基因芯片在腫瘤研究中應(yīng)用

1、腫瘤的研究 美國1971年頒布國家癌癥條例開始抗癌大戰(zhàn) 使癌癥成為“慢性病”Concept of Neoplasm（瘤）“ is an abnormal mass of tissue, the growth of which exceeds and is uncoordinated with that of the normal tissues, and persists in the same excessive manner after cessation of the stimuli which evoked the change”Willis, 1952Basic Biologic F

2、eatures of NeoplasmsDifferentiationAbnormal ProliferationAngiogenesisInvasionSenescenceApoptosisNeoplasms Evolve in Multiple Steps Initiation: presumably occurs through irreversible or stable damage to DNA Promotion: an process bringing about a clonal expansion of initiated cells Progression: result

3、s when genetic instability leads to further mutagenic and epigenetic changes腫瘤的發(fā)生（Initiation） Tumor initiation：Cooperative DNA lesions as common final pathway Precancerous and incipient（初始 的） lesions Molecular targets：Oncogenes, tumor suppressor genes & DNA repair genes腫瘤的促進（promotion） Expansion

4、 of initiated cells Repetitive processInitiation & Promotion 致癌劑 腫瘤促進劑 低黃曲霉素B1Aflaloxin B1，高殺草強Amitrole，砷和其化合物Arsenic & compounds，高三氧化二砷Arsenic trioxide，高三硫化砷Arsenic trisulfide，高石棉Asbestos 癌基因（如myc 、ras） 需要反復(fù)刺激Initiation & PromotionTimeNo tumorNo tumorNo tumorNo tumorTumorTumor= Promoter

5、= InitiatorGr. 1Gr. 2Gr. 3Gr. 4Gr. 5Gr. 6Initiation & PromotionTarget Genes腫瘤的發(fā)展（progression） 腫瘤組織浸潤相鄰組織 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血道轉(zhuǎn)移 遠端轉(zhuǎn)移Apoptosis and Tumorigenesis小 結(jié) 腫瘤發(fā)生發(fā)展的三個階段基于基因表達譜的分子分型 為什么提倡利用分子水平進行腫瘤的分型？腫瘤的一般臨床學(xué)知識 腫瘤的診斷腫瘤的診斷腫瘤的臨床分期（腫瘤的臨床分期（stage）腫瘤的臨床分級（腫瘤的臨床分級（grade） 腫瘤的治療腫瘤的治療放療放療化療化療輔助治療輔助治療靶點治療靶點治療腫瘤

6、的臨床分期(stage) TNM分期分期 腫瘤的大小腫瘤的大小(T, tumor size) 腫瘤是否發(fā)生臨近的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤是否發(fā)生臨近的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N, node) 腫瘤是否有遠處轉(zhuǎn)移腫瘤是否有遠處轉(zhuǎn)移(M, metastasis)乳腺癌 分 期Tis Carcinoma in siteT1 Tumor 2.0 cm in greatest dimensionT2 Tumor 2.0 cm 5.0 cm in greatest dimensionT3 Tumor 5.0 cm in greatest dimensionT4 Tumor of any size with direct ext

7、ension to chest wall or skinN0 No regional lymph nodes metastasisN1 Metastasis to moveable ipsilateral axillary node(s)(同側(cè)腋下淋巴結(jié)同側(cè)腋下淋巴結(jié))N2 Metastasis to ipsilateral axillary node(s) fixed to one another or other structuresN3 Metastasis to ipsilateral internal mammary node(s)M0 No distant metastasisM1

8、 Distant metastasis (includes metastasis to ipsilateral supraclavicular（鎖骨）（鎖骨） lymph node(s)Stage 0 Tis N0 M0Stage I T1 N0 M0Stage IIa T1 N1 M0 T2 N0 M0Stage IIb T2 N1 M0 T3 N0 M0Stage IIIa T1,2 N2 M0 T3 N1,2 M0Stage IIIb T4 Any N M0 Any T N3 M0Stage IV Any T Any N M1問題：這樣的分期是否準(zhǔn)確反映了病人的預(yù)后情況？問題：這樣的分期

9、是否準(zhǔn)確反映了病人的預(yù)后情況？腫瘤的臨床分級(grade) 分級指標(biāo)分級指標(biāo): 細胞的異常形態(tài)，細胞的惡性生長速度。細胞的異常形態(tài)，細胞的惡性生長速度。 腫瘤細胞生長的分級腫瘤細胞生長的分級: 1 到到 3分別對應(yīng)級別的低，中，分別對應(yīng)級別的低，中，高，在臨床上常稱為高分化，中分化，低分化。級高，在臨床上常稱為高分化，中分化，低分化。級別越低，預(yù)后越好。級別越高，對放療和化療的敏別越低，預(yù)后越好。級別越高，對放療和化療的敏感度也較強。感度也較強。 腫瘤細胞與來源器官中細胞的相似程腫瘤細胞與來源器官中細胞的相似程度，分化良好的細胞有高度的特化特點，組織結(jié)構(gòu)度，分化良好的細胞有高度的特化特點，組織

