透析 過柱過柱 SephadeSephadeG50G50或或 G25G25 保存保存 4 -404 -40等量甘油分裝保存。等量甘油分裝保存。2.Chadwick2.Chadwick法法3.3.改良法改良法4.4.透析標(biāo)記法透析標(biāo)記法（二）四乙基羅達明

11、標(biāo)記抗體方法（二）四乙基羅達明標(biāo)記抗體方法（三）藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法（三）藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法第二十五頁，共72頁。第二十六頁，共72頁。四、熒光抗體的質(zhì)量控制四、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1.1.特異性染色效價測定特異性染色效價測定2.2.非特異性染色測定非特異性染色測定3.3.吸收試驗吸收試驗4.F/P4.F/P比值的測定方法比值的測定方法第二十七頁，共72頁。第二十八頁，共72頁。五、免疫熒光組織化學(xué)染色方法五、免疫熒光組織化學(xué)染色方法 1.1.直接法直接法 簡便、快速，用已知特異性標(biāo)簡便、快速，用已知特異性標(biāo)記熒光的一

12、抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合。記熒光的一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合。操作流程：操作流程：(1)(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干冰凍切片經(jīng)固定，涼干PBSPBS洗；石蠟切片脫蠟至水，消化洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min30min，PBSPBS洗。洗。第二十九頁，共72頁。(2)(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)濕盒內(nèi)3737溫育溫育1h1h，PBSPBS洗洗3 33min3min。(3)0.01%(3)0.01%伊文氏藍襯染伊文氏藍襯染1 13min3min，PBSPBS洗洗3 33min3min，蒸餾水洗，蒸餾水洗2 2次，除去次，除去NaclNacl結(jié)晶。結(jié)

13、晶。(4)pH9.0(4)pH9.0緩沖甘油封片。緩沖甘油封片。(5)(5)鏡檢鏡檢第三十頁，共72頁。第三十一頁，共72頁。2.2.間接法間接法 是直接的重要改進，先用標(biāo)記的是直接的重要改進，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合，已知特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合，隨后用間接熒光標(biāo)記二抗與一抗特異性結(jié)隨后用間接熒光標(biāo)記二抗與一抗特異性結(jié)合。合。第三十二頁，共72頁。第三十三頁，共72頁。操作流程操作流程 (1)(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干后冰凍切片經(jīng)固定，涼干后PBSPBS洗；石蠟切片洗；石蠟切片脫蠟至水，脫蠟至水，PBSPBS洗，酶消化，洗，酶消化，PBSPBS洗洗3 33min3m

14、in。(2)(2)適當(dāng)稀釋特異性一抗，適當(dāng)稀釋特異性一抗，3737孵育孵育1h1h，或室，或室溫溫4h4h，或，或44過夜，過夜，PBSPBS洗洗3 33min3min。第三十四頁，共72頁。(3)(3)熒光標(biāo)記二抗適當(dāng)稀釋熒光標(biāo)記二抗適當(dāng)稀釋37 30min37 30min，PBSPBS洗洗3 33min3min。(4)0.01%(4)0.01%伊文氏藍襯染伊文氏藍襯染1 13min3min，PBSPBS洗洗3 33min3min。(5)(5)封片，鏡檢。封片，鏡檢。第三十五頁，共72頁。六、熒光顯微鏡檢查方法六、熒光顯微鏡檢查方法 1.1.熒光顯微鏡熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是免疫熒熒光顯微鏡

15、是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源，濾片系統(tǒng)源，濾片系統(tǒng)( (包括激發(fā)和壓制濾板包括激發(fā)和壓制濾板) )，光，光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。第三十六頁，共72頁。(1)(1)光源光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料的要擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水

16、銀蒸其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過發(fā)，經(jīng)過5 515min15min，球內(nèi)氣壓升至，球內(nèi)氣壓升至50507070標(biāo)準標(biāo)準大氣壓，此時達到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀大氣壓，此時達到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。態(tài)。第三十七頁，共72頁。(2)(2)濾片系統(tǒng)濾片系統(tǒng) 是熒光顯微鏡的重要組成部分，是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)的前提和必要條件。選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)的前提和必要條件。第三十八頁，共72頁。濾片

