HER2基因擴增FISH 典型特殊案例分享

1、NP-BIO-2015.02-008 Valid Until 2017.02聲明聲明 本本幻燈片僅以學術交流為幻燈片僅以學術交流為目的。目的。處方請參考國家食品藥品監(jiān)督管理處方請參考國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的藥品說明書總局批準的藥品說明書。專業(yè)資料，僅供醫(yī)藥衛(wèi)生專業(yè)人士參考 背 景u 對來自同一中心的病例（病例數1700）進行研究，發(fā)現(xiàn)將近10%的原位雜交結果呈現(xiàn)異常信號形式1。u 對其中最常見的形式進行了闡釋，為診斷者提供了報告指南，并對未來的研究提出了建議。u “典型的特殊情況” 一致性管理，使最終可以得到分子及生物化學證據的支持。1. Am J Clin Pathol 2012;13

2、7:595-605HER2 檢測標準流程流程圖FISH 評判標準 ASCO/CAP于2013年10月聯(lián)合發(fā)布了新版乳腺癌HER2檢測指南1,2 中華病理學雜志于2014年4月發(fā)布了新版中國乳腺癌HER2檢測指南31. Journal of Clinical Oncology. 2013 Oct 7. Epub ahead of print2. Arch Pathol Lab Med. 2013 Oct 7. Epub ahead of print3. 中華病理學雜志2014年4月第43卷第4期FISH 評判標準 中國乳腺癌HER2檢測指南（2014版）1：1. 中華病理學雜志2014年4月第4

3、3卷第4期FISH 評判標準 中國乳腺癌HER2檢測指南（2014版）1：1. 中華病理學雜志2014年4月第43卷第4期Note 本幻燈收錄的病例，均發(fā)表于ASCO/CAP指南（2013）和中國指南（2014）發(fā)表之前 原作者在討論病例時，仍然使用了舊版指南中的FISH判讀標準。但是新舊指南的變化并不影響作者的結論。 為保證論述的完整性，本幻燈仍然保留原作者的討論原文。 讀者在閱讀時，應對新舊指南的變化予以注意。異質性擴增11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605A，圖中顯示的是兩組獨立的腫瘤細胞群（由虛線隔開）；一組明顯無擴增現(xiàn)象，表明HER2基因的缺失（黃

4、色箭頭所示），另外一組的HER2/CEP17比率值2.2，表現(xiàn)為基因擴增（白色箭頭所示）。病例1：簡單的異質性擴增在該病例中，來自同一組織的腫瘤細胞，于腫瘤組織切片內，腫瘤細胞可能會立即緊挨放置或在各自的腫瘤區(qū)域內。一組很明顯無擴增現(xiàn)象，另一組的HER2/CEP17比值大于2.2，明顯說明基因擴增。Solution評分建議詮 釋報告建議至少計算每區(qū)域中的20個腫瘤細胞該腫瘤包含兩個獨立的乳腺腫瘤克隆體，其中一個呈現(xiàn)HER2基因擴增現(xiàn)象，另外一個無擴增現(xiàn)象。將該病例稱為呈現(xiàn)“異質性擴增”的HER2擴增模式，在報告中分別列出兩組的HER2/CEP17比值。Solution“混合”11. Am J

5、Clin Pathol 2012;137:595-605B，HER2基因和CEP17拷貝數都有所增加，擴增（HER2/CEP17比率值2.2，白色箭頭所示）和非擴增細胞看起來混合在一起，分散在腫瘤區(qū)域。有些細胞的比率正常，有些擴增明顯，但是不可能將兩個分開的區(qū)域區(qū)分開來。病例2：復雜的異質性擴增“混合”的擴增和非擴增腫瘤細胞在該病例中，擴增和非擴增細胞看起來混合在一起，并分撒在腫瘤區(qū)域內。有些細胞看起來正常，一些明顯擴增，但是無法區(qū)別兩個不同的區(qū)域。Solution評分建議詮 釋報告建議計數3個區(qū)域的60個細胞，并在一張報告單上分別記錄擴增和非擴增細胞數目。該腫瘤包含混合的乳腺癌克隆體，一個呈

