第九章 基因分離與克隆-

1、第九章第九章目的基因的分離和克隆目的基因的分離和克隆第九章第九章目的基因目的基因的分離和克隆的分離和克隆 第一節(jié)目的基因的獲得 第二節(jié)獲得目的基因方法的選擇 第三節(jié)目的基因重組體的構(gòu)建目的基因目的基因：特定功能的基因與相應(yīng)載體重組后能在宿主細胞中表達的DNA。用途：研究基因全貌和內(nèi)涵（結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控）發(fā)現(xiàn)新基因和尋找異?；蜓芯可锓N系進化的同源性重組表達，研制基因藥物基因改造來改變物種基因治療第一節(jié)目的基因的獲得 一、基因的化學(xué)合成法 二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法擴增目的基因 三、建立基因組DNA文庫 四、構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因 五、其他方法 原核生物原核生物：基因組小，限制性核酸

2、內(nèi)切酶切成若干片段后，可以用帶有標(biāo)記的核酸探針進行雜交篩選， 人或哺乳類動物細胞：人或哺乳類動物細胞：基因組龐大，采用DNA重組技術(shù)把某種生物細胞的所有基因分區(qū)組裝到載體（質(zhì)?；蚴删w）上，并隨載體導(dǎo)入宿主細胞中進行克隆培養(yǎng)和保存這種克隆群體，這種通過重組、克隆方法保存在宿主細胞（大腸桿菌）中的各種重組DNA分子的集合體叫做DNA文庫,簡稱文庫（Library）。一、基因的化學(xué)合成法u隨著寡核苷酸化學(xué)合成的自動化，基因的化學(xué)合成變得更經(jīng)濟、容易和準(zhǔn)確。u前提條件：對基因的結(jié)構(gòu)序列清楚。u分為：基因片段的全化學(xué)合成基因的化學(xué)-酶促合成1.化學(xué)合成法的基本策略（1）全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提

3、條件是基因的DNA序列已知，有三種策略。小片段粘接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15個堿基的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 補丁延長法：混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈的全序列，分別合成12-15個堿基的單鏈DNA小片段以及20-30個堿基的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50個堿基的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體 Klenow酶聚合上述三種方法各有利弊：n 化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高

4、；n 在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低。例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%，則合成50個堿基的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%。（2）探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知。此時需要從已知的氨基酸序列推測其DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的基因文庫，最終獲得含有目的基因的重組子。 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針。探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間。探針內(nèi)

5、部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域。某段連續(xù)的氨基酸序列所有可能的DNA序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T G G G T T C設(shè)計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGAATGTATGGATGAIATGAATGCATGGACGAIATGAATGCATGGATGAIATGAA A G三個位點，八條引物三個位點，八條引物簡并序列少，更適合做探針此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計。2.化學(xué)合成的單元操作n 化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接

6、一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。n 從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法。n 具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。n 前者操作繁瑣，基本上已淘汰；n 后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，準(zhǔn)確率高，合成速度快；但合成的核苷酸鏈不宜太長，通常小于60bp。n DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸三酯法原理設(shè)計的?；瘜W(xué)合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂DMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基

7、三苯甲基Me：甲基：甲基3.基因化學(xué)合成的優(yōu)點基因化學(xué)合成的優(yōu)點 可以合成細菌偏愛的密碼子可以合成細菌偏愛的密碼子 可以定向改變個別氨基酸可以定向改變個別氨基酸 可以在兩端加上需要的限制酶切點可以在兩端加上需要的限制酶切點 可以通過自動化儀器合成可以通過自動化儀器合成4.DNA化學(xué)合成的用途 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計新型基因 制備探針、引物、接頭如胰島素基因、干擾素基因等。如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 二、PCR法克隆目的基因 使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。1.PCR法定向擴增目的基