17、系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中性濾片。分光鏡和其他一些中性濾片。第三十九頁，共72頁。熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法激勵法分光鏡分光鏡激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片截止濾光片截止濾光片用途用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自動熒光觀察法，自動熒光觀察法，DAPI(聯(lián)脒基吲哚聯(lián)脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色體染色體VDM455BP400-410BA455兒茶酚胺觀察兒茶酚胺觀察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色體芥子喹吖因；染色體BP42

18、0-440硫磺素硫磺素S：淋巴細胞：淋巴細胞吖淀黃素：核酸吖淀黃素：核酸BDM500BP450-480BA515異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察BP470-490吖啶橙：吖啶橙：DNA，RNABP420-480金胺結(jié)核桿菌金胺結(jié)核桿菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590羅丹明羅丹明BP530-550四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察BP480-550碘化丙啶：碘化丙啶：DNA第四十頁，共72頁。2.2.標(biāo)本制作要求標(biāo)本制作要求(1)(1)載玻片厚度應(yīng)在載玻片厚度應(yīng)在

19、0.60.61.2mm1.2mm之間之間(2)(2)蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm0.17mm左右左右(3)(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激分。分激分。第四十一頁，共72頁。(4)(4)封片劑封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在無色透明，熒光的亮度在pH8.5pH8.59.59.5時較亮，時較亮，不易很快褪去。甘油和不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.00.5mol/L pH9.09.59

20、.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。第四十二頁，共72頁。熒光信號增強封片劑熒光信號增強封片劑 mowiol 40-88 4.8gmowiol 40-88 4.8g 甘油甘油 12ml12ml 蒸餾水蒸餾水 12ml12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml第四十三頁，共72頁。 上述混合（加熱溶解），上述混合（加熱溶解），5000g5000g離心，離心，15min15min，最后加入，最后加入1.4-diazobicydo-1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABco

21、s)2,2,2-octane(DABcos)，終濃度，終濃度2.5%(2.5%(約約1.25g)1.25g)，溶解后，分裝存于，溶解后，分裝存于-20-20中。中。(5)(5)鏡油鏡油第四十四頁，共72頁。3.3.使用熒光顯微鏡注意事項使用熒光顯微鏡注意事項(1)(1)嚴格按說明書操作，不要隨意改變程序。嚴格按說明書操作，不要隨意改變程序。(2)(2)應(yīng)在暗室中進行檢查。應(yīng)在暗室中進行檢查。(3)(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。戴上防護眼鏡。(4)(4)檢查時間每次以檢查時間每次以1 12h2h為宜，超過為宜，超過90min90m

22、in，超，超高壓汞燈強度逐漸下降，熒光減弱。高壓汞燈強度逐漸下降，熒光減弱。第四十五頁，共72頁。(5)(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關(guān)閉檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關(guān)閉后必須在后必須在30min30min后才能再啟動光源，一天中后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。第四十六頁，共72頁。(6)(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)(7)熒光高度的判斷標(biāo)準，分四級熒光高度的判斷標(biāo)準，分四級“ “ ”為為陰性，陰性，“ “ ”為僅能見明確可見的熒光；為僅能見明確可見的熒光；

23、“ “ ”為可見有明亮的熒光；為可見有明亮的熒光；“ “ ”為可見耀眼的熒光。為可見耀眼的熒光。第四十七頁，共72頁。第四十八頁，共72頁。第四十九頁，共72頁。第五十頁，共72頁。第五十一頁，共72頁。七、非特異性染色的消除方法七、非特異性染色的消除方法根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒ǎＳ梅椒ǎ焊鶕?jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常用方法?1.1.動物臟器粉末吸收法動物臟器粉末吸收法 2.2.透析法透析法 3.Sephadex G-503.Sephadex G-50柱層析法柱層析法 4.DEAE4.DEAE纖維素柱層析法纖維素柱層析法 5.5.熒光抗體稀釋法熒光抗體稀釋法 6.6.純化抗原方法純化

