輔助生殖PGD與PGS技術(shù)

1、植入前遺傳學(xué)診斷及篩查技術(shù)植入前遺傳學(xué)診斷及篩查技術(shù)臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用譚躍球譚躍球,中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所*人類(lèi)干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心人類(lèi)干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心 * 中信湘雅生殖與遺傳專(zhuān)科醫(yī)院中信湘雅生殖與遺傳專(zhuān)科醫(yī)院內(nèi)容概要內(nèi)容概要植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念PGD檢測(cè)流程檢測(cè)流程染色體易位攜帶者的染色體易位攜帶者的PGD基于全染色體篩查的基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)單基因病單基因病PGD背景介紹背景介紹適應(yīng)征及技術(shù)進(jìn)展適應(yīng)征及技術(shù)進(jìn)展臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用植入前診斷植入前診斷 植入前遺傳植入前

2、遺傳學(xué)診斷和篩學(xué)診斷和篩查的概念查的概念植入前遺傳學(xué)植入前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)診斷的臨床應(yīng)用用植入前遺傳學(xué)植入前遺傳學(xué)篩查的臨床應(yīng)篩查的臨床應(yīng)用用一、一、植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)：又稱(chēng)為孕前診斷(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技術(shù)對(duì)顯微活檢的胚胎細(xì)胞進(jìn)行染色體異常或遺傳性疾病進(jìn)行診斷，選擇正常的胚胎植入。第一部分 植入前遺傳學(xué)診斷和篩查的概念第三代試管嬰兒？PGD/PGS是以ICSI-ET為基礎(chǔ)，結(jié)合顯微操作技術(shù)

3、和分子生物學(xué)研究的而發(fā)展起來(lái)的。PGDPGD的意義的意義nPGD可在孕前階段杜絕X-連鎖隱性遺傳病、染色體病和基因病患兒的妊娠，避免人工流產(chǎn)終止異常妊娠給廣大婦女的身心痛苦。n理論上還可減少遺傳病在人群中的遺傳負(fù)荷。nPGD是遺傳性病防治的重要手段，是Edwards獲諾貝爾獎(jiǎng)的理由之一。植入前診斷植入前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷PGDPGD發(fā)展歷程發(fā)展歷程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在顯微操縱下對(duì)兔囊胚進(jìn)行活檢，取出少量滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分析染色質(zhì)來(lái)選擇雌性胚胎。1990年Handyside報(bào)道了世界第一例植入前性別診斷嬰兒的出生，開(kāi)創(chuàng)了產(chǎn)前診

4、斷的新紀(jì)元。1994年，Munne用FISH技術(shù)，在植入前診斷胚胎染色體非整倍體及性別獲得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和單鏈多態(tài)性分析技術(shù)，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的易感性分析，在植入前確定胚胎未來(lái)發(fā)生腫瘤的可能性大小，從而為PGD應(yīng)用于人類(lèi)胚胎基因表達(dá)的研究開(kāi)辟了嶄新的途徑。2001年Verlinsky有報(bào)道對(duì)胚胎進(jìn)行HLA選型以便于骨髓移植。進(jìn)一步拓寬了該技術(shù)的研究和應(yīng)用。u染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等）染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等） 染色體異常的篩查染色體異常的篩查u單基因病（一般的單基因病、性連鎖遺傳病等）單基因?。ㄒ话愕膯位虿?、性連鎖遺傳病等）

5、單基因異常的篩查單基因異常的篩查 PGDPGD期望解決的問(wèn)題期望解決的問(wèn)題 植入前遺傳學(xué)篩查的概念植入前遺傳學(xué)篩查的概念u胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入著床之前，對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)，通過(guò)一次性檢測(cè)胚胎23對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低多胎妊娠。uPGS目前特指針對(duì)染色體數(shù)目異常，即非整倍體；uPGS理論上將來(lái)可以應(yīng)用于單基因病。uPGS是低風(fēng)險(xiǎn)人群，夫妻雙方的染色體或者基因是正常的。二、二、PGDPGD檢測(cè)流程檢測(cè)流程卵子精子I

