基因工程概念

1、基因工程概念15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念 一、基因工程的概念：一、基因工程的概念： 利用利用DNADNA體外重組或體外重組或PCRPCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中擴增技術(shù)從某種生物基因組中 別離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然別離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然 后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反響形成重組后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反響形成重組DNADNA分分 子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過 程程. .基因工程基因工程(gene engineering)(gene eng

2、ineering)常和以下名稱混用常和以下名稱混用遺傳工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重組DNA技術(shù)(recombination DNA technique)克隆(clone): 作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念二、基因工程的主要內(nèi)容或步驟二、基因工程的主要內(nèi)容或步驟1 1、從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或、從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消

3、化或PCRPCR擴增等步驟，擴增等步驟，別離出帶有目的基因的別離出帶有目的基因的DNADNA片段。片段。2 2、在體外，將帶有目的基因的外源、在體外，將帶有目的基因的外源DNADNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組有選擇記號的載體分子上，形成重組DNADNA分子。分子。3 3、將重組、將重組DNADNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細胞分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細胞( (亦稱寄主細胞亦稱寄主細胞) )，并與之一，并與之一起增殖。起增殖。4 4、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNADNA分子的受體細胞分子

4、的受體細胞克隆?？寺?。5 5、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。供進一步分析研究使用。6 6、將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)、將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念三、三、基因工程的應(yīng)用醫(yī)藥：醫(yī)藥： 生物制藥；基因治療；人工器官生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè) 轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、

5、抗逆新品種、轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、 高品高品質(zhì)新品種質(zhì)新品種 轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品 生物反響器：利用動植物細胞或組織作為生物反響器，生物反響器：利用動植物細胞或組織作為生物反響器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品輕工與食品 新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶 環(huán)境環(huán)境 污染治理；廢物利用；污染物生物降解污染治理；廢物利用；污染物生物降解15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念供 體 細 胞目 的 基 因載 體重 組 D N A分 子轉(zhuǎn) 化 細 胞受

6、體 細 胞多 肽 藥 物疫 苗 、 抗 體基 因 治 療基 因 診 斷 轉(zhuǎn) 基 因 動 物(畜 牧 業(yè) 、 漁 業(yè) 生 物 反 應(yīng) 器 )轉(zhuǎn) 基 因 植 物(農(nóng) 業(yè) 、 林 業(yè) 生 物 反 應(yīng) 器 )冶 金 、 環(huán) 保輕 工 、 食 品15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念轉(zhuǎn)基因動物作轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器為生物發(fā)生器15.1 15.1 基因工程的概念基因工程的概念15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNADNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子

7、的甲基化 核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸連接酶核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 核酸末端修飾酶核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 其它酶類其它酶類用于生物細胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 一、限制性內(nèi)切酶 一、限制修飾系統(tǒng)的種類一、限制修飾系統(tǒng)的種類 二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 三、限制酶的特點三、限制酶的特點 四、異源同序酶四、異源同序酶isoschizomer，同裂酶，同裂酶 五、限制酶的用途五、限制酶的用途15.2 15.2

8、基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶一種限制酶只一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列；能識別一種特定核苷酸序列；并并在特定在特定切點切割切點切割限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀 來源：來源： 種類：種類： 作用：作用：主要是微生物主要是微生物40004000種。種。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶一、限制修飾系統(tǒng)的種類一、限制修飾系統(tǒng)的種類1.1. 型：由三個基因構(gòu)成，型：由三個基因構(gòu)成，hsdRhsdR；hsdMhsdM；hsdShsdShost specificity host specificity for DNA restriction m

9、odification and specificityfor DNA restriction modification and specificity位于染色位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要體上，三個基因構(gòu)成一個復(fù)合體，限制酶需要ATPATP、Mg2+Mg2+、SAMSAM腺苷甲硫氨酸，無特異切割位點。腺苷甲硫氨酸，無特異切割位點。2.2. 型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在. coli. coli中這兩種基因位于中這兩種基因位于質(zhì)粒上。質(zhì)粒上。3.3. 型：修飾酶與型酶相同，型：修飾酶與型酶相同，hsdhsd與與hsdhsd基因產(chǎn)物結(jié)合成

10、一亞單位，基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。限制酶是獨立存在的。 上述三個系統(tǒng)中，只有上述三個系統(tǒng)中，只有IIII型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 1. 定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶；定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指狹義指型限制酶。型限制酶。 2. 命名：限制酶由三局部構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、別命名：限制酶由三局部構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、

