動(dòng)物細(xì)胞融合-----雞血細(xì)胞體外融合

1、動(dòng)物細(xì)胞融合-雞血細(xì)胞體外融合設(shè)計(jì)人：趙麒麟 0910150434 黃 華 0910150423 張耀鐳 0910150441 鄧江岳 0910150436 黃小江 09101504402009級(jí)臨床4班細(xì)胞融合（cell fusion) 兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過(guò)程稱為細(xì)胞融合。分為自發(fā)細(xì)胞融合和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。 指用人工方法把不同類型的兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。所得到的融合細(xì)胞叫雜交細(xì)胞。同核體：由同一親本細(xì)胞融合而來(lái)。 異核體：由不同親本細(xì)胞融合而來(lái)。物理法：顯微操作、激光誘導(dǎo)、電刺激?；瘜W(xué)法：鹽類融合劑、法。生物法

2、：仙臺(tái)病毒法。許多病毒具有凝集動(dòng)物細(xì)胞并促使凝集的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生融合的能力，當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞之間時(shí)，病毒表面的神經(jīng)氨基酸講解細(xì)胞膜上的蛋白，促使細(xì)胞膜局部凝集在細(xì)胞周圍，在高和鈣離子的條件下，局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。 可以認(rèn)為是細(xì)胞在脈沖電場(chǎng)下，細(xì)胞相緊接的區(qū)域形成可逆電擊穿，即在外加電場(chǎng)下形成的細(xì)胞膜電孔，在一定條件下可以自行修復(fù)。 PEG是一種多聚化合物，分子（CH2CH2O）nH。PEG靠醚鍵的聯(lián)結(jié)使其分子末端帶有弱電荷，可溶于水。PEG帶有大量的負(fù)電荷，和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體的粘著和結(jié)合，在高Ph高鈣離子的條件下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分

3、子洗脫，導(dǎo)致電荷失調(diào)而重新分配，使兩種原生質(zhì)體的正負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。1.雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液的制備 取雞血，加入肝素（100U/5mL全血）制成抗凝全血。再加入4倍體積生理鹽水，制成紅細(xì)胞儲(chǔ)備液。2.雞血細(xì)胞的處理 取雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液1mL，加入4mL生理鹽水，混勻后，800rpm離心56min，棄上清，用5mL生理鹽水重懸浮沉淀，重復(fù)離心操作1次。 3.雞血細(xì)胞懸液的制備 在離心后的雞血細(xì)胞沉淀中加入適量Hanks緩沖液，將細(xì)胞懸浮，鏡檢，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度應(yīng)控制在1107個(gè)/mL左右。根據(jù)計(jì)數(shù)情況調(diào)整懸液密度，于37保溫。4.PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合 吸取1

4、mL雞血懸液放在離心管中，逐滴加入37的50%PEG約0.5mL,邊加邊輕輕搖動(dòng)試管，混勻后于37水浴靜置15min。5.終止PEG作用緩慢加入5mL Hanks緩沖液，輕輕吹打混勻，于37水浴中靜置10min制備細(xì)胞懸液6.制備細(xì)胞懸液 用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)數(shù)次使其分散，離心使細(xì)胞沉淀，用Hanks緩沖液重懸浮7.染色和鏡檢 吸取細(xì)胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入詹納斯綠染液混勻，染色3min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況。 取雞血加入肝素（100U/5ml）加入4倍體積的生理鹽水儲(chǔ)備取儲(chǔ)備液1ml加入4ml生理鹽水混勻800r/min離心5min棄上清，取5ml生理鹽水重離心操作一次加入hanks液，控制密度在1*107個(gè)/ml,37度恒溫保存取1ml于離心管加50%PEG約0.5ml(邊加邊晃動(dòng))37度水浴靜置15min加入5mlhanks液，吹打均勻37度水浴10min 吸管吹打分散，離心沉淀用hanks緩沖液重懸浮制臨時(shí)裝片，用詹納斯綠染色3min鏡檢 1.溫度、融合時(shí)間、PEG的濃度與作用時(shí)間、細(xì)胞密度、機(jī)械力等因素均影響融合率，實(shí)驗(yàn)