碩士研究生分子生物學(xué)實驗步驟

1、實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容感受態(tài)細菌的制備感受態(tài)細菌的制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、平板篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、平板篩選質(zhì)粒的擴增、質(zhì)粒提?。▔A裂解法）質(zhì)粒的擴增、質(zhì)粒提?。▔A裂解法）質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及電泳鑒定的限制性內(nèi)切酶酶切及電泳鑒定真核細胞基因組真核細胞基因組DNA的分離純化（蛋白酶的分離純化（蛋白酶K法）法）DNA紫外定性、定量分析及電泳鑒定紫外定性、定量分析及電泳鑒定真核組織總真核組織總RNA提?。ㄌ崛。═RIzol試劑法）試劑法）RNA紫外定性、定量分析及甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定紫外定性、定量分析及甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR擴增目的基因擴增目的基因 mRNA的反轉(zhuǎn)錄的反轉(zhuǎn)錄 PCR及鑒定

2、及鑒定一、感受態(tài)細菌的制備一、感受態(tài)細菌的制備1.取出液氮或低溫冰箱中貯存的大腸桿菌在取出液氮或低溫冰箱中貯存的大腸桿菌在LB瓊脂平板上劃線瓊脂平板上劃線,37 過夜至長過夜至長出單菌落出單菌落。2. 挑選瓊脂培養(yǎng)平板上的單菌落挑選瓊脂培養(yǎng)平板上的單菌落, 接種接種到含有到含有3 m1 LB培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37振振搖過夜。次日取菌液搖過夜。次日取菌液1 m1接種至含有接種至含有100 m1 LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的500 m1燒瓶中，燒瓶中，37劇烈振搖（劇烈振搖（200300 rpm）培養(yǎng)約培養(yǎng)約23 h，待待OD600值達到值達到0.30.4時將燒瓶時將燒瓶取出立即置冰浴取出立

3、即置冰浴1015 min。 自該步驟起皆需無菌操作。自該步驟起皆需無菌操作。 3. 將細菌轉(zhuǎn)移到一個預(yù)冷的將細菌轉(zhuǎn)移到一個預(yù)冷的1.5 ml滅菌的離心管中。滅菌的離心管中。于于4離心，離心，8000 g1 min回收細胞?；厥占毎?。 4. 棄去上清，將管倒置于濾紙上棄去上清，將管倒置于濾紙上 1 min。 5. 加加 1ml 4預(yù)冷的預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2重懸菌體，冰浴重懸菌體，冰浴30分鐘。分鐘。 6. 4離心離心1 min, 回收菌體。棄去上清，將管倒置于濾紙上回收菌體。棄去上清，將管倒置于濾紙上1 min。 7. 加加 0.1 ml 4 預(yù)冷的預(yù)冷的 0.1 mol/LCaC

4、l2重懸菌體，重懸菌體，置置4 冰箱過夜冰箱過夜。 即可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化。即可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化。 注意事項注意事項 潔凈是最重要的。潔凈是最重要的。 離心力要注意不要超過離心力要注意不要超過2500g,建議建議1500-2000g 5min。 涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。分鐘）這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。

5、 預(yù)冷是必要的。預(yù)冷是必要的。 二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、平板篩選二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、平板篩選 制備含含制備含含100g/ml氨芐青霉素（氨芐青霉素（Amp）的）的LB瓊脂平板瓊脂平板上上 （50 時加入時加入Amp ） 取取感受態(tài)細菌感受態(tài)細菌100l置于無菌置于無菌EP管中；管中； 加入重組加入重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA10 l，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置30min，42 熱休克熱休克90sec90sec（勿超時?。?，冰浴速冷（勿超時?。?，冰浴速冷1-1-2min2min。 加入無抗生素的加入無抗生素的LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基400400l，于，于37 搖床（搖床（100-100-150rpm150

6、rpm）溫和振搖）溫和振搖45min45min，使細菌復(fù)蘇并表達，使細菌復(fù)蘇并表達質(zhì)粒的抗質(zhì)粒的抗性基因。性基因。 取取100l菌液均勻涂鋪于含菌液均勻涂鋪于含Amp的的LB瓊脂平板上瓊脂平板上 ， 37 20min后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)10-16h(小于小于20h) 挑取單菌落置挑取單菌落置5mlLB培養(yǎng)基中（含培養(yǎng)基中（含Amp） 37 搖床培搖床培養(yǎng)養(yǎng)8-12h8-12h后，提取后，提取質(zhì)粒，限制酶切鑒定。質(zhì)粒，限制酶切鑒定。質(zhì)粒提?。▔A裂解法）質(zhì)粒提?。▔A裂解法） 原理：原理： EDTA和表面活性劑存在下，經(jīng)堿處理溶菌，和表面活性劑存在下，經(jīng)堿處理溶菌，同時同時pH