11、別離順序。離順序。例如：例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae，“表示菌系為型血清型；表示菌系為型血清型；“表示別離到的第三個限制表示別離到的第三個限制酶。酶。 EcoRIEscherichia coli RI 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶三、限制酶的特點三、限制酶的特點 1. 識別順序和酶切位點識別順序和酶切位點 識別識別-8個相連的核苷酸個相連的核苷酸 MboI NGATCN； AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC： PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； Sf

12、iI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG 富含富含 對稱性對稱性雙對稱雙對稱 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和和-15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 2. 2. 末端種類末端種類 - -端突起，個數(shù)為或個核苷酸端突起，個數(shù)為或個核苷酸 Pst I 5 Pst I 5-CTGCAG-3-CTGCAG-3 5 5-CTGCA G-3-CTGCA G-3 3 3-

13、GACGTC-5-GACGTC-5 3 3-G ACGTC-5-G ACGTC-5 - -端突起，個數(shù)為或個核苷酸端突起，個數(shù)為或個核苷酸 EcoRI 5 EcoRI 5-GAATTC-3-GAATTC-3 5 5-GOH PAATTC-3-GOH PAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 3 3-CTTAAP HOG-5-CTTAAP HOG-5 粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別 位點的位點的DNADNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組D

14、NADNA分子。在進行分子。在進行 DNA DNA重組時，應(yīng)用限制酶同時切割目的基因和載體重組時，應(yīng)用限制酶同時切割目的基因和載體DNADNA，使之產(chǎn)生相對的粘，使之產(chǎn)生相對的粘 性末端，然后再將二者連接成重組性末端，然后再將二者連接成重組DNADNA分子分子15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 EcoR 5- G-A-A-T-T-C-3 3- C-T-T-A-A-G-5 Palindrome 5 5-GOH PAATTC-3 3 3 3-CTTAAP HOG-5 5Cohesive Ends (Sticky Ends)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具

15、酶SmaI 5 5-CCCGGG-3 3 5 5-CCC GGG-3 3 3 3-GGGCCC-5 5 3 3-GGG CCC-5 5Blunt Ends15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 平齊末端平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 非互補的粘性末端非互補的粘性末端 切點在識別順序之外的，如：切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 能識別簡并順序的，如：能識別簡并順序的，如：AvaI A

16、vaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶四、異源同序酶四、異源同序酶isoschizomerisoschizomer，同裂酶，同裂酶 1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶或多種限制酶 2. 特點：特點：1識別相同順序識別相同順序 2切割位點的異同切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶五、五、

17、 限制酶的用途限制酶的用途 1. DNA重組重組 2. 限制酶物理圖譜繪制限制酶物理圖譜繪制 3. 突變分析突變分析RFLP分析分析 4. 限制酶的局部酶切與完全酶切限制酶的局部酶切與完全酶切附：附：IIS型限制酶的特點型限制酶的特點 1. 具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。 2. 酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1- 20nt。 3. 酶切后的末端經(jīng)補平后又可發(fā)生酶切反響。酶切后的末端經(jīng)補平后又可發(fā)生酶切反響。 4. 產(chǎn)生粘性末端可以是產(chǎn)生粘性末端可以

18、是1-5個核苷酸。個核苷酸。 5. 均為單體，分子量為均為單體，分子量為47108 kD。15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶Restriction Maps (a)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶Restriction Maps (b)15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連與載體相連甲基甲基化酶化酶人工人工接頭接頭RE用于基因組文庫的建立用于基因組文庫的建立用于用于cDNA的連接的連接RERERE15.2 15.2 基因工程中的工具酶

19、基因工程中的工具酶二、二、DNADNA聚合酶聚合酶一、一、E.coli DNAE.coli DNA聚合酶聚合酶I Ipol pol 1. E.coli 1. E.coli 的的DNADNA聚合酶系統(tǒng)聚合酶系統(tǒng) Pol Pol 參與參與DNADNA修復(fù)修復(fù), , 具具3 355和和5 533外切酶活外切酶活性性 pol pol 同上同上 具具3 355外切酶活性外切酶活性 pol pol 參與參與DNADNA復(fù)制復(fù)制, , 具具3 355和和5 533外切酶活性外切酶活性 2. E.coli pol 2. E.coli pol的特點的特點 1 1具兩種外切酶活性和具兩種外切酶活性和DNADNA聚