8、因的基本原理定義：定義：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化，合成DNA互補鏈達到基因擴增目的的過程。 PCR技術(shù)反應(yīng)周期包括三個步驟：技術(shù)反應(yīng)周期包括三個步驟：高溫變性：通過加熱使得復(fù)制雙螺旋通過加熱使得復(fù)制雙螺旋DNA變性分離為單變性分離為單鏈，作為模板。（鏈，作為模板。（91，1分鐘）。分鐘）。低溫退火：（約（約50，1分鐘）使專門設(shè)計的一對寡核苷分鐘）使專門設(shè)計的一對寡核苷酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模板酸引物在此低溫條件下分別與單鏈模板D

9、NA兩端的互補兩端的互補區(qū)段互補結(jié)合。區(qū)段互補結(jié)合。適溫延伸：將反應(yīng)混合物的溫度上升到將反應(yīng)混合物的溫度上升到72，保溫，保溫1分鐘。分鐘。31 PCR原理圖原理圖 323.特點：特點：反復(fù)循環(huán)便于獲得大量的基因拷貝Taq酶作用下每一輪PCR循環(huán)會產(chǎn)生103104的錯配率,所以多用于基因檢測，如果用于基因重組表達，在此之前必須進行DNA序列分析。2.應(yīng)用：應(yīng)用：1）診斷帶有異常外源基因（如病毒）變異基因（腫瘤、遺傳病等）2）合成特異基因或目的基因3）合成特異探針1. 基因文庫的基本概念（1）基因庫與基因文庫基因庫（gene pool）特定生物體基因組上所有基因的集合（天然存在）。 基因文庫（g

10、ene library or gene bank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）cDNA文庫（含有全部編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因）三、建立基因組DNA文庫（2）基因文庫構(gòu)建的基本策略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫：材料來自染色體DNA。所謂基因組文庫是將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫：材料來自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的

11、表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫。根據(jù)基因文庫的功能不同把基因文庫分為：n 克隆文庫：克隆載體n 表達文庫：表達載體（融合蛋白和天然蛋白表達載體），蛋白質(zhì)表達文庫（3）基因文庫的類別根據(jù)載體的不同把基因文庫分為：n 質(zhì)粒文庫n 噬菌體文庫n 柯斯質(zhì)粒文庫n 人工染色體文庫不同的載體適于構(gòu)建不同的文庫?。?）基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。它與基因文庫所含最低克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln(1P)/ln(1f)其中： P

12、 = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?f = 克隆片段的平均大小/生物基因組的大小例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆。 若用質(zhì)粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9106克隆才能匯集人基因組全部DNA序列;若用噬菌體載體可構(gòu)建含15kb目的基因的人基因組DNA文庫，按上式計算所需要的重組體克隆數(shù)可以減少到9105, 而要用柯斯質(zhì)粒將40kb目的基因片斷所需要重組體克隆數(shù)可降到3.5105左右

13、,均可滿足建庫要求。載體種類裝載量轉(zhuǎn)染率噬菌體粘性質(zhì)粒(Cosmid)酵母人工染色體(YAC)922kb3045kb1001000kb105106轉(zhuǎn)化子gDNA104106轉(zhuǎn)化子gDNA500轉(zhuǎn)化子gDNA表表4-1三種常用基因組文庫克隆載體的比較三種常用基因組文庫克隆載體的比較（5）基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大：以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度：避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域：以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選（1）基因組DNA的制備為

14、了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大（至少是插入片斷大小的3-5倍），經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100 kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得長達1000 kb的DNA片段。2.基因組文庫的構(gòu)建程序（2）基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證DNA片

15、段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一n超聲波處理：DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。n部分酶切法：一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控。連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體?。?）載體和受體的選擇n基因組文庫構(gòu)建的載體：出于壓縮重組克隆數(shù)量的原因，通常選裝載量較大的-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。ncDNA文庫構(gòu)建的載體：通常選質(zhì)粒，因為由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb。l-DNA上述幾種載體的最大

