人感染H7N9禽流感采樣以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

1、人感染人感染H7N9H7N9禽流感禽流感采樣以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)采樣以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科黃一偉2014.8.21流感病毒流感病毒流行性感冒病毒（簡(jiǎn)稱流感病毒）流行性感冒病毒（簡(jiǎn)稱流感病毒）： 是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：理化特性： 對(duì)熱敏感,5630min可滅活；最適pH為7.08.0，3.0和10.0感染力很快被破壞；對(duì)紫外線敏感；對(duì)乙醚、氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑均敏感。 禽流感病毒滅活應(yīng)該是6530min，或者煮沸1002min。 Gao RB, et al, NEJM,2013Morens DM e

2、t al, NEJM, 2013Dliu et al., Lancet, 2013 Yi Guan et al, Nature , 2013采樣人員采樣人員 負(fù)責(zé)人感染H7N9禽流感病毒檢測(cè)樣本采集的操作人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格，并具備相應(yīng)的操作技能。 樣本采集過程中操作者要加強(qiáng)防護(hù)，應(yīng)穿戴防護(hù)服、眼罩、N95及以上水平的醫(yī)用防護(hù)口罩、帽子、雙層醫(yī)用乳膠手套、鞋套等個(gè)體防護(hù)裝備。標(biāo)本采集對(duì)象標(biāo)本采集對(duì)象 不明原因肺炎病例。同時(shí)具備以下4條的病例: 1. 發(fā)熱(腋下體溫38)； 2. 具有肺炎的影像學(xué)特征； 3. 發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)降低或正常,或淋巴細(xì)胞分類計(jì)數(shù)減少； 4. 不能從臨床或?qū)嶒?yàn)

3、室角度診斷為常見病原所致的肺炎。 人感染H7N9禽流感疑似病例上呼吸道標(biāo)本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液）；下呼吸道標(biāo)本（如氣管吸取物、肺洗液、肺組織標(biāo)本）； 血清標(biāo)本； 如病人死亡，應(yīng)當(dāng)盡可能說服家屬同意尸檢，及時(shí)進(jìn)行尸體解剖，采集組織（如肺組織、氣管、支氣管組織）標(biāo)本；注：注：應(yīng)當(dāng)盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道標(biāo)本（尤其是下呼應(yīng)當(dāng)盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道標(biāo)本（尤其是下呼吸道標(biāo)本）和發(fā)病吸道標(biāo)本）和發(fā)病7 7天內(nèi)急性期血清以及間隔天內(nèi)急性期血清以及間隔2-42-4周的恢復(fù)周的恢復(fù)期血清。期血清。要求p 呼吸道標(biāo)本：發(fā)病早期采樣，每份不少于3mlp 血清標(biāo)本每份分為2管，每

4、管不少于0.5ml樣本類型樣本類型咽拭子咽拭子：左手用壓舌板壓住患者舌頭，右手用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)檫拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免接觸舌頭，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。樣本樣本采集采集方法方法 (1)樣本采集方法樣本采集方法 (2) 鼻拭子鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處（通常5cm以上），停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋?；純焊┡P抬頭，采集者左手托住患兒的下頜部，右手持無菌拭子，將干拭子與上顎平行插入鼻孔（不要向上

5、）直接與鼻咽后壁接觸，深度與到耳導(dǎo)管基本一致，輕輕旋轉(zhuǎn)5秒吸附分泌物，慢慢移出拭子，將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。樣本采集方法樣本采集方法 (3)拭子的要求：拭子的要求： 標(biāo)本應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維） 鋁或塑料做柄，不推薦棉拭子和木柄 標(biāo)本采集管應(yīng)包含3毫升病毒采樣液（含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的抗生素，緩沖液）采樣液中不能加入血清作為蛋白保護(hù)劑，可以加入BSA作為蛋白保護(hù)劑，加入BSA的采樣液應(yīng)-20保存?zhèn)溆?。也可加入凝膠（gelatin）作為蛋白保護(hù)劑。使用商品化的無菌采樣液，在分離病毒時(shí)需補(bǔ)加抗生素。樣本采集樣本采集方法方法 (4)鼻洗液鼻洗液 患者取坐姿