20、合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具成兩個大小不同的片段，其中小片段具5 533外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具3 355外切酶活性外切酶活性( (大片段亦稱為大片段亦稱為KlenowKlenow片段片段, polIK), polIK) 2 2 聚合酶活性，聚合酶活性，5 533, , 要求要求3 3-OH-OH引物和模板引物和模板DNADNA，其延續(xù)性受，其延續(xù)性受反響條件的影響反響條件的影響 3 3 外切酶活性外切酶活性 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶 3. 3. 用途用途 1 1 除去除

21、去3 3- -端突起的單鏈端突起的單鏈DNADNA在無在無dNTPdNTP時時 2 2 補齊補齊5 5- -突起端突起端 3 3 合成第二條合成第二條cDNAcDNA 4 4 切口移位制備探針切口移位制備探針 其中用途其中用途2) 2) 和和3)3)常用大片段常用大片段15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶三、連接酶一、一、T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 1. 1. 特點：特點： 只連接只連接ds -DNAds -DNA分子，要求分子，要求3 3- -羥基和羥基和5 5- -磷酸基磷酸基 2. 2. 用途：用途： 1) 1) 相同或相容粘性末端的連接相同或相容粘性末端的

22、連接 2) 2) 平整末端的相連平整末端的相連 DNA DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果平端來源：限制酶作用結(jié)果; ; 限制酶與其它酶共同作限制酶與其它酶共同作用結(jié)果用結(jié)果 。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多酶量也多 15.2 15.2 基因工程中的工具酶基因工程中的工具酶5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或

23、或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA連接酶連接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 T4 DNAT4 DNA連接酶的連接反響連接酶的連接反響( (兩種插入方向兩種插入方向) ) +The polymerase chain reaction (PCR)：to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each complementary to

24、 one end of the the DNA target sequence. 1985年，美國年，美國Cetus 公司和加利福尼亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)立了公司和加利福尼亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)立了一種核酸體外擴增技術(shù)。一種核酸體外擴增技術(shù)。15.315.3 Polymerase Chain Reaction Denaturation 變性變性: The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95 Primer annealing 引物退火引物退火: The temperature is reduced to around

25、 55 to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg+15.315.3 Polymerase Chain Reaction15.4 15.4 Vectors 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性； 二、質(zhì)粒DNA的別離與純化； 三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型； 四、常用質(zhì)粒載體舉例；一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性一、質(zhì)

26、粒的一般生物學(xué)特性一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒DNADNA1 1、質(zhì)粒是細菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的、質(zhì)粒是細菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的DNADNA分子。分子。2 2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R R質(zhì)粒。質(zhì)粒。R R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細胞，質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。2 2、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染

27、色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。3 3、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA不僅能在細菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真不僅能在細菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。4 4、環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒、環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNADNA分子具有三種不同的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀分子具有三種不同的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀DNADNA

28、cccDNAcccDNA，開，開環(huán)環(huán)DNADNAocDNAocDNA，線性，線性DNADNAcDNAcDNA，具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠，具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。電泳中分開。二、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性二、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性1 1、質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指某種質(zhì)粒在一個細菌細胞內(nèi)的數(shù)目。、質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指某種質(zhì)粒在一個細菌細胞內(nèi)的數(shù)目。 根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)?？截惛鶕?jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)少，為數(shù)少，為1-51-5個與松弛型復(fù)制質(zhì)粒拷貝數(shù)多，可達個與松弛型復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)多，可達10-200

29、10-200份拷貝。因此，作份拷貝。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。2 2、質(zhì)粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切、質(zhì)粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構(gòu)成中，其中的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥稀釋掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。必然有一種會被逐漸地排斥稀釋掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。15.4 15.4 Vectors二、質(zhì)粒二、

30、質(zhì)粒DNADNA的別離與純化的別離與純化15.4 15.4 Vectors三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型 一質(zhì)粒載體的開展概況；一質(zhì)粒載體的開展概況； 二質(zhì)粒載體的特點根本條件；二質(zhì)粒載體的特點根本條件； 三遺傳標(biāo)記基因三遺傳標(biāo)記基因 四質(zhì)粒載體的類型四質(zhì)粒載體的類型15.4 15.4 Vectors一開展概況一開展概況 1. 第一階段第一階段1977年前：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如年前：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二階段：增大載體容量降低載體長度，建立