24、抗原方法 7.7.純化抗體方法純化抗體方法 8.8.伊文氏藍襯染方法：伊文氏藍襯染方法：0.01%0.01%伊文氏藍伊文氏藍第五十二頁，共72頁。八、激光掃描共聚焦顯微鏡八、激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡(laser (laser scanning confocal microscope,LSCM)scanning confocal microscope,LSCM)是是8080年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品。義的高科技新產(chǎn)品。第五十三頁，共72頁。第五十四頁，共72頁。 實現(xiàn)了對細胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層實現(xiàn)了對細胞內(nèi)

25、部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進行到立體，表面單層，靜態(tài)平面的觀察進行到立體，斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。研究中得到迅速應(yīng)用。第五十五頁，共72頁。1.1.儀器構(gòu)成儀器構(gòu)成 (1)(1)計算機系統(tǒng)：控制著機械，光學(xué)、聲學(xué)系計算機系統(tǒng)：控制著機械，光學(xué)、聲學(xué)系統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。 (2)(2)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。器。第五十六頁，共72頁。 (3)顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共

26、顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。聚焦系統(tǒng)組成。(4)檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。組成。(5)XY平臺平臺 (6)Z-軸步進馬達軸步進馬達第五十七頁，共72頁。2.共聚焦成像原理共聚焦成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴束和激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴束和整形，變成一束直徑較大的平行光束，長整形，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色光鏡使光束偏轉(zhuǎn)通分色光鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個方向的熒光，激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個方向的

27、熒光，第五十八頁，共72頁。第五十九頁，共72頁。一部分熒光經(jīng)過物鏡，長通分色反射鏡，一部分熒光經(jīng)過物鏡，長通分色反射鏡，聚焦透鏡，會聚在聚焦透鏡的焦點外，經(jīng)聚焦透鏡，會聚在聚焦透鏡的焦點外，經(jīng)過焦點處的針孔，由檢測器接收并轉(zhuǎn)變成過焦點處的針孔，由檢測器接收并轉(zhuǎn)變成電信號。電信號。第六十頁，共72頁。3.3.光信號接收和成像方式光信號接收和成像方式(1)(1)光信號接收光信號接收 生物樣品發(fā)出的熒光通常有生物樣品發(fā)出的熒光通常有二種接收方式：二種接收方式：由光電倍增管（由光電倍增管（PMTPMT）把光）把光信號轉(zhuǎn)變成電信號；信號轉(zhuǎn)變成電信號；利用電荷耦合器（利用電荷耦合器（CCDCCD）把光信

28、號轉(zhuǎn)變成電信號。把光信號轉(zhuǎn)變成電信號。第六十一頁，共72頁。(2)(2)成像方式成像方式 載物臺運動成像：以直徑很載物臺運動成像：以直徑很小的激光束照射樣品，照射點發(fā)出的熒光信小的激光束照射樣品，照射點發(fā)出的熒光信號經(jīng)號經(jīng)PMTPMT變成電信號，然后載物臺移動到下變成電信號，然后載物臺移動到下一點，記錄該點的熒光強度。該方法無軸向一點，記錄該點的熒光強度。該方法無軸向像差，成像時間長；像差，成像時間長；第六十二頁，共72頁。反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動反射鏡使反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由激光連續(xù)照射樣品，由CCDCCD攝像機記錄下照攝像機記錄下照射點所發(fā)射的熒光，成像速

29、度快。射點所發(fā)射的熒光，成像速度快。第六十三頁，共72頁。4.4.參數(shù)的選擇參數(shù)的選擇 基本參數(shù)：基本參數(shù)：Confocal,pinhole,detector,Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subval,Samples/ptBR subval,Samples/pt等等第六十四頁，共72頁。5.5.性能特點：性能特點：分辨率高，靈敏度高，掃描速分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，圖像存取方便，可進行度快，掃描范圍大，圖像存取方便，可進行光切片的觀察，可進行定量熒光分析。光切片的觀察，可進行定量熒光分析。第六十五頁，共72頁。6.6.應(yīng)用應(yīng)用 (1)(1)組織光學(xué)切片組織光學(xué)切片 可對活的或固定的細胞可對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列及組織進行無損傷的系列“ “ 光學(xué)切片光學(xué)切片”，得到其各層面的信息得到其各層面的信息-“ -“ 顯微顯微CT”CT”。 (2)(2)三維圖像重建三維圖像重建第六十六頁，共72頁。(3)(3)細胞