6、CSI活檢取樣胚胎冷凍遺傳學(xué)檢測(cè)選擇胚胎胚胎植入遺傳咨詢(xún)知情談話(huà)FISHCHIPPCRMPSIVF臨床促排卵極體活檢活檢第一極體和第二極體，檢測(cè)母源性的染色體結(jié)構(gòu)異常或基因突變，以及減數(shù)分裂異常造成的染色體非整倍體。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育沒(méi)有影響。 缺點(diǎn)：只能檢測(cè)母源性的染色體異常； 不能檢測(cè)受精后發(fā)生的染色體異常； 可檢測(cè)細(xì)胞數(shù)少，易發(fā)生檢測(cè)失敗。（一）活檢技術(shù)選擇卵裂球活檢 在D3胚胎發(fā)育到6-10細(xì)胞時(shí)活檢出1-2個(gè)卵裂球，進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。 優(yōu)點(diǎn)：最成熟最常用的活檢方法。 缺點(diǎn)：活檢出卵裂球后降低了胚胎的發(fā)育潛能； 細(xì)胞數(shù)少，容易發(fā)生檢測(cè)失敗(細(xì)胞固定及 雜交失敗，擴(kuò)增失敗，ADO等)。

7、 囊胚活檢 D5-6天胚胎發(fā)育到囊胚階段后，活檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活檢不影響將要發(fā)育成胎 兒的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育； 可檢測(cè)細(xì)胞數(shù)較多，檢測(cè)失敗概率降低。 對(duì)SNP-array而言，能大大減低費(fèi)用。 缺點(diǎn)：大部分情況下（除非可以在24小時(shí)之內(nèi)出結(jié)果） 需將活檢后的囊胚冷凍保存。 染色體易位(Translocation):一種染色體結(jié)構(gòu)異常，一條染色體的一段轉(zhuǎn)移到同一條或另一條染色體上，導(dǎo)致易位片段基因的重排 (Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010)易位是一種常見(jiàn)的染色體結(jié)構(gòu)重排異常，新生兒中發(fā)病率0.2%.(

8、Stern et al., 1999)臨床上兩種類(lèi)型的易位最常見(jiàn)：羅氏易位和相互易位一、染色體易位攜帶者的一、染色體易位攜帶者的FISH-PGDFISH-PGD第二部分 植入前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)用相互易位：兩條非同源染色體之間進(jìn)行片段的交換，常常是整個(gè)末端的斷裂并互換。- Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010著絲粒著絲粒Derivative chromosome 4Derivative chromosome 20羅氏易位：這種類(lèi)型的易位是在兩組端著絲粒染色體 (D組 and G 組, 染色體13-15, 21-22)間進(jìn)行交換，往往在靠

9、近著絲粒的區(qū)域斷裂重組，導(dǎo)致易位的兩條染色體隨體的丟失-Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010CentromereCentromereChr21Chr14der(14;21)易位攜帶者的健康風(fēng)險(xiǎn) 平衡的染色體易位個(gè)體往往沒(méi)有明顯的疾病表型，稱(chēng)為“易位攜帶者”。但卻多存在生殖的障礙； 易位攜帶者主要的遺傳風(fēng)險(xiǎn)起源于配子減數(shù)分裂的過(guò)程，攜帶者可產(chǎn)生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以導(dǎo)致流產(chǎn)，出生染色體異常患兒引起出生缺陷（特別是智力障礙），并可導(dǎo)致不孕和不育；平衡易位攜帶者的遺傳風(fēng)險(xiǎn)平衡易位攜帶者的遺傳風(fēng)險(xiǎn)四射體對(duì)于相互易位攜帶者，配子分離