31、多克隆位點區(qū)和新的第二階段：增大載體容量降低載體長度，建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。系列載體。 3. 第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。型載體。 15.4 15.4 Vectors二載體特點二載體特點1、 至少有一個復(fù)制起點，因而至至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。少可在一種生物體中自主復(fù)制。2、 至少應(yīng)有一個克隆位點，以供

32、外至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源源DNA插入。插入。3、 至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組指示載體或重組DNA分子是否進分子是否進入宿主細胞。入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。拷貝數(shù)。注：前三個特點必不可少注：前三個特點必不可少。p pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )三遺傳標(biāo)記基因三遺傳

33、標(biāo)記基因1、 標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因的作用 1指示外源指示外源DNA分子載體或重組分子是否進入宿主細胞分子載體或重組分子是否進入宿主細胞 這種指示可以是選擇性的這種指示可以是選擇性的Ampr ，Tetr ，Kanr，也可以，也可以是非選擇性的如是非選擇性的如lacZ 2指示外源指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。分子是否插入載體分子形成了重組子。 * 這種指示也可以是選擇性的如這種指示也可以是選擇性的如TcS，也可以是非選擇性的如，也可以是非選擇性的如TcS， lacZ，絕大多數(shù)為后者。，絕大多數(shù)為后者。 *有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項作用。當(dāng)充任第一作用時，最好有的遺傳標(biāo)記基

34、因可以完成上述兩項作用。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的檢測性檢測性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因lacZ等。等。2 2、 標(biāo)記基因的種類標(biāo)記基因的種類 1 1抗性標(biāo)記基因可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子抗性標(biāo)記基因可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子 主要是抗生素抗性基因主要是抗生素抗性基因: Ampr : Ampr ，Tetr Tetr ，CmlrCmlr，KanrKanr，StrrStrr 2 2生化標(biāo)記基因生化標(biāo)記基因 其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反響，如

35、其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反響，如lacZlacZ3 3、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機制、常用的遺傳標(biāo)記基因及其作用機制 1) 1) 四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因 Tetr Tetr ，TcrTcr Tetracycline Tetracycline 可結(jié)合在核糖體可結(jié)合在核糖體30s30s亞基亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種環(huán)素抗性基因編碼一種399 AAs399 AAs蛋白質(zhì)，與細菌細胞蛋白質(zhì)，與細菌細胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。 2) 2) 氨芐青霉素抗

36、性基因氨芐青霉素抗性基因 Ampr Ampr ，AprApr Ampicillin Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。壁合成酶類的活性。AprApr抗性基因編碼一種分泌到細抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質(zhì)的酶，可特異地切割氨芐青霉素的菌細胞周間質(zhì)的酶，可特異地切割氨芐青霉素的內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 Cmlr ，Cmr Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體可結(jié)合在核糖體50 S亞基上，阻止蛋白亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素

37、乙基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙酰化，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。酰化，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。4) 卡那霉素卡那霉素(Kanr), 新霉素新霉素(Neor)和和G418抗性抗性(G418r)基因基因 Kanamycin，Neomycin和和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內(nèi)。細胞內(nèi)。5半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ 和和lacZ 半乳糖苷酶

38、基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩局部：酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩局部：鏈和鏈和鏈。前者負責(zé)四聚體裝配，鏈。前者負責(zé)四聚體裝配，后者具后者具半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為活性，該作用稱之為-互補作用。這兩個局部可獨立存在，互補作用。這兩個局部可獨立存在， 分別由分別由兩個基因編碼。為兩個基因編碼。為鏈編碼的基因稱之為鏈編碼的基因稱之為lacZ(編碼編碼145 AAs)。這兩。這兩個基因個基因LacZ和和LacZ均可作為標(biāo)記基因。均可作

39、為標(biāo)記基因。 lacZlacZ中含有多克隆位點，當(dāng)無外源中含有多克隆位點，當(dāng)無外源DNA片段插入時，質(zhì)粒表片段插入時，質(zhì)粒表達達半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽，與缺失突變體宿主菌不能編碼肽，與缺失突變體宿主菌不能編碼-肽表達的肽表達的lacZ基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 鏈互補，產(chǎn)生有活性的鏈互補，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示半乳糖苷酶，在含有指示劑劑X-gal和誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了壞了lacZ -肽基因的結(jié)構(gòu)，細菌內(nèi)不能產(chǎn)生肽基因的結(jié)構(gòu)，細菌內(nèi)不能產(chǎn)生半乳糖苷酶活性，菌落呈半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。白色。