6、，頭微后仰，用移液管將5 ml生理鹽水注入一側(cè)鼻孔，囑患者同時(shí)發(fā)K音以關(guān)閉咽腔。然后讓患者低頭使生理鹽水流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復(fù)此過程洗兩側(cè)鼻孔漱口液漱口液 用10 ml生理鹽水漱喉。漱時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓生理鹽水在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)。然后，用50ml的無菌螺口塑料管收集洗液。血清標(biāo)本血清標(biāo)本 用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，15002000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。樣本采集方法樣本采集方法 (5)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：鼻咽抽取物或呼吸道抽取物： 用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入

7、鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。呼吸道灌洗液呼吸道灌洗液： 將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來代替收集）。禽流感環(huán)境標(biāo)本采集禽流感環(huán)境標(biāo)本采集 采集糞便時(shí)一定要采集新鮮的（一般較濕潤(rùn)）糞便，太陳舊（干燥）的糞便對(duì)我們的檢測(cè)意義不大； 在養(yǎng)殖戶家中采集糞便標(biāo)本時(shí)，由于多雞鴨混養(yǎng)難以分辨鴨糞和雞糞，最好能找到鴨子剛排泄的新鮮糞便；

8、采樣液中最好已加入抗生素，否則回實(shí)驗(yàn)室要先加入抗生素處理；樣本的運(yùn)輸樣本的運(yùn)輸 1、病毒培養(yǎng)物按照A類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝運(yùn)輸，其他感染性物質(zhì)按照B類感染性物質(zhì)進(jìn)行包裝運(yùn)輸。 2、病例的臨床標(biāo)本采集后，縣級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和病例收治的醫(yī)療機(jī)構(gòu)要密切配合，按照生物安全的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行包裝，在24小時(shí)內(nèi)送到當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。樣本的分裝與保存樣本的分裝與保存 樣本的分裝：樣本的分裝： 采集的呼吸道標(biāo)本每份分為3 管，每管不少于1ml。血清標(biāo)本每份分為2 管，每管不少于0.5ml。并填寫湖南省不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例標(biāo)本送檢單。 樣本的保存：樣本的保存： 所有呼吸道標(biāo)本應(yīng)保存在4 ，

9、并盡快放置在70。如果沒有70度冰箱，標(biāo)本應(yīng)保存在4 ，但不超過24小時(shí)。切勿置于-20 長(zhǎng)期保存 。 血清樣本應(yīng)置-20 長(zhǎng)期保存 。注：標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。 病原學(xué)檢測(cè)病原學(xué)檢測(cè) （1）甲型流感病毒抗原篩查。呼吸道標(biāo)本甲型流感病毒抗原快速檢測(cè)陽性。但僅可作為初篩實(shí)驗(yàn)。 （2）核酸檢測(cè)。對(duì)患者呼吸道標(biāo)本采用real time PCR（或RT-PCR）檢測(cè)H7N9禽流感病毒核酸。 （3）病毒分離。從患者呼吸道標(biāo)本中分離H7N9禽流感病毒。 （4）動(dòng)態(tài)檢測(cè)雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高。檢測(cè)策略檢測(cè)策略 不明原因肺炎不明原因肺炎病例標(biāo)本檢測(cè)：病例標(biāo)本檢測(cè)： 建議

10、各流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到不明原因肺炎標(biāo)本后，要在12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理和核酸檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感，季節(jié)性H3N2流感，A（H5）、A (H7和N9)亞型流感病毒的檢測(cè)。如果H5或H7/N9亞型檢測(cè)陽性，在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流感病毒的分離鑒定，無病毒分離條件的實(shí)驗(yàn)室，將標(biāo)本在24小時(shí)內(nèi)送國(guó)家流感中心進(jìn)行復(fù)核鑒定和病毒分離。樣品采集樣品采集/接收接收對(duì)于人禽流感，咽拭子比鼻拭子檢出率高。病毒滴度：氣管吸取物咽拭子鼻拭子，糞便中可能可檢出。 標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行處理，避免反復(fù)凍融。將原始標(biāo)本分為三份，取一份進(jìn)行檢測(cè)，其余保存在70 或70 以下，短時(shí)間保存在4