6、現(xiàn)HER2基因擴增現(xiàn)象，另一個呈現(xiàn)非擴增現(xiàn)象。將該病例稱為潛在的“混合異質性擴增模式”，并列出每個計數細胞的HER2/CEP17比值平均值（或在不區(qū)分擴增/非擴增的前提下列出每個區(qū)域的R2/CEP17比值平均值）。然而，雖然現(xiàn)有的數據顯示小百分比的擴增細胞并不足以說明HER2擴增的存在，也要列出混合腫瘤群體中擴增細胞（比值2.2）的百分比。根據當下的指南，對于這些病例，當所有計數細胞的HER2/CEP17比值平均值過2.2時，可以稱之為有HER2擴增現(xiàn)象。Solution孤立擴增的癌細胞11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C，在非擴增細胞占主導地位的背景下

7、，我們可以看到一個孤立的擴增細胞（白色箭頭所示），擴增水平較高（比率值3.0）。病例3：孤立擴增的癌細胞在該病例中，在非擴增細胞占腫瘤組織主導地位的大背景下，出現(xiàn)比率值明顯較大（比值3.0）的孤立細胞。值得注意的是，擴增細胞中的信號顯而易見，真實可靠，沒有人為處理的痕跡。也許可以逼真地人為模仿一些信號，但多波長的熒光信號（即自熒光）則難以模仿。因此，對之評價前，應該確保這些信號在4，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚示蹤劑下或液體過濾器下不顯綠色。如果這些信號是真的，就應該計數。Solution只有在細胞明顯擴增的情況下才能記錄孤立擴增癌細胞的存在。該類細胞的預后價值尚不明確，但是當下的證據表明，

8、 百分比較?。?0%）的情況下，其對結果沒有影響。列出所有計數細胞的HER2/CEP17比值平均值，并根據該值進行全面的診斷（擴增或非擴增）。例如，在該病例中，HER2基因為非擴增。評分建議詮 釋報告建議對區(qū)域內的擴增或非擴增細胞進行評分時，應該公正評價，不偏不倚。該腫瘤可能會包含HER2擴增的孤立細胞，其顯著性目前尚未明了。然而，當下的證據表明其對預后影響有限。我們對之的完全意義尚不明確。研究建議人們認為，獲取足夠的證據來支撐該孤立癌細胞的預后影響是不大可能的。對該類細胞進行生物學的單細胞分析，可能會得到一些信息（運用激光捕獲纖維切割），但仍無法闡明其對患者疾病進程的影響。 Solution

9、整條17號染色體的缺失11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605A和B ，腫瘤細胞都只帶有HER2和CEP17的信號，暗示整條17號染色體區(qū)域的完全缺失。病例4：整條17號染色體的缺失在該病例中，在整個腫瘤細胞視野范圍內僅可觀察到HER2和染色體17CEP信號；實際上，看起來每個細胞都缺失一塊整條17號染色體的區(qū)域。仔細檢查發(fā)現(xiàn)，相毗鄰的正常細胞仍有1到2個CEP17和HER2信號。17號染色體CEP的拷貝數目平均值為1.02（標準差，0.13），HER2基因的拷貝數目平均值為1.06（標準差，0.25）；HER2/CEP 17比值為1.05.Solution評

10、分建議詮 釋報告建議根據英國相關指南進行評分。盡管該病例異常，很明顯，這是一個非擴增腫瘤的例子。將該病例稱之為HER2非擴增現(xiàn)象，并附上單倍體或17號染色體缺失的可能性。研究建議可以運用比較基因組雜交（CGH）檢測缺失的亞染色體區(qū)域，該區(qū)域的缺失可能會導致HER2和CEP17的缺失。SolutionCEP17 信號缺失111. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C 和D，顯示的是腫瘤細胞中，HER2拷貝數正常，而17號染色體CEP信號缺失的現(xiàn)象。結果為臨界的HER2基因擴增。病例5在該病例中，腫瘤細胞缺失17號染色體CEP信號（又可看到毗鄰的正常細胞呈現(xiàn)正常的信

11、號模式）。HER2拷貝數正常，僅可觀察到17號染色體CEP17信號的缺失。結果是，HER2基因擴增與否不大明確，HER2拷貝數目平均值為1.98（標準差，0.62），CEP17拷貝數的平均值為1.02（標準差，0.13）；HER2/CEP17 比值為1.95。計數的60個細胞中，該病例可稱之為“臨界但非擴增”現(xiàn)象，根據美國臨床腫瘤學協(xié)會/美國病理學家研究院指南，該病例可稱之為不確定。如果60個細胞中，有6個（10%）及以上細胞的HER2/CEP17比值為2.20，即使每個細胞中HER2拷貝數平均值小于2，根據美國病理學家研究院指南，也將之視為呈現(xiàn)異質性HER2基因擴增現(xiàn)象。 然而，相關研究結果