7、12.012.6的堿性環(huán)境使細菌線性大分子染色體的堿性環(huán)境使細菌線性大分子染色體DNA氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質(zhì)粒氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質(zhì)粒DNA的超的超螺旋共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離，在恢復(fù)中螺旋共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離，在恢復(fù)中性性pH并有高鹽濃度存在的條件下，質(zhì)粒并有高鹽濃度存在的條件下，質(zhì)粒DNA又呈又呈天然構(gòu)型，而細菌染色體不能復(fù)性，相互交聯(lián)形成天然構(gòu)型，而細菌染色體不能復(fù)性，相互交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與不穩(wěn)定的大分子不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起，通過離心沉淀而除去。再經(jīng)酚、復(fù)合物等一起，通過離心沉淀而除去。再經(jīng)酚、氯仿抽

8、提方法進一步純化質(zhì)粒氯仿抽提方法進一步純化質(zhì)粒DNA。 操作步驟操作步驟 (收集菌液于Ep管中，10000rpm30 s，棄上清，用1 ml STE漂洗12次,離心棄上清)1細菌沉淀加預(yù)冷的溶液細菌沉淀加預(yù)冷的溶液I 100 l重懸菌體，強烈振蕩混勻。重懸菌體，強烈振蕩混勻。2加溶液加溶液 200l，快速顛倒快速顛倒46次混勻內(nèi)容物，冰上次混勻內(nèi)容物，冰上35 min（勿超時）。勿超時）。3加溶液加溶液 150 l，反復(fù)顛倒數(shù)次混勻，冰上反復(fù)顛倒數(shù)次混勻，冰上5 min 。4離心離心12 000 rpm5 min，轉(zhuǎn)上清至新轉(zhuǎn)上清至新Ep管中。管中。 rpm 5.5.室溫下加等體積飽和酚至樣品

9、處理液中，緩慢顛倒混勻室溫下加等體積飽和酚至樣品處理液中，緩慢顛倒混勻1010minmin。 6.6.離心離心14000 14000 rpm 5 5minmin，取上層水相到新取上層水相到新EpEp管中（管中（5 5，6 6步可不做步可不做）。）。 7.7.加等體積氯仿加等體積氯仿/ /異戊醇（異戊醇（2424：1 1），充分混勻，離心），充分混勻，離心14000 14000 rpm 5min5min，取上層取上層水相到另一管中。水相到另一管中。8加加1/10體積的體積的3 mol/L NaAc（pH5.2）和和2.5 倍體積的無水乙醇，混勻，置倍體積的無水乙醇，混勻，置-20 10 min。

10、8離心離心14000 rpm10 min，棄上清。棄上清。9沉淀用沉淀用1 ml 70% 預(yù)冷的乙醇洗一次，離心預(yù)冷的乙醇洗一次，離心12 000 rpm5 min，棄上清。棄上清。10將將Ep管倒置于濾紙上吸凈液體，室溫下敞口蒸發(fā)痕量乙醇管倒置于濾紙上吸凈液體，室溫下敞口蒸發(fā)痕量乙醇1015 min 或真空或真空抽吸抽吸2 min。11加無菌雙蒸水加無菌雙蒸水40 l溶解沉淀。溶解沉淀。12加加RNase A 12 l（此步省略）此步省略）, 混勻，置混勻，置37水浴水浴30 min后進行限制性內(nèi)切后進行限制性內(nèi)切酶酶切實驗（見實驗六十七），或于酶酶切實驗（見實驗六十七），或于-20保存待用

11、；保存待用；1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳鑒定提提取質(zhì)量取質(zhì)量 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切的限制性內(nèi)切酶酶切 反應(yīng)體系如下：反應(yīng)體系如下：滅菌雙蒸水滅菌雙蒸水 6l10限制酶限制酶buffer 2l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 10lBamH 1lHind 1l總體積總體積20l，混勻，混勻，37水浴水浴1-3 h，用，用1%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。電泳鑒定結(jié)果。RT-PCR擴增目的基因擴增目的基因 第一步：第一步：RT（總體積（總體積25l）RNA模板 2l Oligo(dT)15 1.5l65 ,5min; 4 ,1min;DEPC處理水處理水 14l5xRT buffer 5ldNTP 1.5lRT酶酶 1l2000rpm離心離心20sec后后,42 ,60min逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄；85 ，5min終終止反應(yīng)；止反應(yīng)；4 ，3min，防止二級結(jié)構(gòu)形成。，防止二級結(jié)構(gòu)形成。RT-PCR擴增目的基因擴增目的基因 第二步：第二步：PCR（總體積（總