11、 ，不要保存在20 。 在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室從事相關(guān)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)時(shí)，操作者應(yīng)穿戴眼罩、N95及以上水平的醫(yī)學(xué)防護(hù)口罩、防護(hù)服、帽子、雙層乳膠手套、鞋套等個(gè)體防護(hù)裝備；實(shí)驗(yàn)活動(dòng)應(yīng)當(dāng)有名以上的工作人員共同進(jìn)行。核酸檢測(cè)流程核酸檢測(cè)流程 1、樣品采集/接收 2、核酸提取 3、反應(yīng)體系配制 4、熒光PCR擴(kuò)增 5、結(jié)果判斷結(jié)果判斷結(jié)果判斷1. 探針/引物的陰性對(duì)照反應(yīng)中得到的熒光增長(zhǎng)曲線不應(yīng)該超過閾值線，應(yīng)無CT 值或?yàn)镃T 值為零。如果一個(gè)或者多個(gè)引物和探針的陰性反應(yīng)出現(xiàn)了假陽性，則樣品可能已經(jīng)被污染。那么整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程是無效的，嚴(yán)格的按照步驟規(guī)則重新實(shí)驗(yàn)。2. 在 40 個(gè)循環(huán)之前，陽性對(duì)照反應(yīng)應(yīng)出現(xiàn)

12、陽性結(jié)果，且CT 值在2030 之間。 如果沒產(chǎn)生預(yù)期的陽性結(jié)果則視為無效，應(yīng)嚴(yán)格遵照操作程序進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。確定PTC 反應(yīng)失敗原因，訂正并記錄錯(cuò)誤原因及更改方案。不再使用沒產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的PTC 試劑。3. 當(dāng)所有對(duì)照成立，檢測(cè)標(biāo)本在35個(gè)循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)熒光信號(hào)，則相應(yīng)引物和探針陽性；若CT 值在3540 間，應(yīng)重復(fù)確認(rèn)，如CT 值還在40 內(nèi)可判斷為陽性；CT 值超過40，視該樣本為陰性(A型引物探針以型引物探針以35為閾值，其他分亞型引為閾值，其他分亞型引物探針以物探針以38為閾值為閾值)。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 4 .所有的臨床標(biāo)本RNA 檢測(cè)都必須為陽性，且CT 值在35.0 以內(nèi)才足可以證明樣

13、品的質(zhì)量是可接受的。如果臨床標(biāo)本RNA 檢測(cè)為陰性，則可能是以下原因： 4.1 臨床樣本核酸提取不正確導(dǎo)致RNA 的丟失或臨床標(biāo)本里存在大量的RT-PCR 反應(yīng)抑制劑。 4.2 樣品中人細(xì)胞成分太少，以至于不能檢測(cè)到。 4.3 反應(yīng)液配制錯(cuò)誤或程序設(shè)置錯(cuò)誤。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)避免污染實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)避免污染 應(yīng)特別注意假陽性產(chǎn)生。推薦以下預(yù)防污染的方法： (a)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與核酸提取使用獨(dú)立區(qū)域； (b)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與核酸提取使用專用設(shè)備（如移液器，微量離心機(jī)）和耗材（如微量離心管，吸頭）； (c)實(shí)驗(yàn)開始后穿清潔工作服，并使用新的一次性無粉手套； (d)不同樣本操作之間，以及懷疑可能污染的情況下均更換

14、手套； (e)試劑和反應(yīng)管的蓋子應(yīng)盡量關(guān)閉。陽性標(biāo)本送檢要求陽性標(biāo)本送檢要求p 若當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為H7亞型禽流感病毒核酸陽性時(shí)，應(yīng)當(dāng)于48小時(shí)內(nèi)將其中2管呼吸道相關(guān)原始標(biāo)本送省級(jí)疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。p 省級(jí)疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室在接到醫(yī)療機(jī)構(gòu)和本省網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室送檢的H7和H5亞型陽性的呼吸道標(biāo)本時(shí)，未能開展病毒分離的省級(jí)疾控中心網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室將陽性病例的原始標(biāo)本48小時(shí)內(nèi)送國(guó)家流感中心開展病毒分離。p 各醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集的雙份血清標(biāo)本48小時(shí)內(nèi)送當(dāng)?shù)亓鞲斜O(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，由當(dāng)?shù)鼐W(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室48小時(shí)內(nèi)將血清標(biāo)本分別送省級(jí)疾控中心和國(guó)家流感中心開展相關(guān)抗體檢測(cè)，進(jìn)行病例診斷。p 對(duì)于甲型通用引物陽性