16、裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒10 kb25 kb45 kbBAC300 kbYAC400 kbn基因文庫構(gòu)建的受體：根據(jù)載體使用選擇大腸桿菌或酵母菌。在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！用小體系連接來尋找最佳比例！ 方法一：粘末端連接方法一：粘末端連接 方法二：人工接頭法方法二：人工接頭法（4）載體與DNA片段的連接（5）轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進口感受態(tài)細胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進口包裝蛋白?。?）從基因組文庫中篩選目的基因 大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具

17、有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟。密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆(7).利用改進的鳥槍法操作克隆目的基因使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高目的重組子的出現(xiàn)頻率。 （a）使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分

18、離，用刀片切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接。（b）在連接前將DNA片段進行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb凍融法濾紙法吸附法低融點凝膠法溶解法（c）凝膠DNA片段回收技術(shù) (8).鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識較難獲得長度較小的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子序列優(yōu)點：操作簡單，命中率較高。優(yōu)點：操作簡單，命中率較高。缺點：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，缺點：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會錯漏目的基因。樣本多，可能會錯漏目的基因。（9）基因組文庫

19、構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團 用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端 （10）構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題）構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題 1、插入、插入DNA的質(zhì)量的質(zhì)量：構(gòu)建一個文庫，插入DNA和載體DNA的質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵?；蚪MDNA應(yīng)當(dāng)非常純，以適應(yīng)DNA的酶解，而且基因組DNA也應(yīng)足夠大（最好超過200kb）以獲得兩個末端的消化產(chǎn)物。 2、載體、載體DNA的質(zhì)量的質(zhì)量：不論是載體

20、DNA還是靶DNA不含外源片段是一個基本條件。污染少量探針序列或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因為在篩選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。 3、DNA的消化的消化：部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個基因組的隨機片段。識別4個堿基的限制酶要比識別6個堿基酶能產(chǎn)生更隨機的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)，檢查限制酶和DNA濃度及純度。4、連接、連接-在考慮把噬菌體臂和插入DNA片段連接過程中有兩個重要參數(shù)：噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。

21、大約10pg噬菌臂和4gDNA能產(chǎn)生有效地包裝。對一個典型的基因組，要產(chǎn)生一個可表達文庫，重組子數(shù)一般要大于11066l06。5、包裝抽提物的包裝效率、包裝抽提物的包裝效率：貯存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝噬菌體DNA和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬菌斑?；蚪M文庫構(gòu)建程序基因組文庫構(gòu)建程序n隨機酶切成較大的DNA片段（10-30Kb，平均20Kb)，對這些片段進行分離n重組入適當(dāng)載體（噬菌體）n轉(zhuǎn)化進宿主菌

22、（E.coli)，擴增，構(gòu)建成基因文庫n從基因組文庫中篩選出含有目的基因組的重組子。（11）總結(jié)n 是以mRNA為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA的方法。n cDNA的克隆對于特定基因的分離和特性研究是極有價值的工具。n cDNA文庫最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列。四、構(gòu)建cDNA文庫特點：cDNA無內(nèi)含子, 長度較基因組基因小, 使操作更為方便。 mRNA比基因組中基因少, 因此篩選某一特定功能基因工作量較小。 mRNA中拷貝數(shù)大于基因組中的拷貝數(shù), 利于獲得較多的模板。（轉(zhuǎn)錄特征）可在原核細胞中表達有生物活性的蛋白 不同種類不同狀態(tài)的細胞的c

23、DNA文庫不同1. 不能研究基因組的結(jié)構(gòu)功能mRNA（1）cDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本策略n反轉(zhuǎn)錄酶：反轉(zhuǎn)錄酶：AMV（來自禽成髓細胞瘤病毒）（來自禽成髓細胞瘤病毒）MMLV（來自（來自Moloey鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）n引物：引物：Oligo（dT）和隨機引物）和隨機引物nOligo（dT）引導(dǎo)