10、結(jié)構(gòu)清晰，很容易辨認(rèn)。低分化的細胞組織結(jié)構(gòu)不清，清晰，很容易辨認(rèn)。低分化的細胞組織結(jié)構(gòu)不清，很難辨認(rèn)。很難辨認(rèn)。腫瘤的病理學(xué)診斷方法 冰凍切片和石蠟切片的染色和組織化學(xué)方法：確定腫冰凍切片和石蠟切片的染色和組織化學(xué)方法：確定腫瘤細胞的分化程度；鑒別腫瘤的類型；研究腫瘤組織瘤細胞的分化程度；鑒別腫瘤的類型；研究腫瘤組織發(fā)生發(fā)生 流式細胞術(shù)定量診斷（腫瘤細胞核形態(tài)參數(shù)）：癌流式細胞術(shù)定量診斷（腫瘤細胞核形態(tài)參數(shù)）：癌（瘤）細胞（瘤）細胞DNA含量的檢測；良性病變多為二倍體；含量的檢測；良性病變多為二倍體；惡性腫瘤多為非整倍體惡性腫瘤多為非整倍體 問題：單基因的組織化學(xué)檢測是否能準(zhǔn)確反映腫瘤類型及分

11、化程度？腫瘤的傳統(tǒng)檢測 傳統(tǒng)的腫瘤解剖分期(包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目，TNM)對于預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移價值不可低估，是臨床上較成熟的風(fēng)險評估指標(biāo)。 傳統(tǒng)的組織病理診斷：以組織形態(tài)、免疫組織化學(xué)染色；通常以單一基因的不同表現(xiàn)對腫瘤作出診斷。 問題：組織病理學(xué)上看起來一樣的腫瘤，其自然發(fā)展史、生物學(xué)行為以及對治療的反應(yīng)和預(yù)后等都會有所不同。從活檢標(biāo)本上看都象是腫瘤的兩個病人，他們都有腫瘤灶，你可以說它們看起一是一樣的，但事實上，一位病人已在別的部位有惡性生長了。腫瘤的化療 化療對分裂細胞有效，但腫瘤細胞不是體化療對分裂細胞有效，但腫瘤細胞不是體內(nèi)唯一具有分裂能力的細胞，所以化療對內(nèi)唯一具有分裂能

12、力的細胞，所以化療對正常分裂的細胞有一定的傷害。正常分裂的細胞有一定的傷害。腫瘤的放療 放療對旺盛生長和分裂的細胞有效。由于放療對旺盛生長和分裂的細胞有效。由于腫瘤細胞比起正常細胞在基因組上不穩(wěn)定，腫瘤細胞比起正常細胞在基因組上不穩(wěn)定，所以對放療的敏感度高于正常細胞，同時所以對放療的敏感度高于正常細胞，同時由于正常細胞具有完善的修復(fù)系統(tǒng)，比較由于正常細胞具有完善的修復(fù)系統(tǒng)，比較耐受放療。耐受放療。腫瘤的輔助治療 根據(jù)腫瘤的特殊性質(zhì)而制定的治療方法，根據(jù)腫瘤的特殊性質(zhì)而制定的治療方法，如激素治療如激素治療 也有把放療，化療結(jié)合激素治療的方法稱也有把放療，化療結(jié)合激素治療的方法稱為輔助治療為輔助治

13、療腫瘤的靶點治療 根據(jù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義的靶根據(jù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義的靶點基因而研制成的藥物，如乳腺癌的治療點基因而研制成的藥物，如乳腺癌的治療靶點基因靶點基因HER2，肺癌的靶點基因，肺癌的靶點基因EGFR腫瘤治療中存在的問題 放療，化療，激素治療的耐受 過度治療？基因芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用 應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)和多基因RT-PCR定量檢測方法來預(yù)測乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險及其對治療的反應(yīng)，取得一定突破。還存在諸如檢測方法的可重復(fù)性、腫瘤標(biāo)本的取材標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計學(xué)分析以及檢測結(jié)果核查的標(biāo)準(zhǔn)化等問題。 Ntzani和Ioannides在總結(jié)1995年到2003年4月MEDLINE共8