15、而不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標(biāo)對(duì)于甲型通用引物陽性而不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽性標(biāo)本要求在本要求在4848小時(shí)內(nèi)送小時(shí)內(nèi)送至國(guó)家流感中心。至國(guó)家流感中心。環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)送檢要求環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)送檢要求p對(duì)人感染對(duì)人感染H7N9H7N9禽流感確診病例可能暴露的禽流感確診病例可能暴露的禽類飼養(yǎng)或交易等場(chǎng)所，采集禽類糞便、禽類飼養(yǎng)或交易等場(chǎng)所，采集禽類糞便、籠具涂拭標(biāo)本和環(huán)境污水等標(biāo)本籠具涂拭標(biāo)本和環(huán)境污水等標(biāo)本2 2周周內(nèi)開展內(nèi)開展甲型流感通用引物、甲型流感通用引物、H5H5、H7H7和和H9H9亞型檢測(cè)亞型檢測(cè)。沒有條件開展病毒分離的實(shí)驗(yàn)室在沒有條件開展病毒分離的實(shí)驗(yàn)室在2 2周內(nèi)將周內(nèi)將陽性標(biāo)

16、本送國(guó)家流感中心陽性標(biāo)本送國(guó)家流感中心。具體技術(shù)要求。具體技術(shù)要求可參考可參考職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致職業(yè)暴露人群血清學(xué)和環(huán)境高致病性禽流感監(jiān)測(cè)方案（病性禽流感監(jiān)測(cè)方案（20112011年版）年版）。H7N9H7N9禽流感病毒實(shí)禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略流程驗(yàn)室檢測(cè)策略流程圖圖甲通陽性甲通陽性H7/H5陰性陰性2周內(nèi)完成周內(nèi)完成血清血清標(biāo)本標(biāo)本及及醫(yī)療醫(yī)療機(jī)構(gòu)機(jī)構(gòu)檢測(cè)檢測(cè)H7陽性陽性標(biāo)本標(biāo)本血清血清標(biāo)本標(biāo)本省級(jí)省級(jí)CDC實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室國(guó)家流感中心國(guó)家流感中心2周內(nèi)完成檢測(cè)周內(nèi)完成檢測(cè)48h內(nèi)內(nèi)具備條件開展病毒分離具備條件開展病毒分離毒株毒株陽性陽性未能開展病毒分離未能開展病毒分離48h內(nèi)內(nèi)毒株

17、和標(biāo)本毒株和標(biāo)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)療機(jī)構(gòu)疑似病例雙份血清樣本疑似病例雙份血清樣本呼吸道標(biāo)呼吸道標(biāo)本本無條件開展檢測(cè)無條件開展檢測(cè)或甲型抗原檢測(cè)陽性或甲型抗原檢測(cè)陽性24h內(nèi)內(nèi) 核酸檢測(cè)核酸檢測(cè)H7陽性，陽性，48h內(nèi)內(nèi)送當(dāng)?shù)厮彤?dāng)?shù)谻DC網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步送省網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步送省CDC甲型快速抗原檢甲型快速抗原檢測(cè)陽性的標(biāo)本測(cè)陽性的標(biāo)本醫(yī)療機(jī)構(gòu)未進(jìn)行過醫(yī)療機(jī)構(gòu)未進(jìn)行過檢測(cè)的疑似病例標(biāo)檢測(cè)的疑似病例標(biāo)本本強(qiáng)化監(jiān)測(cè)采集的強(qiáng)化監(jiān)測(cè)采集的ILI和和SARI病例標(biāo)本病例標(biāo)本H5，H7H5/H7陽性陽性陰性陰性檢測(cè)結(jié)束檢測(cè)結(jié)束停止停止甲、乙型通用及甲、乙型通用及H5，H7季節(jié)性流感檢測(cè)季節(jié)性流感檢測(cè)陰性陰性當(dāng)?shù)禺?dāng)?shù)谻DC流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室季節(jié)性流季節(jié)性流感檢測(cè)感檢測(cè)