24、的引導(dǎo)的cDNA合成合成是指是指Oligo（dT）引物與引物與mRNA3末端的末端的poly（A）配配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈為模板合成第一鏈cDNA。這種這種cDNA合成的方法在合成的方法在cDNA文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點是由于是由于cDNA末端存在較長的末端存在較長的poly（A）而影響而影響cDNA測序。測序。n隨機引物引導(dǎo)的隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成合成采用采用610個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨定個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨定mRNA并并作為反轉(zhuǎn)錄的起點。由于隨機引物可能在一條作為反轉(zhuǎn)錄的起點。由于隨機引物可能

25、在一條mRNA鏈上有多鏈上有多個結(jié)合位點而從多個位點同時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長個結(jié)合位點而從多個位點同時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的的mRNA分子的分子的5端序列。端序列。隨機引物隨機引物cDNA合成的方法不適合構(gòu)建合成的方法不適合構(gòu)建cDNA文庫，一文庫，一般用于克隆特定般用于克隆特定mRNA的的5末端，如末端，如RT-PCR和和5-RACE。（2）cDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAA

26、AAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1 nuclease獲得的雙鏈cDNA的5端會有幾對堿基缺失DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligaseRNaseH：催化：催化DNA-RNA雜合體的雜合體的RNA部分的核內(nèi)降解，產(chǎn)部分的核

27、內(nèi)降解，產(chǎn)生不同鏈長、帶生不同鏈長、帶3羥基和羥基和5磷酸末端的寡核糖核酸。磷酸末端的寡核糖核酸。 獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失dCTPTdT引導(dǎo)合成法：5ppp5G G AAAAAOH 3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPs獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列（3）雙鏈cDNA的克隆 雙鏈平頭的c

28、DNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收。 插入片段加裝人工接頭引入酶切位點，以便插入片段的回收。平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收。 （1）完備分離程序 提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子。 篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選。 完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等。 2. cDNA法分離目的基因的

29、基本程序從總從總RNARNA構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫 能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫。 以總RNA為模板合成cDNA，無需mRNA的純化，不僅簡化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。 能夠提高cDNA文庫的完整性，獲得那些低水平表達的基因的cDNA克隆。此法對植物基因功能的研究，如對某種外界因素作用后或不同發(fā)育階段基因表達變化的研究尤為適用。1) 取材：mRNA約占總RNA的15，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達最豐富的組織細胞為材料來源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島細胞為原始生物材料，細胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細胞為材料2) 從總的RNA中分離mRNA將

30、提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 oligo(dT) 纖維素中進行親和層析 從提純的從提純的mRNAmRNA構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫（2）特異分離程序 提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆。 特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等。 3.cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)。 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短。mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難。僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因。 核酸雜交法: 以特殊標(biāo)記的寡核苷酸鏈為探針 將擴增好的cDNA文庫（即許多帶

31、有cDNA重組體大腸桿菌培養(yǎng)皿內(nèi)所形成的菌落或噬菌斑）轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，堿解后加帶標(biāo)記的探針進行雜交，能顯示特異結(jié)合探針的點（克?。┍闶悄康幕蛩谔帯４_定菌落或噬菌斑的位置，擴增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片斷，即為目的基因。（如圖）4.篩選目的基因免疫結(jié)合法 噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，各種cDNA表達并呈現(xiàn)在噬菌體表面的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上。然后將膜放入含有特異抗體的溶液中進行免疫結(jié)合反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體后，再與125I標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,從而找出帶有放射性示蹤信號的斑點,進而找出對應(yīng)噬菌斑,克隆擴增,提取DNA后經(jīng)酶切可獲目的基因。 基因組文庫 cDNA文庫信息供體 D