14、4篇關(guān)于此類技術(shù)的論文后發(fā)現(xiàn),只有30篇涉及臨床結(jié)果,他們提出,DNA微陣列技術(shù)還需大規(guī)模前瞻性臨床試驗證實,同時應(yīng)與現(xiàn)有的一些已知預(yù)測因子聯(lián)合進行比較,最后作出謹(jǐn)慎的審核與決定。 Stanford大學(xué)的Patrick Brown認(rèn)為：有用的診斷圖譜肯定會出現(xiàn)的，“當(dāng)二個生物標(biāo)本的差異足以引起我們的重視時，那么肯定在它們的基因表達上也有相應(yīng)的差異 一旦候選基因圖譜被確定，并集中到幾個關(guān)鍵基因上，就可利用簡單的技術(shù)如PCR針對較大的人群中對有效的、重復(fù)產(chǎn)生的改變進行檢測。如果一個基因在表達上的改變能重復(fù)出現(xiàn)，則這個基因就可用作基因診斷標(biāo)記物 基因芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用 腫瘤的生物學(xué)指標(biāo)(包括組織

15、學(xué)分級、biomarker、增殖指標(biāo)等)不僅能夠判斷腫瘤的預(yù)后，還能夠預(yù)測腫瘤對治療的反應(yīng)，并為腫瘤的個體化治療提供依據(jù)。 價值超過了解剖分期，是目前臨床研究的方向與重點之一。腫瘤的分子分型（分子診斷）1.腫瘤的分級2.腫瘤的分期，預(yù)后3.腫瘤放療化療或激素治療耐受4.腫瘤靶向轉(zhuǎn)移（腫瘤形成轉(zhuǎn)移的能力依賴于多種基因的聯(lián)合作用，腫瘤轉(zhuǎn)移的每個器官都需要不同組的基因）。腫瘤的分類：用表達圖譜區(qū)分出所檢測的標(biāo)本是正常組織還是腫瘤；若是腫瘤，又能區(qū)分出是良性還是惡性。運用基因芯片得到的Biomarker可用于腫瘤的早期診斷基因芯片在腫瘤研究中的應(yīng)用白血病的分類 腫瘤分類學(xué)在過去的30多年間進步不少，但

16、是在鑒定新的腫瘤類型（class discovery）和腫瘤分類（cancer classification）還缺乏通用的方法 急性白血病的分類方法：核的形態(tài)學(xué)分析，酶學(xué)免疫組化，染色體易位分析，任何一個分析都需要非常有經(jīng)驗的醫(yī)師進行詳盡的檢查以及分析，需要專業(yè)的實驗室來完成，但沒有一個單獨的測試能夠足以用于診斷 傳統(tǒng)的分類方法的聯(lián)合運用，一般而言比較準(zhǔn)確，但仍舊會出錯運用基因芯片表達譜對急性白血病分類 尋找在基因表達水平與預(yù)測ALL和AML密切相關(guān)的分子群 運用這一分子群，看如何能將已知分類的樣本進行準(zhǔn)確的分類預(yù)測，即尋找能進行分類的基因群（class predictor）（training

17、 set） 用新的樣本群檢測class predictor的準(zhǔn)確性(test set)Precise Classification of Cancer is the First Step in Rational TreatmentGene Expression Profiles Science 286:531 (1999)Distinguishing between acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML) is crucial because their therapies are differen

18、t.RNA from 38 bone marrow samples were hybridized to Affymetrix chips containing probes for 6,817 genes.The expression profiles of 50 genes clearly differentiate between the two types of cancer.乳腺癌的預(yù)后分類與治療 同一分期的乳腺癌病人在治療的反應(yīng)和總體的治療結(jié)果上有很大差異 傳統(tǒng)的用淋巴結(jié)狀態(tài)和組織化學(xué)檢測的方法無法準(zhǔn)確判斷腫瘤的臨床表現(xiàn) 化療和激素治療可以降低遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險約三分之一 7080的病

19、人不經(jīng)過化療等手段預(yù)后仍較好Gene Expression Signatures for Breast CancerApplication: Gene ExpressionIdentifying gene expression signature that reflects biological behavior of a tumor(預(yù)后好與預(yù)后差)70-gene prognostic profile tested295 breast cancer samplesoutperformed all clinical variables for predicting patient surviv

20、alMicroarray classifiers to direct customized therapyStarting point for targeted and rational drug developmentSupervised classification on prognosis signaturesPredict clinical outcomePrognosis of additional 19 patientsResults n231 genes were significantly associated with the disease outcomen70 genes