10、模式理論上產(chǎn)生18種配子類(lèi)型：包括1種正常, 1種平衡易位型 和16 種不平衡分離的配子。normalbalanceddisomy 21disomy 21nullisomy 21Nullisomy 14羅氏易位產(chǎn)生6種配子類(lèi)型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4種不平衡分離配子，這類(lèi)不平衡配子往往導(dǎo)致流產(chǎn)。羅氏易位的遺傳風(fēng)險(xiǎn)羅氏易位的遺傳風(fēng)險(xiǎn)染色體易位和生殖健康反復(fù)流產(chǎn)： 3-4%的反復(fù)流產(chǎn)患者存在染色體結(jié)構(gòu)異常 相互易位占 61%羅氏易位占 16% - Clifford et al. 1994; Franssen et al. 2005我院數(shù)據(jù)：共發(fā)現(xiàn)1425 易位攜帶者，其中相互易位 7

11、6.6% (1094/1428)，羅氏易位 23.4% (334/1428).反復(fù)流產(chǎn) 75.2% (1071/1425)嚴(yán)重男性因素 17.2% (245/1425)卵巢功能下降1.2% (18/1425) PGD用于易位攜帶者治療的歷史 產(chǎn)前診斷移植以來(lái)被有效的用來(lái)避免染色體異?；純撼霈F(xiàn)，但是診斷異常后流產(chǎn)給婦女帶來(lái)心理和生理的負(fù)擔(dān)，并可能導(dǎo)致生育障礙； 第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色體特異性DNA擴(kuò)增技術(shù)成功對(duì)人胚胎性別進(jìn)行診斷并獲得妊娠。- Handyside, AH. Nature,1990 1998年，F(xiàn)ISH技術(shù)被用于易位攜帶者的PGD診斷并獲得成功 - Conn CM et

12、 al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998 熒光原位雜交(FISH)熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是以利用熒光標(biāo)記的特定基因或染色體片段作為探針，與染色體特定序列DNA分子雜交，可以確定分裂細(xì)胞或間期細(xì)胞對(duì)應(yīng)染色體序列的位置及數(shù)目，以此檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。FISH技術(shù)有以下幾個(gè)特點(diǎn)： 安全、快速、靈敏度高； 探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存； 多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀(guān)； 可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析人類(lèi)干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心 * 中信湘雅生殖與遺傳專(zhuān)科醫(yī)院熒光原位雜交(FISH

13、-PGD)技術(shù)流程歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE) -FISH-PGD實(shí)踐指南ESHRE要求： 實(shí)驗(yàn)室胚胎活檢技術(shù)； 遺傳室細(xì)胞核玻片固定基礎(chǔ)，并對(duì)固定程序有詳細(xì)要求； 選擇合適的探針，對(duì)平衡易位患者需提前做好外周血淋巴細(xì)胞中期分裂相預(yù)實(shí)驗(yàn)；歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE) -FISH-PGD實(shí)踐指南細(xì)胞核玻片固定程序：活檢卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)；低滲液滴中處理5min；在圓圈標(biāo)記對(duì)應(yīng)的玻片正面部位加固定劑(Tween-20/HC1)，將低滲好的細(xì)胞轉(zhuǎn)至固定劑液滴中；待固定劑完全干燥后，可放在-20備用，或者直接進(jìn)入下一步；60烤片，30min-3h；RNase消化，

14、蠟?zāi)し馄瑵窈兄?7度孵育30min-1h；將RNase處理后的玻片依次過(guò)2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脫水；將玻片放入變性液中，75預(yù)變性3-5min（目的是將DNA雙鏈打開(kāi)）；玻片依次過(guò)75%、90%、100%酒精梯度脫水，2min/濃度，完全風(fēng)干；探針75變性5min；將探針加到風(fēng)干的玻片樣本上，雙層蠟?zāi)し馄?，置于濕盒中?7過(guò)夜（雜交4-6h）；玻片依次過(guò)洗滌液WS1三缸(45)，WS2兩缸（室溫），WS3一缸（室溫）；75%、90%、100%酒精梯度脫水，風(fēng)干；加入DAPI，處理3min后，直接熒光顯微鏡下觀(guān)察。歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE) -FISH-PGD實(shí)