12、顯示，HER2/CEP17比值為2.2及以上的細胞數高達30%時，對結果沒有影響Solution評分建議詮 釋從HER2/CEP17比值來看，該病例為非擴增腫瘤。HER2復制水平低下，是否出現(xiàn)如例4所示的整條17號染色體缺失，尚不明確一條染色體上帶有CEP17衛(wèi)星的特定著絲粒區(qū)域缺失與否也有待查明。很可能這是染色體重排和失衡的結果。其它可能性（也可見于細胞遺傳學中的其它實體瘤）包括1條17號染色體的缺失（17號染色體長臂上一個等臂染色體的形成）和不平衡置換（保留包含17q物質和HER2核心的衍生染色體）低水平“擴增”的小百分比(30%)細胞的存在，沒有顯著性差異，不予以報告。呈現(xiàn)17號單倍體的

13、病例對曲妥珠單抗的反應性較差。因為其為低水平擴增事件，至少要計數60個細胞。Solution報告建議根據擴大細胞計數量，使之不少于60得到的結果，該病例可稱為非擴增現(xiàn)象?？梢栽诟戒浿凶⒚鰿EP17正常的計數。比值2.2的小數量細胞的出現(xiàn)無明顯差異，不應該對其進行報告。研究建議進行大批比較基因組雜交/多重連接探針擴增 (CGH/ MLPA) 來測定17號染色體的拷貝數和HER2基因擴增的地位。 SolutionCEP17信號的缺失211. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605 A 和 B ，腫瘤細胞中僅有一個CEP17的拷貝體，然而，HER2拷貝數增加，導致擴增比值

14、。病例6在該病例中，CEP17的出現(xiàn)與例5具有可比性，暗示腫瘤細胞中1個CEP17信號的缺失（再次與呈現(xiàn)正常信號模式的正常細胞毗鄰）。信號缺失或減少僅涉及CEP17信號；然而，該病例中也呈現(xiàn)出HER2拷貝數目的增加。結果為，HER2基因擴增，HER2的拷貝數目平均值為5.75（標準差，0.9），CEP17拷貝數為1（標準差，0.0）；HER2/CEP17比值為5.75。Solution從HER2/CEP17比值看，很顯然，其為擴增細胞。是否出現(xiàn)如例5所示的整條染色體缺失（HER2在剩下的染色體上擴增），或是否有特定的著絲粒區(qū)域缺失（在一條染色體包含CEP17衛(wèi)星），尚不清楚。如果后者正確，該類

15、型的病例中不包括真正擴增。然而，我們當今的觀點是，這代表了帶有HER2基因擴增的17號染色體單倍體數目的減少由于染色體組型高度復雜，17號染色體長臂多次拷貝，HER2擴增可出現(xiàn)在保留的染色體上或增加拷貝的HER2基因。沒有證據表明計數多余的細胞會改變診斷結果，根據指南計數至少20個細胞。評分建議詮 釋Solution該病例為HER2基因擴增，并列出HER2/CEP17比值，應在附錄注上異常CEP17出現(xiàn)的計數。報告建議研究建議可以進行一系列的CGH/MLPA 來決定17號染色體數目的拷貝數和HER2基因擴增的地位。應視方案的不同，對CGH進行區(qū)別。SolutionCEP17信號完全缺失11.

16、Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C 和D，CEP17信號在腫瘤細胞中看不到，然而，在正常細胞中可見(箭頭所示)，在該病例中，HER2擴增地位僅由HER2拷貝數決定。病例7在該病例中，腫瘤細胞中，所有的CEP17信號完全缺失；注意一個重要的對照是正常細胞中含CEP17。只有當正常細胞中出現(xiàn)CEP17信號的時候才可以明確的做出CEP17缺失的診斷。如果正常細胞中沒有CEP17信號，則是原位雜家評價的技術失誤。因為沒有CEP17，則無法得到HER2/CEP17比值，這無疑帶來了些許挑戰(zhàn)。HER2的平均拷貝數為6.8 /細胞(標準差，1.78)。Solution推薦所