21、 were further selected to be optimal marker genenPrediction accuracy 80% 開發(fā)公司：Agendia芯片名稱：MammaPrint(R)Agendia Receives U.S. FDA Clearance For MammaPrint Breast Cancer Diagnostic TestAgendia announced that the U.S. Food and Drug Administration (FDA) has cleared the companys MammaPrint breast cancer

22、diagnostic test. MammaPrint is a gene expression profiling service to assess the risk of recurrence in breast cancer patients. MammaPrint represents a U.S. regulatory milestone as the first In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay (IVDMIA) to acquire market clearance from the FDA, and is the age

23、ncys first step toward standardizing these multi-gene expression tests. DNA陣列雜交結(jié)果最直接的影響是診斷；雜交結(jié)果中可以得到藥物靶標(biāo)基因，可為最后治療癌癥打下基礎(chǔ) 挑戰(zhàn)：隨著實驗技術(shù)及儀器的不斷改進和基因組數(shù)據(jù)的急劇增長，基因芯片產(chǎn)生的各種基因表達數(shù)據(jù)，規(guī)模龐大，內(nèi)容復(fù)雜；如何分析挖掘數(shù)據(jù)成為生物信息學(xué)中的挑戰(zhàn)性課題。 利用芯片檢測腫瘤組織中基因表達譜將成為研究腫瘤的一種標(biāo)準(zhǔn)方法?；蛐酒谀[瘤研究中的應(yīng)用小 結(jié) 目前腫瘤診斷和治療中存在的問題 利用基因芯片進行分子分型其他基因芯片類型在腫瘤研究中的應(yīng)用miRNA芯片C

24、GH芯片甲基化芯片等miRNA芯片microRNA microRNA(miRNA)是20 24nt的單鏈 RNA, 在進化上具有高度的保守性，它通過與靶mRNA 不完全互補配對，抑制蛋白翻譯,調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達，在基因調(diào)控中扮演了重要的角色。 MicroRNA 一般通過堿基配對結(jié)合到 mRNA 的 3 非翻譯區(qū)（ 3 -UTR ），從而抑制mRNA的翻譯發(fā)揮功能，在細胞分化，生物發(fā)育過程中起到重要的作用，并且參與疾病發(fā)生發(fā)展Differences in miRNA Mode of ActionmiRNAl microRNA在動植物中廣泛并保守的存在；l microRNA參與廣泛的生物學(xué)過程，尤其

25、是發(fā)育相關(guān)過程和組織特異性維持；l microRNA與target基因的交叉調(diào)控關(guān)系；l microRNA表達的基因芯片實驗發(fā)現(xiàn)在癌癥組織癌癥組織中miRNA廣泛失調(diào)廣泛失調(diào)；l microRNA的表達譜可以對不同癌癥甚至同種癌癥的不同亞型進行分類分類。miRNA在癌癥中的作用1. miRNA處于基因組中的脆性位點，在癌癥中常常缺失或擴增2. miRNA基因所在位點在癌癥中在表觀遺傳層面上被修飾調(diào)控3. miRNA發(fā)生相關(guān)基因如Drosha,Dicer在癌癥中表達失調(diào)Remains largely a mestery!探針Case 1433 was initially diagnosed as

26、 ERMS based on its histology and reactivity for desmin, smooth muscle actin and CD99，this case clustered tightly with the other ARMS included in the study. Subsequent demonstration of the fusion transcript PAX3-FKHR by reverse transcription (RT)PCR and sequencing in this sample confirms that this ca

27、se is indeed an ARMScase 5918 was initially diagnosed as a GIST based on its origin in the wall of the colon and reactivity for CD34. However this case clustered away from the eight other GISTs and instead clustered loosely with PRMS . Both KIT and DOG1 are highly expressed in the vast majority of G

28、IST. Case 5918 did not have immunoreactivity for KIT or DOG1 and no mutations were found in KIT exon 11, the most common mutation in GIST. Histologic review of the tumor suggested a new diagnosis of dedifferentiated liposarcoma.27 sarcomas, 5normal smooth muscle and 2 normal skeletal muscle tissuesm

29、icroRNA expression profiles classify human cancersLeukemiaSolid TumormicroRNA表達譜的不一致性很高 不同實驗室得出的microRNA表達譜結(jié)果很不一致：microRNA芯片技術(shù)的難度和不成熟性。 RNA類型：總RNA進行實驗可能同時檢測了成熟的miRNA與前體miRNA。如果miRNA成熟受阻，則可以解釋此矛盾。這暗示，前體miRNA可能含有獨立的，還未知的功能。使用純化的小RNA進行實驗可能會引入錯誤：目前無法測量小RNA在總RNA中的比例情況，如果癌癥與良性組織含有不同比例的小RNA，那么純化小RNA實驗的前提（同