15、踐指南平衡易位探針選擇和淋巴細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)探針的選擇：商業(yè)探針的使用需通過(guò)QC質(zhì)控；自制探針也需要進(jìn)行合適的QC/QA鑒定。所有探針在應(yīng)用到臨床檢測(cè)前都需經(jīng)過(guò)細(xì)胞雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估特異性、亮度及彌散度；對(duì)于所有平衡易位攜帶者，需要取用對(duì)應(yīng)易位區(qū)段合適的探針以及探針組合對(duì)夫妻雙方淋巴細(xì)胞中期分裂相及間期核進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)： 至少分析20個(gè)中期分裂相，確保探針位置在正確的染色體上，易位片段能被正確指示； 至少分析100個(gè)間期核，評(píng)估特異性、亮度及彌散度。歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE) -FISH-PGD實(shí)踐指南著絲粒探針位點(diǎn)特異性探針亞端粒探針一例相互易位攜帶者PGD，核型為： 46,XY,t(6;1

16、0)(q13; p15)，活檢2枚胚胎，對(duì)單卵裂球進(jìn)行FISH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1枚信號(hào)正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者舉例：平衡易位攜帶者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)制備的一個(gè)中期分裂相和一個(gè)間期核FISH探針：易位片段的亞端粒探針（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10號(hào)著絲粒片段的著絲粒探針（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。一例相互易位攜帶

17、者PGD，核型為： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活檢2枚胚胎，對(duì)單卵裂球進(jìn)行FISH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1枚信號(hào)正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者舉例：平衡易位攜帶者FISH-PGDFISH-PGD檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果：不同通道濾光片下觀(guān)察到的細(xì)胞核中的FISH探針熒光信號(hào)。a胚胎細(xì)胞核中每個(gè)探針均為2個(gè)雜交信號(hào)提示每個(gè)探針位點(diǎn)均為2個(gè)拷貝，表示易位相關(guān)的染色體組成為正?；蚱胶庖孜?。b胚胎核中均為1個(gè)紅色信號(hào)、3個(gè)綠色信號(hào)和2白色信號(hào)，分別提示6號(hào)易位片段為一個(gè)拷貝、10號(hào)易位片段為3個(gè)拷貝和10號(hào)著絲粒片

18、段為2個(gè)拷貝，表示該胚胎為臨近-1分離形成的6q136qter單體和10p1510pter三體不平衡產(chǎn)物。臨近-1分離模式圖Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good quality embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Biopsied embryo (m

19、edian(range)10 (1-30) 9 (1-24)Biopsied embryos27091420 Normal / balanced17.5% (475) 31.8% (451) Unbalanced69.5% (1882) 56.3%(799) Testing failure13.0% (352)12.0% (170)Cancelled cycles (rate)82(31.9%)24(16.1%)2006-2011 年我院易位攜帶者進(jìn)行d3 FISH-PGD結(jié)果正?；蚱胶庖孜慌咛ケ壤停绕涫窍嗷ヒ孜籖eciprocal translocation carriersRobert

20、sonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good quality embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Transferred embryo (median(range)2 (1-3) 2 (1-3)Cycles accepted transfer175125Clinical pregnancy rate per biopsied cycl

21、e33.5% (68/257) 32.2% (48/149) Clinical pregnancy rate per ET38.9% (68/175) 38.4% (48/125) Implantation rate32.2% (86/267) 28.1%(62/221)Miscarriage rate16.2% (11/68)16.7% (8/48)Live birth rate per Biopsy22.2% (57/257)26.8% (40/149)Health babies/delivered babies52/5235/352006-2011 年我院易位攜帶者進(jìn)行d3 FISH-P