40、半乳糖苷酶基因的優(yōu)點半乳糖苷酶基因的優(yōu)點: a. 酶催化酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZ編碼編碼5-端可容許很大的變化如參加多克隆位點而不影響端可容許很大的變化如參加多克隆位點而不影響酶活性酶活性 c. lacZ和和鏈基因的分別表達可使載體小而容量大鏈基因的分別表達可使載體小而容量大 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18 BamHI片段片段重組重組DNADNA分子分子 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap

41、的平板上的平板上,白色菌落為重組白色菌落為重組子，子，蘭色菌落蘭色菌落為為原載體原載體利用利用LacZ基因篩選重組子基因篩選重組子四、質(zhì)粒載體的類型1 1、根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分、根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分 1 1. . 質(zhì)粒型載體質(zhì)粒型載體環(huán)狀環(huán)狀dsDNAdsDNA分子，自主復(fù)制分子，自主復(fù)制 2 2. . 病毒型載體病毒型載體環(huán)狀、線狀、環(huán)狀、線狀、ss-ss-和和ds-DNAds-DNA分分子，形成病毒顆粒子，形成病毒顆粒 3 3. .混合型載體混合型載體具質(zhì)粒和病毒特性，特性的具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細胞生物學(xué)特性轉(zhuǎn)換依賴于宿主細胞生物學(xué)特性 15.4 15.4

42、 Vectors2 2、根據(jù)載體功能劃分、根據(jù)載體功能劃分 1 1. . 普通型載體普通型載體 1) 1) 特點特點: : 至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因，其至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因，其中一中一 個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子檢測。個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子檢測。 2) 2) 用途用途: : 基因組或基因組或cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建; ;次克隆次克隆(subcloning)(subcloning)或限制酶譜分析；外源或限制酶譜分析；外源DNADNA擴增。擴增。 例子例子: pBR322: pBR322和和pUCpUC載體。載體。 上述兩例中的非重組

43、子來源有兩個：上述兩例中的非重組子來源有兩個： a. a. 酶切反響時仍未被作用的酶切反響時仍未被作用的pBR322pBR322或或pUC18pUC18分子分子 b. b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子15.4 15.4 Vectorsp pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )EcoSacKpnSmaBamXbaSa

44、lPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19載體載體普通型載體普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)圖圖2 2、表達型載體、表達型載體expression vectorexpression vector 1) 1) 特點特點: : a. a. 基因的啟動子序列和終止子序列；基因的啟動子序列和終止子序列； b. b. 一般無檢測標(biāo)記基因；一般無檢測標(biāo)記基因； c. c. 克隆位點是確定的即

45、位于啟動子序列后；克隆位點是確定的即位于啟動子序列后； d. d. 重組分子用凝膠電泳檢出依賴于分子量差異。重組分子用凝膠電泳檢出依賴于分子量差異。 2) 2) 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): : a. a. 轉(zhuǎn)化單元轉(zhuǎn)化單元-宿主細胞轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化 b. b. 表達單元表達單元-外源基因表達外源基因表達 3) 3) 類型類型: : 型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控序列型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控序列+ +啟動子啟動子+ + 終止子終止子 型型: : 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子 + + 翻譯起始區(qū)核糖體結(jié)合序列和起始密碼翻譯起始區(qū)核糖體結(jié)合序列和起始密碼子子+ + 終止子終止子 型型: : 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)轉(zhuǎn)錄起始區(qū) + + 翻譯起始

46、區(qū)翻譯起始區(qū) + + 信號肽鏈編碼區(qū)信號肽鏈編碼區(qū) + + 終止子終止子常稱之為表達分泌型載體常稱之為表達分泌型載體15.4 15.4 VectorsTAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIO ri轉(zhuǎn) 錄 起 始 翻 譯 起 始 信 號 肽 成 熟 蛋 白 質(zhì) 轉(zhuǎn) 錄 終 止 區(qū)C SC SC SC S-cloning site三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖15.4 15.4 VectorsPlasmids Easy to use and store. Recombinant plasmids readily select

47、ed with antibiotics.Lambda phage Useful for cloning large (15-20Kb fragments).Cosmids Combined plasmid/phage vector permits cloning of even larger (e.g.45Kb)DNA fragments.Yeast plasmids Permit direct studies on eukaryotic gene regulation.Plant plasmids Bacterial(Agrobacterium)infection of plant transfers Ti plasmid into host plant cells.Type of Vector Advantage四、常用質(zhì)粒載體舉例1 1、pBR322pBR322載體載體