17、有病例使用CEP17，而不推薦使用單一的拷貝熒光原位雜交 FISH。曲妥珠單抗大型期試驗的報告結果都不是以拷貝數目來記錄的，相關研究也說明拷貝數目在HER2基因擴增指導中作用不大。然而，在極少數情況下，當染色體的著絲粒區(qū)域缺失時，建議以大于等于6的拷貝數來記錄缺失CEP17區(qū)域的HER2擴增現(xiàn)象。這并不是最佳的記錄方法，而且不能根據以往的證據，延伸到非缺失CEP17的病例。然而，在這些特殊的病例中，當下并不推薦分析CEP17評分建議詮 釋計數腫瘤細胞中的HER2基因拷貝數。證據表明診斷結果與計數細胞多少無關。根據指南計數細胞的最小值為20。Solution報告建議僅根據HER2基因拷貝數（僅當

18、HER2基因數目6/細胞時），將該病例為擴增。并做個注釋以說明和所有細胞中的CEP17信號缺失。報告建議研究建議進行大批的CGH/MLPA 可以闡明基因損傷導致的CEP17信號缺失，并決定HER2基因擴增地位的有無。使用替代17號染色體的探針（端粒探針）進行熒光原位雜交FISH分析也具有一定的價值。Solution信號重疊共存11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605HER2和 CEP17拷貝數目很高。 A和B，HER2和CEP17 的拷貝數目非常高，信號重疊共存，呈現(xiàn)出黃色融合信號。病例 8該病例中，細胞內呈大量的HER2和CEP17共存的信號模式，用三帶通濾

19、波器觀察時，紅綠融合的信號呈黃色。在高強度下，可以觀察到紅綠信號重疊。使用單帶通濾波器，可以確認信號的重疊共存 并排除人為因素 (熒光通過所有的帶寬)。對該病例進行詮釋有些困難，因為其HER2/CEP17 比值為1.04，HER2和CEP17信號的計數平均值分別為24.3和23.43，根據傳統(tǒng)標準應為非擴增。然而，HER2/CEP1的高拷貝值卻意味著該病例高度異常。Solution評分建議詮 釋用單色過濾器對HER2和CEP17信號進行評分，注意區(qū)域內細胞的匹配，以確保紅綠信號的精確計數。根據指南計數至少20個細胞；計數多余的細胞不可能改變診斷結果。其為異常病例，因為即使HER2/CEP17比

20、值表現(xiàn)為非擴增模式，HER2和CEP17都有很高的拷貝數。鑒于有證據表明HER2/CEP17擴增子的程度不同，11我們認為，這些病例可能代表了HER2擴增子擴展到CEP17著絲粒外圍區(qū)域。我們認為這些罕見的病例解釋為擴增現(xiàn)象。信號模式可解釋為HER2擴增子延伸到著絲粒，并整合了著絲粒周邊區(qū)域，導致了CEP17信號與HER2信號的重疊共存。已有初步證據證明，帶有擴展HER2擴增子的患者可能會對曲妥珠單抗12的反應敏感性降低；然而，該假設還未得到進一步證實。Solution該病例應稱之為基于HER2拷貝數的著絲點和相關平衡的CEP17拷貝數的共擴增，并在報告中注明HER2 和CEP17信號的重疊共

21、存現(xiàn)象。報告建議研究建議要對一系列此類病例進行CGH/MLPA，以驗證CEP17和HER2重疊共存的設想。Solution信號分離11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C和D，HER2和CEP17的拷貝數都增加了，但信號分離。病例 9在該病例中，HER2 和CEP17的拷貝數很高，但呈現(xiàn)的是非重疊的分離信號。從HER2/CEP17比值看，為非擴增模式 (1.12)；然而，此圖卻顯示，HER2 和 CEP17的拷貝數目皆有升高，分別為7.45和6.65。Solution因為HER2/CEP17 比值顯示為非擴增，該病例解釋起來可能看似簡單直接；然而；HER2和 CEP17 信號卻顯示較高的拷貝數。HER2 拷貝數目6（較為多見，但不大整齊一致），則提示HER2擴增現(xiàn)象，通過單一拷貝計數法分析， 則將之稱為擴增現(xiàn)象。從遺傳學角度看，HER2和CEP17拷貝數目增加到該水平，明顯而平衡，其根本機制尚不清楚，但也不可能反映出17號染色體的多個完整無缺的復制。而因為這些病例的真正的分子機制不確定性，在解讀FISH結果時，仍有做出錯誤診斷的巨大空間。在缺失明確證據（如HER2/CEP17信號共存）證明HER2/CEP17信號共擴增時，很難認定其為真正的HER2擴增現(xiàn)象。事實上，這些病例可能代表