22、GD結(jié)果單卵裂球單卵裂球FISHFISH幾種風(fēng)險(xiǎn)可能導(dǎo)致沒(méi)有準(zhǔn)確結(jié)果幾種風(fēng)險(xiǎn)可能導(dǎo)致沒(méi)有準(zhǔn)確結(jié)果：雜交背景干擾太強(qiáng)的情況雜交雜質(zhì)信號(hào)干擾的情況雜交失敗未見(jiàn)信號(hào)的情況固定或重雜交細(xì)胞核丟失的情況囊胚FISH相對(duì)卵裂期FISH更有優(yōu)勢(shì)？1.活檢細(xì)胞數(shù)的增多有利于信號(hào)的判定；2.直觀(guān)方便檢出胚胎嵌合體。胚胎胚胎序號(hào)序號(hào)Tel 7p信信號(hào)數(shù)號(hào)數(shù)Tel 8q信號(hào)數(shù)信號(hào)數(shù)CEP8結(jié)果提示結(jié)果提示1163626異常2173727異常3153525異常4272727正?；蚱胶庖孜徽；蚱胶庖孜?143424異常6272727正常或平衡易位正?；蚱胶庖孜?173727異常814342異常9163626異常102

23、43224222422異常11321222異常囊胚囊胚FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位舉例：平衡易位FISH面臨的挑戰(zhàn)不同實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)室FISH檢出率和準(zhǔn)檢出率和準(zhǔn)確率波動(dòng)較大確率波動(dòng)較大著床率和妊娠率隨著著床率和妊娠率隨著FISH檢檢測(cè)錯(cuò)誤率的上升而降低測(cè)錯(cuò)誤率的上升而降低FISHFISH技術(shù)局限技術(shù)局限FISH技術(shù)僅能檢測(cè)有限的染色體，因此患者經(jīng)FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未檢測(cè)的非整倍體異常妊娠而引發(fā)的早期流產(chǎn)或出生缺陷。FISH-PGD早期流產(chǎn)胚胎進(jìn)行比較基因組雜交檢測(cè)，檢出5號(hào)染色體重復(fù)。需要全染色體篩查為基礎(chǔ)的PGD技術(shù)？二、基于全染色體篩查的二、基

24、于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)PGD(PGD-CCS)PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了，避免了FISH僅能檢測(cè)少數(shù)染僅能檢測(cè)少數(shù)染色體的限制，采用全染色體篩查的方式對(duì)易位或倒位攜帶者進(jìn)行色體的限制，采用全染色體篩查的方式對(duì)易位或倒位攜帶者進(jìn)行PGD診斷，同診斷，同時(shí)排除其它染色體非整倍體異常。時(shí)排除其它染色體非整倍體異常。易位攜帶者的SNP-PGD臨床情況總結(jié)1. 囊胚+SNP活檢分析增加PGD診斷的準(zhǔn)確性2. 基于基于SNP的的PGD-CCS可以檢測(cè)出除易位染色體外其他染色體的異常，減少流產(chǎn)可以檢測(cè)出除易位染色體外其他染

25、色體的異常，減少流產(chǎn)易位攜帶者SNP-PGD的臨床結(jié)局總結(jié)0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%202122232425262728293031323334353637383940414344新發(fā)生異常率新發(fā)生異常率新發(fā)生異常率共分析共分析360 個(gè)患者年齡在個(gè)患者年齡在2044歲之間，平均新發(fā)生異常的幾率是歲之間，平均新發(fā)生異常的幾率是27.2% Age是否是否SNP-PGD需要用于每個(gè)易位攜帶者需要用于每個(gè)易位攜帶者?Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation car