30、樣量的miRNA被純化得出）則會受到根本的影響。樣本量對結(jié)果的影響PC3 cells were transduced with adenovirus either encoding p53 or containing an empty vector. After 48 h, small RNA was characterized with PCR Arrays containing 376 human miRNA-specific assays. The heat map visualizes the fold-differences in miRNA expression upon p53

31、over-expression (red, up-regulated miRNA; green, down-regulated miRNA; black, no difference). PCR Arrays are the most reliable tools for analyzing the expression of a focused panel of genes. Each 96-well or 384-well plate includes SYBR Green-optimized primer assays for a thoroughly researched panel

32、of relevant, pathway- or disease-focused genes. PCR Arrays can also be customized to contain a panel of genes tailored to your specific research interests. 比較基因組雜交芯片CGH array雜合性缺失（loss of heterozygosity） 雜合性指同源染色體中不同等位基因存在于一個或多個基因位點中的現(xiàn)象；野生型拷貝或等位基因發(fā)生缺失就稱為雜合性缺失（LOH），LOH通常是由染色體缺失或重組引起。絕大多數(shù)人類腫瘤都存在非隨機性的染

33、色體片段丟失。雜合性缺失在腫瘤細胞中是一種非常常見的DNA變異。 腫瘤中存在基因的擴增 通過比較腫瘤組織與體細胞組織中野生型和突變DNA的比值可以檢測LOH以及基因的擴增；比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH ） 一種分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，能夠通過一個簡單的雜交反應(yīng)檢測出整個基因組DNA拷貝數(shù)改變。主要原理是采用經(jīng)過熒光標(biāo)記的腫瘤基因組DNA和正常基因組DNA為探針，與正常人中期染色體標(biāo)本進行原位雜交，根據(jù)兩種探針熒光信號的強度差異找出基因組中DNA的增加或缺失區(qū)域。DNA Extraction & LabelHybMetaphase

34、 Chromosome ScanImage aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization)比較基因組雜交（簡稱CGH）的方法被用來監(jiān)測染色體基因組的改變。CGH最突出的優(yōu)點在于：通過一次實驗就能完成對整個基因組中所有遺傳物質(zhì)增加或丟失的分析，實驗所使用的DNA可以是從新鮮凍存的組織中提取的，也可以提取自福爾馬林固定石蠟包埋的保存材料。CGH主要用于腫瘤細胞染色體DNA片段的缺失和增加的檢測,同時對其它與染色體拷貝數(shù)變化有關(guān)的疾病也能進行分析和檢測，如小兒自閉癥，先天性發(fā)育遲緩等一系列遺傳病癥。 Array CGH就是一種新的用于檢測腫瘤細胞染色體拷

35、貝數(shù)變化的技術(shù)，該項技術(shù)能夠通過一個簡單的雜交反應(yīng)檢測出整個基因組DNA拷貝數(shù)改變。主要原理是采用經(jīng)過不同顏色熒光標(biāo)記的腫瘤基因組DNA和正?；蚪MDNA與芯片上結(jié)合的覆蓋全部人類基因組的寡核苷酸探針雜交，根據(jù)雜交后兩種探針熒光信號的強度差異找出基因組中DNA的增加或缺失區(qū)域。 aCGH的特點: 高通量（覆蓋人類全基因組的探針設(shè)計，包括針對基因外顯子、內(nèi)含子和基因間序列的探針，一張芯片上探針的數(shù)量接近24萬個探針），高分辨率（24萬個探針的平均分辯率在6.4KB,對目前較為了解的基因來說，可以檢測到這些具體的基因的單個拷貝數(shù)的變化Agilent，Nimblegen分辨率為6KB）。利用基因芯片

36、并行檢測前列腺癌利用基因芯片并行檢測前列腺癌染色體畸變和基因表達譜染色體畸變和基因表達譜研究所用研究所用48例前列腺癌樣本和例前列腺癌樣本和10例正常樣本（例正常樣本（9例前列腺組織例前列腺組織和和1例腎臟組織）由北京大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供例腎臟組織）由北京大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供表達譜分析25例前列腺癌樣本和3例正常前列腺組織進行了表達譜芯片實驗，以混合的人類胚胎組織為通用參照。運用平均ratio值（R 0.5 or R -0.5）和非參數(shù)t檢驗（p 0.1）雙重標(biāo)準(zhǔn)篩選前列腺癌差異表達基因，并對差異表達基因進行EASE分析。array-CGH18例前列腺癌樣本和1例腎臟組織（正常對照）進行了array-CGH實驗。