人感染H7N9禽流感采樣以及實驗室檢測技術(shù)

1、人感染人感染H7N9H7N9禽流感禽流感采樣以及實驗室檢測技術(shù)采樣以及實驗室檢測技術(shù)湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科黃一偉2014.8.21流感病毒流感病毒流行性感冒病毒（簡稱流感病毒）流行性感冒病毒（簡稱流感病毒）： 是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：理化特性： 對熱敏感,5630min可滅活；最適pH為7.08.0，3.0和10.0感染力很快被破壞；對紫外線敏感；對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。 禽流感病毒滅活應(yīng)該是6530min，或者煮沸1002min。 Gao RB, et al, NEJM,2013Morens DM e

2、t al, NEJM, 2013Dliu et al., Lancet, 2013 Yi Guan et al, Nature , 2013采樣人員采樣人員 負責(zé)人感染H7N9禽流感病毒檢測樣本采集的操作人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格，并具備相應(yīng)的操作技能。 樣本采集過程中操作者要加強防護，應(yīng)穿戴防護服、眼罩、N95及以上水平的醫(yī)用防護口罩、帽子、雙層醫(yī)用乳膠手套、鞋套等個體防護裝備。標本采集對象標本采集對象 不明原因肺炎病例。同時具備以下4條的病例: 1. 發(fā)熱(腋下體溫38)； 2. 具有肺炎的影像學(xué)特征； 3. 發(fā)病早期白細胞總數(shù)降低或正常,或淋巴細胞分類計數(shù)減少； 4. 不能從臨床或?qū)嶒?/p>

3、室角度診斷為常見病原所致的肺炎。 人感染H7N9禽流感疑似病例上呼吸道標本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液）；下呼吸道標本（如氣管吸取物、肺洗液、肺組織標本）； 血清標本； 如病人死亡，應(yīng)當(dāng)盡可能說服家屬同意尸檢，及時進行尸體解剖，采集組織（如肺組織、氣管、支氣管組織）標本；注：注：應(yīng)當(dāng)盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道標本（尤其是下呼應(yīng)當(dāng)盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道標本（尤其是下呼吸道標本）和發(fā)病吸道標本）和發(fā)病7 7天內(nèi)急性期血清以及間隔天內(nèi)急性期血清以及間隔2-42-4周的恢復(fù)周的恢復(fù)期血清。期血清。要求p 呼吸道標本：發(fā)病早期采樣，每份不少于3mlp 血清標本每份分為2管，每

4、管不少于0.5ml樣本類型樣本類型咽拭子咽拭子：左手用壓舌板壓住患者舌頭，右手用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免接觸舌頭，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。樣本樣本采集采集方法方法 (1)樣本采集方法樣本采集方法 (2) 鼻拭子鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處（通常5cm以上），停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋?；純焊┡P抬頭，采集者左手托住患兒的下頜部，右手持無菌拭子，將干拭子與上顎平行插入鼻孔（不要向上

5、）直接與鼻咽后壁接觸，深度與到耳導(dǎo)管基本一致，輕輕旋轉(zhuǎn)5秒吸附分泌物，慢慢移出拭子，將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。樣本采集方法樣本采集方法 (3)拭子的要求：拭子的要求： 標本應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維） 鋁或塑料做柄，不推薦棉拭子和木柄 標本采集管應(yīng)包含3毫升病毒采樣液（含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩沖液）采樣液中不能加入血清作為蛋白保護劑，可以加入BSA作為蛋白保護劑，加入BSA的采樣液應(yīng)-20保存?zhèn)溆?。也可加入凝膠（gelatin）作為蛋白保護劑。使用商品化的無菌采樣液，在分離病毒時需補加抗生素。樣本采集樣本采集方法方法 (4)鼻洗液鼻洗液 患者取坐姿

6、，頭微后仰，用移液管將5 ml生理鹽水注入一側(cè)鼻孔，囑患者同時發(fā)K音以關(guān)閉咽腔。然后讓患者低頭使生理鹽水流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復(fù)此過程洗兩側(cè)鼻孔漱口液漱口液 用10 ml生理鹽水漱喉。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓生理鹽水在咽部轉(zhuǎn)動。然后，用50ml的無菌螺口塑料管收集洗液。血清標本血清標本 用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，15002000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。樣本采集方法樣本采集方法 (5)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：鼻咽抽取物或呼吸道抽取物： 用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入

7、鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。呼吸道灌洗液呼吸道灌洗液： 將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。禽流感環(huán)境標本采集禽流感環(huán)境標本采集 采集糞便時一定要采集新鮮的（一般較濕潤）糞便，太陳舊（干燥）的糞便對我們的檢測意義不大； 在養(yǎng)殖戶家中采集糞便標本時，由于多雞鴨混養(yǎng)難以分辨鴨糞和雞糞，最好能找到鴨子剛排泄的新鮮糞便；