26、riersD5-FISHSNP arrayD3-FISHD5-FISHSNP arrayD3-FISHTransfer cycles29771751238125Clinical pregnancy rate per ET55.2%(16/29)63.7%(49/77)38.9% (68/175) 83.3%(10/12)63.2%(24/38)38.4% (48/125) Implantation rate40%(16/40)59.5%(49/97)32.2% (86/267) 59.1%(10/17)54.9%(28/51)28.1%(62/221)Miscarriage rate25.0%

27、(4/16)8.16%(4/49)16.2% (11/68)0(0/10)12.5%(3/24)16.7% (8/48)Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 40種代謝疾病，可覆蓋大規(guī)模人群建立國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率數(shù)據(jù)庫(kù) 確認(rèn)診斷疾病，特別是稀有疾病疾病亞型分類(lèi)，或鑒別相似表型的不同疾病，進(jìn)行有效干預(yù) 拯救嬰兒生命，使他們更健康減少對(duì)社會(huì)和家庭帶來(lái)的負(fù)擔(dān)減少出生缺陷指導(dǎo)意義指導(dǎo)意義Next Generation Sequencing(NGS)NGS-PGD/PGS技術(shù)路線(xiàn)WGASNParray檢測(cè)NGS檢測(cè)平

28、行實(shí)驗(yàn)已知樣本非整倍體單個(gè)胚胎干細(xì)胞正常核型淋巴細(xì)胞FISH-PGD診斷為異常的胚胎重活檢淋巴細(xì)胞全基因組擴(kuò)增獲得產(chǎn)物臨床并行實(shí)驗(yàn)SNParray檢測(cè)NGS檢測(cè)建立平臺(tái)評(píng)估檢出率，準(zhǔn)確度等指標(biāo)，芯片與測(cè)序相當(dāng)方法學(xué)的建立2X 測(cè)序深度能覆蓋60%人類(lèi)基因組，10X深度能覆蓋90%人類(lèi)基因組。等位基因脫扣ADO率約5-20%；平均值為4%，近著絲粒區(qū)段發(fā)生ADO率相對(duì)較高。堿基對(duì)檢出誤差：C:GT:A.Before & after GC bias correction專(zhuān)為單細(xì)胞測(cè)序 CNV 分析而設(shè)置的算法，矯正WGA產(chǎn)生的GC偏差，使結(jié)果更接近基因組DNA測(cè)序水平。 NGS vs SN

29、Parray 在非整倍體與16M缺失重復(fù)的比較方法學(xué)的建立技術(shù)特點(diǎn) 高通量，高準(zhǔn)確度：使用新一代測(cè)序技術(shù)，克服PCR技術(shù)通量低的缺點(diǎn)。 不容易產(chǎn)生漏檢：可對(duì)所有23對(duì)染色體進(jìn)行檢測(cè)。FISH技術(shù)由于每一輪雜交的探針數(shù)目是有限的，無(wú)法對(duì)所有23對(duì)染色體進(jìn)行檢測(cè)，容易產(chǎn)生漏檢。 自動(dòng)化程度高：測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)SOAP比對(duì)，SegSeq軟件進(jìn)行分析我們前期已建立了FISH、SNP芯片技術(shù)檢測(cè)染色體異常，并與華大合作建立了單細(xì)胞水平的全基因組測(cè)序。2012年8月誕生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女?huà)?。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作三、單基因病PGDESHRE PGD工作組對(duì)擴(kuò)增基礎(chǔ)的PGD的

30、最佳實(shí)踐指南 單基因病PGD的流程 1. 預(yù)備實(shí)驗(yàn) 1.1 基因診斷 1.2 設(shè)計(jì)個(gè)性化方案 1.3 構(gòu)建單體型 1.4 基因組水平實(shí)驗(yàn) 1.5 淋巴細(xì)胞/廢棄胚胎細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn) 2. 臨床實(shí)驗(yàn) 2.1 臨床前預(yù)備實(shí)驗(yàn) 2.2 臨床診斷 3. 產(chǎn)前診斷1 1、等位基因脫扣（allele dropout, ADOallele dropout, ADO） 影響PGDPGD準(zhǔn)確性的主要因素之一，其發(fā)生率約為5-20%5-20%?？蓪?dǎo)致胚胎的誤診。導(dǎo)致ADOADO的原因目前仍未充分弄清。解決辦法： 采用多重PCRPCR的方法，加入標(biāo)記位點(diǎn)的檢測(cè)； 控制擴(kuò)增片段大小(40%aneuploid cells