32、NA mRNA載體 噬菌體，黏粒，人工染色體 質(zhì)粒，噬菌體連接前 部分酶切，分級分離 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈 連接 粘端連接，人工接頭 同聚物加尾，人工接頭篩選 核酸探針 核酸探針，免疫探針基因組文庫和cDNA文庫的比較組組織織可克隆之可克隆之DNA載體載體DNAcDNAmRNA部分酶解部分酶解DNADNA長度分級長度分級雙鏈雙鏈cDNADNA與載體連接與載體連接引入宿主細胞引入宿主細胞鑒定文庫的完備性鑒定文庫的完備性擴增后供擴增后供長期儲存長期儲存篩選出所篩選出所需要的克需要的克隆隆應(yīng)用差別雜交法構(gòu)建應(yīng)用差別雜交法構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的cDNA克??；技

33、術(shù)基礎(chǔ)：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達；可以通過這兩種總mRNA（cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對有目的基因表達的細胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫進行篩選。四、獲得目的基因的其他方法差示篩選差示篩選（Differential Screening） 構(gòu)建差示文庫篩選特殊基因。差示文庫（differentiallibrary）又稱扣除文庫（subtractedlibrary）,是反映不同組織細胞或同一種細胞在不同生理狀態(tài)下,基因表達差異的cDNA文庫。2.應(yīng)用扣除雜交法構(gòu)建cDNA文庫 不是細胞內(nèi)所有表達基因全體的集合，而是主要含差異表達基因的部分cDNA的集合；

34、用過量的參照細胞mRNA或cDNA與目的細胞cDNA或mRNA(又稱目的序列)雜交，形成的RNA-cDNA雜交體是兩種細胞共有的，將其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以標(biāo)記成探針(稱減法或扣除探針)，從上述目的細胞的cDNA文庫中篩選目的克?。?實質(zhì)上是除去了一大批高豐度非特異性的cDNA，含有的是特異表達的cDNA克隆及其它一些低豐度mRNA的cDNA克隆?？鄢s交扣除雜交（Subtractive Hybridization） 扣除雜交法基本程序 利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因。 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中

35、，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學(xué)功能。 多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達的基因cDNA克隆扣除雜交 3. mRNA差異顯示法獲得目的基因 mRNA差異顯示（mRNA differential display DD）PCR法全稱為DD-PCR法,其用途和應(yīng)用目的與構(gòu)建差示文庫大體一致。 第二節(jié)獲得目的基因方法的選擇 一、根據(jù)獲得目的基因的研究目的選擇方法 二、根據(jù)目的基因本身特

36、點選擇方法 三、根據(jù)實驗室設(shè)備條件選擇方法第三節(jié)目的基因重組體的構(gòu)建 一、質(zhì)粒DNA的分離純化 二、分子克隆載體的選擇 三、目的基因與載體的連接分子克隆載體的選擇分子克隆載體的選擇選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)選擇克隆載體的幾個重要參數(shù)（1 1）實驗對象）實驗對象 （2 2）實驗性質(zhì)）實驗性質(zhì)（3 3）載體容量）載體容量（4 4）合適克隆位點）合適克隆位點（5 5）載體的穩(wěn)定性）載體的穩(wěn)定性（6 6）載體）載體DNADNA制備的難易制備的難易（7 7）外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等）外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)物特點等實驗對象實驗對象（1 1）供體：遺傳背景與）供體：遺傳背景與DNADNA特點等，其

37、中包括染特點等，其中包括染色體色體DNADNA大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，大小，基因大小與結(jié)構(gòu)，堿基組成，目的基因的產(chǎn)物特點以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式目的基因的產(chǎn)物特點以及遺傳物質(zhì)的傳遞方式等。等。（2 2）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景）受體：各種中間宿主與終宿主的遺傳背景，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式，如遺傳物質(zhì)的傳遞方式( (包括人為的方法包括人為的方法) )，DNADNA限制修飾系統(tǒng)，限制修飾系統(tǒng)，DNADNA重組基因特點，基因產(chǎn)重組基因特點，基因產(chǎn)物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。物修飾系統(tǒng)，即轉(zhuǎn)錄與翻譯后修飾系統(tǒng)。實驗對象實驗對象如常用于基因工程的宿主菌如常用于基因工程的宿主菌E.