8、采樣液中最好已加入抗生素，否則回實驗室要先加入抗生素處理；樣本的運輸樣本的運輸 1、病毒培養(yǎng)物按照A類感染性物質(zhì)進行包裝運輸，其他感染性物質(zhì)按照B類感染性物質(zhì)進行包裝運輸。 2、病例的臨床標本采集后，縣級疾病預(yù)防控制機構(gòu)和病例收治的醫(yī)療機構(gòu)要密切配合，按照生物安全的相關(guān)規(guī)定進行包裝，在24小時內(nèi)送到當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室進行檢測。樣本的分裝與保存樣本的分裝與保存 樣本的分裝：樣本的分裝： 采集的呼吸道標本每份分為3 管，每管不少于1ml。血清標本每份分為2 管，每管不少于0.5ml。并填寫湖南省不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例標本送檢單。 樣本的保存：樣本的保存： 所有呼吸道標本應(yīng)保存在4 ，

9、并盡快放置在70。如果沒有70度冰箱，標本應(yīng)保存在4 ，但不超過24小時。切勿置于-20 長期保存 。 血清樣本應(yīng)置-20 長期保存 。注：標本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。 病原學(xué)檢測病原學(xué)檢測 （1）甲型流感病毒抗原篩查。呼吸道標本甲型流感病毒抗原快速檢測陽性。但僅可作為初篩實驗。 （2）核酸檢測。對患者呼吸道標本采用real time PCR（或RT-PCR）檢測H7N9禽流感病毒核酸。 （3）病毒分離。從患者呼吸道標本中分離H7N9禽流感病毒。 （4）動態(tài)檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高。檢測策略檢測策略 不明原因肺炎不明原因肺炎病例標本檢測：病例標本檢測： 建議

10、各流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室收到不明原因肺炎標本后，要在12小時內(nèi)進行標本處理和核酸檢測，同時進行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感，季節(jié)性H3N2流感，A（H5）、A (H7和N9)亞型流感病毒的檢測。如果H5或H7/N9亞型檢測陽性，在生物安全三級實驗室進行流感病毒的分離鑒定，無病毒分離條件的實驗室，將標本在24小時內(nèi)送國家流感中心進行復(fù)核鑒定和病毒分離。樣品采集樣品采集/接收接收對于人禽流感，咽拭子比鼻拭子檢出率高。病毒滴度：氣管吸取物咽拭子鼻拭子，糞便中可能可檢出。 標本送至實驗室后，立即進行處理，避免反復(fù)凍融。將原始標本分為三份，取一份進行檢測，其余保存在70 或70 以下，短時間保存在4

11、 ，不要保存在20 。 在生物安全二級實驗室從事相關(guān)實驗室活動時，操作者應(yīng)穿戴眼罩、N95及以上水平的醫(yī)學(xué)防護口罩、防護服、帽子、雙層乳膠手套、鞋套等個體防護裝備；實驗活動應(yīng)當(dāng)有名以上的工作人員共同進行。核酸檢測流程核酸檢測流程 1、樣品采集/接收 2、核酸提取 3、反應(yīng)體系配制 4、熒光PCR擴增 5、結(jié)果判斷結(jié)果判斷結(jié)果判斷1. 探針/引物的陰性對照反應(yīng)中得到的熒光增長曲線不應(yīng)該超過閾值線，應(yīng)無CT 值或為CT 值為零。如果一個或者多個引物和探針的陰性反應(yīng)出現(xiàn)了假陽性，則樣品可能已經(jīng)被污染。那么整個實驗過程是無效的，嚴格的按照步驟規(guī)則重新實驗。2. 在 40 個循環(huán)之前，陽性對照反應(yīng)應(yīng)出現(xiàn)

12、陽性結(jié)果，且CT 值在2030 之間。 如果沒產(chǎn)生預(yù)期的陽性結(jié)果則視為無效，應(yīng)嚴格遵照操作程序進行重復(fù)實驗。確定PTC 反應(yīng)失敗原因，訂正并記錄錯誤原因及更改方案。不再使用沒產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的PTC 試劑。3. 當(dāng)所有對照成立，檢測標本在35個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)熒光信號，則相應(yīng)引物和探針陽性；若CT 值在3540 間，應(yīng)重復(fù)確認，如CT 值還在40 內(nèi)可判斷為陽性；CT 值超過40，視該樣本為陰性(A型引物探針以型引物探針以35為閾值，其他分亞型引為閾值，其他分亞型引物探針以物探針以38為閾值為閾值)。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 4 .所有的臨床標本RNA 檢測都必須為陽性，且CT 值在35.0 以內(nèi)才足可以證明樣