31、25%aneuploid cells 25-40%aneuploid cells FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp.

32、 110, 2013真正會(huì)影真正會(huì)影響到移植響到移植風(fēng)險(xiǎn)的嵌風(fēng)險(xiǎn)的嵌合胚胎發(fā)合胚胎發(fā)生率僅為生率僅為5%.因?yàn)榻^大因?yàn)榻^大多數(shù)非整多數(shù)非整倍體異常倍體異常在內(nèi)細(xì)胞在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)團(tuán)與滋養(yǎng)層中共同層中共同發(fā)生。發(fā)生。而在滋養(yǎng)而在滋養(yǎng)層細(xì)胞中層細(xì)胞中可能嵌合可能嵌合存在更多存在更多異常。異常。嵌合對(duì)PGS診斷的影響如何理解卵裂期活檢的影響（Timelapse分析） 正常卵裂球的移除進(jìn)一步影響胚胎發(fā)育的潛能 異常卵裂球的存在影響胚胎的正常診斷囊胚活檢有替代卵裂期活檢的趨勢(shì)作者認(rèn)為：卵裂球活檢仍相對(duì)更加損傷胚胎，臨床結(jié)局顯示囊胚活檢應(yīng)是最為合適的植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的活檢時(shí)期。Fertil Steril.

33、 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.極體活檢風(fēng)險(xiǎn)最低的活檢方法極體活檢對(duì)胚胎沒(méi)有損傷，隨著極體染色體檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，如極體活檢對(duì)胚胎沒(méi)有損傷，隨著極體染色體檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，如更精確而且便宜的測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，極體活檢將成為未來(lái)更精確而且便宜的測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，極體活檢將成為未來(lái)PGD/PGS中一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)。中一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)。 討論：極體活檢vs囊胚活檢？避免嵌合的影響避免嵌合的影響不影響未來(lái)的胚胎不影響未來(lái)的胚胎僅檢測(cè)減數(shù)分裂錯(cuò)誤而未評(píng)估有絲分裂錯(cuò)僅檢測(cè)減數(shù)分裂錯(cuò)誤而未評(píng)估有絲分裂錯(cuò)誤，而有絲分

34、裂可能修復(fù)減數(shù)分裂錯(cuò)誤誤，而有絲分裂可能修復(fù)減數(shù)分裂錯(cuò)誤 能分析來(lái)自父母雙方的異常能分析來(lái)自父母雙方的異常嵌合嵌合(滋養(yǎng)外胚層可能不能代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán)滋養(yǎng)外胚層可能不能代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán)) 囊胚培養(yǎng)和玻璃化囊胚培養(yǎng)和玻璃化冷凍冷凍美國(guó)的Nathan Treff 代表與歐洲的Joep Geraedts達(dá)成了許多共識(shí)：極體活檢與囊胚活檢各有優(yōu)勢(shì)，不再建議進(jìn)行卵裂期活檢Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475早年P(guān)GS嘗試：利用動(dòng)物MII卵構(gòu)建人卵裂球分裂相技術(shù)難度大，構(gòu)建成功率低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。全染色體組篩查技術(shù)全染色體組篩查技術(shù)FISH: 9-11