38、coliE.coli，菌株不同，基因型，菌株不同，基因型亦不同，不同載體要求不同菌株。如：亦不同，不同載體要求不同菌株。如： E.coli E.coli DH5DH5、 E.coliE.coli DH5 DH5、 E .coliE .coliDH5F DH5F 1 1） 三者均有限制三者均有限制- -修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源修飾系統(tǒng)和重組基因缺陷，外源DNADNA可可存活，且不發(fā)生重組存活，且不發(fā)生重組2 2） DH5DH5和和 DH5FDH5F都具有一個可供遺傳標(biāo)記都具有一個可供遺傳標(biāo)記lacZlacZ檢測的遺傳背景檢測的遺傳背景3 3） DH5FDH5F可供可供M13mpM13mp系列

39、載體配套使用，系列載體配套使用，M13M13病毒的病毒的感染需要感染需要 FF的存在的存在二、目的基因與載體的連接 粘性末端的連接粘性末端的連接1.單酶切點的粘性末端全同源性粘性末端高背景雙向插入,不能定向2.雙酶切片段的定向克隆粘粘非同源互補的粘性末端重組方案中最有效簡捷的途徑。粘平 平端連接法平端連接法(除除酶促酶促外的平端鏈接方法外的平端鏈接方法)1.同聚物加尾法2.用銜接物連接法3.適配子連接法（帶有相應(yīng)酶切點的粘性末端）EcoRI粘性末端：5AGCGGCCGCG3TCGCCGGCGCTTAA5BamHIPasI粘性末端：5GATCCGG.CACTGCA33GCC.GTG5BamHIP

40、asI4.TA克隆法TaqDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時,能不依賴模板而在擴增產(chǎn)物兩3端加上兩個游離的“A”。 由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。 原理：利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的線性載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。 操作最簡單，快速和高效，是Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法4. T載體 由由Taq DNATaq DNA聚合酶擴增的聚合酶擴增的PCRPCR產(chǎn)物中，其產(chǎn)物中，其33末

41、端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基A A?？寺r可以采取克隆時可以采取TdTTdT末端加末端加同聚尾同聚尾的方法與載體的方法與載體拼接，也可以使用專門的拼接，也可以使用專門的T T載體載體克隆克隆 PCR克隆目的基因的基本程序TT5555AAPCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物T載體載體T7lacZ MCSoriAprTATA克隆的優(yōu)點克隆的優(yōu)點 不需使用含限制酶序列的引物不需使用含限制酶序列的引物 不需把不需把PCRPCR產(chǎn)物做平端處理產(chǎn)物做平端處理 不需在不需在PCRPCR擴增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進行擴增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進行克隆。克隆。 注意事項注意事

42、項 1. 1. 要獲得目的基因的要獲得目的基因的TATA克隆，克隆，PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物的特異性要好。的特異性要好。2. PCR2. PCR產(chǎn)物在產(chǎn)物在TATA克隆前要通過純化?？寺∏耙ㄟ^純化。3. 3. 在在PCRPCR產(chǎn)物回收、純化過程中防止外產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來來DNADNA污染。污染。 pMD18-TpMD18-T圖譜圖譜pSK-TpSK-T載體圖譜載體圖譜 pSK-T vectorpSK-T vector兩側(cè)的兩側(cè)的33端，具端，具有突出的堿基有突出的堿基T T，可以和，可以和PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物物33末端的末端的A A堿基互補，從而堿基互補，從而大大提高大大提高PCRPCR產(chǎn)物的連接、克產(chǎn)物的連接、克隆效率?？赏ㄟ^隆效率?？赏ㄟ^互補的顏色互補的顏