細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示

1、細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示細胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示 Experiment 6【實驗目的實驗目的】1. 掌握細胞中酸性磷酸酶的顯示方法掌握細胞中酸性磷酸酶的顯示方法2. 觀察酸性磷酸酶在細胞中的存在部位觀察酸性磷酸酶在細胞中的存在部位【實驗目的實驗目的】細胞中存在著能分解磷酸酯的酶，它們可分為一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯酶等三類，其中最主要的是一磷酸酯酶。這類酶按最適pH值又可分為兩類，一類在pH9.5左右的條件下發(fā)揮作用，稱為堿性磷酸酶；另一類在pH5.0左右的條件下發(fā)揮作用，稱為酸性磷酸酶。當酸性磷酸酶與含有磷酸酶的作用底物（如甘油磷酸鈉）一起保溫時，能水解磷酸酯使其釋放出磷酸基，磷酸基進而與

2、底物中存在的鉛鹽結合形成無色的磷酸鉛（PbHPO4）沉淀物，當用黃色的硫化銨作用該沉淀時可形成黃棕色或棕黑色的硫化鉛沉淀；從而使細胞中酸性磷酸酶顯示出來。本實驗項目以小鼠腹腔巨噬細胞為材料顯示該酶的存在。【實驗材料實驗材料】一、一、 材料：小白鼠材料：小白鼠二、二、 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、注射器、蓋玻片、器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、注射器、蓋玻片、載玻片、剪刀、鑷子、酒精燈載玻片、剪刀、鑷子、酒精燈三、三、 試劑：試劑：6%淀粉肉湯、淀粉肉湯、0.85%生理鹽水、酸性磷酸生理鹽水、酸性磷酸酶工作液、福爾馬林、鈣固定液、酶工作液、福爾馬林、鈣固定液、2%硫化銨溶液、硫化銨溶液、甘油明膠封固劑甘

3、油明膠封固劑6%淀粉肉湯淀粉肉湯：稱取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化鈉0.5g加入到100ml蒸餾水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，溫浴溶解，煮沸15分鐘滅菌，置4C冰箱中保存，使用時水浴融化。0.85%生理鹽水生理鹽水：稱取8.5gNaCl溶于1000ml蒸餾水中。酸性磷酸酶工作液：酸性磷酸酶工作液： 0.05mol/L醋酸緩沖液醋酸緩沖液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸餾水中均勻混制成0.2mol/L的醋酸液（A液），再稱取醋酸鈉（NaAc3H2O）2.72g溶于100ml蒸餾水中配成0.2mol/L的醋酸鈉溶液（B液）。取A液30ml加B液70ml混勻即成0.0

4、5mol/L醋酸緩沖液，置4C保存。 3%-甘油磷酸鈉溶液甘油磷酸鈉溶液：稱取-甘油磷酸鈉3g溶于100ml蒸餾水中，4C保存。 工作液工作液：臨用時，稱取硝酸鉛25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸緩沖溶液中，待全部溶解后，再緩慢地滴加入3%的-甘油磷酸鈉液2.5ml，同時快速攪動，防止產(chǎn)生絮狀物。福爾馬林福爾馬林鈣固定液鈣固定液：先稱取無水CaCl2 10g溶于100ml蒸餾水中配成10%氯化鈣溶液，取該液10ml加入到80ml蒸餾水混勻，即成福爾馬林鈣固定液。2%硫化銨硫化銨：量取2ml硫化銨加入到98ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。甘油明膠封固劑甘油明膠封固劑：稱取明膠7g加入42

5、ml蒸餾水中，水浴加溫溶解，再加入50ml甘油并攪勻，另加少許麝香草酚作防腐劑，置4C貯存，使用水浴加溫融化?！緦嶒瀮?nèi)容實驗內(nèi)容】1、取、取20g左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射6%淀粉肉湯淀粉肉湯1ml，連續(xù)，連續(xù)三天。三天。2、在第三次注射后、在第三次注射后34小時，再向腹腔注射生理鹽水小時，再向腹腔注射生理鹽水1ml。3、過、過35分鐘后取腹腔液分鐘后取腹腔液0.10.3ml（注意抽取部位要盡量與注射部位（注意抽取部位要盡量與注射部位相一致，否則難以抽出）或用頸椎脫臼法處死小白鼠后，打開腹腔，相一致，否則難以抽出）或用頸椎脫臼法處死小白鼠后，打開腹腔，用注

6、射器（不裝針頭）直接吸取腹腔液。用注射器（不裝針頭）直接吸取腹腔液。4、往預冷的蓋玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙簽涂后放入小培養(yǎng)皿、往預冷的蓋玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙簽涂后放入小培養(yǎng)皿4 C冰箱中冰箱中30分鐘，使細胞自行鋪展開。分鐘，使細胞自行鋪展開。5、冷風吹干玻片，如室溫低于、冷風吹干玻片，如室溫低于20 C，可任其自然干燥。，可任其自然干燥。6、往蓋玻片上滴加酸性磷酸酶工作液兩滴（或將玻片插入盛有酸性磷、往蓋玻片上滴加酸性磷酸酶工作液兩滴（或將玻片插入盛有酸性磷酸工作液的小染色缸中），酸工作液的小染色缸中），37 C溫育溫育30分鐘。分鐘。7、取出蓋玻片用蒸餾水沖洗，然后立于吸水紙上

7、吸去多余水分。、取出蓋玻片用蒸餾水沖洗，然后立于吸水紙上吸去多余水分。8、放入盛有、放入盛有10%福爾馬林福爾馬林鈣固定液的小染色缸內(nèi)處理鈣固定液的小染色缸內(nèi)處理5分鐘，分鐘，進行后固定。進行后固定。9、取出玻片，在蒸餾水中漂洗，再吸去多余水分。、取出玻片，在蒸餾水中漂洗，再吸去多余水分。10、放入、放入2%硫化銨溶液中處理硫化銨溶液中處理35分鐘。分鐘。11、蒸餾水漂洗。、蒸餾水漂洗。12、取一載玻片，往其中滴一滴明膠甘油封固劑，將帶水的蓋玻、取一載玻片，往其中滴一滴明膠甘油封固劑，將帶水的蓋玻片有細胞的一面朝下，慢慢蓋向載玻片上的明膠甘油，使蓋玻片片有細胞的一面朝下，慢慢蓋向載玻片上的明膠甘油，使蓋玻片封固在載玻片上（注意避免氣泡的產(chǎn)生）。封固在載玻片上（注意避免氣泡的產(chǎn)生）。13、觀察：將制備好的標本置于光鏡下，在高倍鏡下可見許多呈、觀察：將制備好的標本置于光鏡下，在高倍鏡下可見許多呈陽性反應的巨噬細胞，其細胞質中出現(xiàn)許多大小不等的棕色或棕陽性反應的巨噬細胞，其細胞質中出現(xiàn)許多大小不等的棕色或棕黑色顆粒和斑塊，這便是酸性磷酸酶存在的部位（溶酶體），有黑色顆粒和斑塊，這便是酸性磷酸酶存在的部位（溶酶體），有些細胞內(nèi)酸性磷酸酶極為豐富，故整個細胞