35、條條chr所有23對(duì)人染色體都需要篩查CGH-比較基因組雜交比較基因組雜交aCGH: 基因組雜交芯片基因組雜交芯片Microarray SNP RealTime PCRNext Generation Sequencing全染色體篩查技術(shù)進(jìn)展1996 Sermon K., et al. Adaptation of the primer extension preamplification (PEP) reaction for preimplantation diagnosis: single blastomere analysis using short PEP protocols. Mol H

36、um Reprod. 1996; 2(3):209-212. (最早用最早用全基因組擴(kuò)增法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增法進(jìn)行PGD，但僅篩查幾個(gè)基因，但僅篩查幾個(gè)基因)1999 Wells D., et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 27:1214-1218. (首次使用單細(xì)胞首次使用單細(xì)胞mCGH做做PGS)2005 Knijnenburg J., et al. Rapid detection

37、 of genomic imbalances using micro-array consisting of pooled BACs covering all human chromosome arms. Nucleic Acids Res. 2005;12(33):e159. (首次用首次用aCGH做做PGS)2007 Treff NR., et al. Accurate 23 chromosome aneuploidy screening in human blastomeres using single nucleotide polymorphism (SNP) microarray.

38、Fertil Steril, 2007;86:s217. (首次用首次用SNParray做做PGS)2013 Eric J. Forman, et al.Comprehensive chromosome screening alters traditional morphology-based embryo selection:a prospective study of 100 consecutive cycles of planned fresh euploid blastocyst transfer (首次用首次用qPCR做做PGS)2013 Chunlei Zhang,et al.A

39、Single Cell Level Based Method for Copy Number Variation Analysis by Low Coverage Massively Parallel Sequencing (首次用首次用NGS做做PGS)Pubmed總體能夠搜索到2881篇文獻(xiàn)，自2002年至今，每年平均有176篇，稱(chēng)增長(zhǎng)趨勢(shì)作者作者技術(shù)技術(shù)研究對(duì)象研究對(duì)象結(jié)論結(jié)論Munn S,2002FISH1235枚淘汰卵裂期胚枚淘汰卵裂期胚胎，至少檢測(cè)胎，至少檢測(cè)3個(gè)卵裂個(gè)卵裂球球/胚。胚。發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)48%復(fù)雜嵌合異常，二倍體或多倍體異常占復(fù)雜嵌合異常，二倍體或多倍體異常占26%。25%

40、的胚胎發(fā)生了有絲分裂不分離，的胚胎發(fā)生了有絲分裂不分離，16號(hào)染色體最常號(hào)染色體最常發(fā)生異常，但嵌合率的高低與女性年齡無(wú)關(guān)。發(fā)生異常，但嵌合率的高低與女性年齡無(wú)關(guān)。Cupisti S, 2003FISH31-34歲女性卵子歲女性卵子31-34歲女性卵子的染色單體異常發(fā)生率約為歲女性卵子的染色單體異常發(fā)生率約為11%。Lucille Voullaire,2007CGH28名女性名女性176枚囊胚枚囊胚37歲以下女性非整倍體率歲以下女性非整倍體率18.9%；復(fù)雜異常率；復(fù)雜異常率27.9%；37歲以上女性非整倍體率歲以上女性非整倍體率42.6%；復(fù)雜異常率；復(fù)雜異常率27.8%Liang L,2013CGHarray平均年齡平均年齡40歲的高齡歲的高齡女性，檢測(cè)女性，檢測(cè)246枚囊胚枚囊胚RCT研究發(fā)現(xiàn)高齡女性正常胚胎率能達(dá)到研究發(fā)現(xiàn)高齡女性正常胚胎率能達(dá)到36%，有，有64.7%的病人有可移植胚胎，的病人有可移植胚胎，22個(gè)移植周期達(dá)到個(gè)移植周期達(dá)到50%的臨床妊娠率。的臨床妊娠率。證實(shí)證實(shí)PGS技術(shù)能夠顯著提高技術(shù)能夠顯著提高40歲以上歲以上女性的移植成功率及抱嬰率。女性