13、品的質(zhì)量是可接受的。如果臨床標本RNA 檢測為陰性，則可能是以下原因： 4.1 臨床樣本核酸提取不正確導(dǎo)致RNA 的丟失或臨床標本里存在大量的RT-PCR 反應(yīng)抑制劑。 4.2 樣品中人細胞成分太少，以至于不能檢測到。 4.3 反應(yīng)液配制錯誤或程序設(shè)置錯誤。實驗操作注意事項避免污染實驗操作注意事項避免污染 應(yīng)特別注意假陽性產(chǎn)生。推薦以下預(yù)防污染的方法： (a)實驗準備與核酸提取使用獨立區(qū)域； (b)實驗準備與核酸提取使用專用設(shè)備（如移液器，微量離心機）和耗材（如微量離心管，吸頭）； (c)實驗開始后穿清潔工作服，并使用新的一次性無粉手套； (d)不同樣本操作之間，以及懷疑可能污染的情況下均更換

14、手套； (e)試劑和反應(yīng)管的蓋子應(yīng)盡量關(guān)閉。陽性標本送檢要求陽性標本送檢要求p 若當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室檢測結(jié)果為H7亞型禽流感病毒核酸陽性時，應(yīng)當(dāng)于48小時內(nèi)將其中2管呼吸道相關(guān)原始標本送省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實驗室。p 省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實驗室在接到醫(yī)療機構(gòu)和本省網(wǎng)絡(luò)實驗室送檢的H7和H5亞型陽性的呼吸道標本時，未能開展病毒分離的省級疾控中心網(wǎng)絡(luò)實驗室將陽性病例的原始標本48小時內(nèi)送國家流感中心開展病毒分離。p 各醫(yī)療機構(gòu)采集的雙份血清標本48小時內(nèi)送當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室，由當(dāng)?shù)鼐W(wǎng)絡(luò)實驗室48小時內(nèi)將血清標本分別送省級疾控中心和國家流感中心開展相關(guān)抗體檢測，進行病例診斷。p 對于甲型通用引物陽性

15、而不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標對于甲型通用引物陽性而不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標本要求在本要求在4848小時內(nèi)送小時內(nèi)送至國家流感中心。至國家流感中心。環(huán)境標本檢測送檢要求環(huán)境標本檢測送檢要求p對人感染對人感染H7N9H7N9禽流感確診病例可能暴露的禽流感確診病例可能暴露的禽類飼養(yǎng)或交易等場所，采集禽類糞便、禽類飼養(yǎng)或交易等場所，采集禽類糞便、籠具涂拭標本和環(huán)境污水等標本籠具涂拭標本和環(huán)境污水等標本2 2周周內(nèi)開展內(nèi)開展甲型流感通用引物、甲型流感通用引物、H5H5、H7H7和和H9H9亞型檢測亞型檢測。沒有條件開展病毒分離的實驗室在沒有條件開展病毒分離的實驗室在2 2周內(nèi)將周內(nèi)將陽性標

16、本送國家流感中心陽性標本送國家流感中心。具體技術(shù)要求。具體技術(shù)要求可參考可參考職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測方案（病性禽流感監(jiān)測方案（20112011年版）年版）。H7N9H7N9禽流感病毒實禽流感病毒實驗室檢測策略流程驗室檢測策略流程圖圖甲通陽性甲通陽性H7/H5陰性陰性2周內(nèi)完成周內(nèi)完成血清血清標本標本及及醫(yī)療醫(yī)療機構(gòu)機構(gòu)檢測檢測H7陽性陽性標本標本血清血清標本標本省級省級CDC實驗室實驗室國家流感中心國家流感中心2周內(nèi)完成檢測周內(nèi)完成檢測48h內(nèi)內(nèi)具備條件開展病毒分離具備條件開展病毒分離毒株毒株陽性陽性未能開展病毒分離未能開展病毒分離48h內(nèi)內(nèi)毒株

17、和標本毒株和標本醫(yī)療機構(gòu)醫(yī)療機構(gòu)疑似病例雙份血清樣本疑似病例雙份血清樣本呼吸道標呼吸道標本本無條件開展檢測無條件開展檢測或甲型抗原檢測陽性或甲型抗原檢測陽性24h內(nèi)內(nèi) 核酸檢測核酸檢測H7陽性，陽性，48h內(nèi)內(nèi)送當(dāng)?shù)厮彤?dāng)?shù)谻DC網(wǎng)絡(luò)實驗室，進一步送省網(wǎng)絡(luò)實驗室，進一步送省CDC甲型快速抗原檢甲型快速抗原檢測陽性的標本測陽性的標本醫(yī)療機構(gòu)未進行過醫(yī)療機構(gòu)未進行過檢測的疑似病例標檢測的疑似病例標本本強化監(jiān)測采集的強化監(jiān)測采集的ILI和和SARI病例標本病例標本H5，H7H5/H7陽性陽性陰性陰性檢測結(jié)束檢測結(jié)束停止停止甲、乙型通用及甲、乙型通用及H5，H7季節(jié)性流感檢測季節(jié)性流感檢測陰性陰性當(dāng)?shù)禺?dāng)?shù)谻DC流感網(wǎng)絡(luò)實驗室流感網(wǎng)絡(luò)實驗室季節(jié)性流季節(jié)性流感檢測感檢測