第十章中藥制劑分析中新方法與新技術(shù)

1、第十章第十章 中藥制劑分析中中藥制劑分析中新方法與新技術(shù)新方法與新技術(shù) 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v頂空氣相色譜法頂空氣相色譜法（液上氣相色譜法、頂空分析法） 對樣品基質(zhì)上方的氣體成分進行GC分析來測定這些組分在原樣品中的含量v頂空氣相色譜的分類頂空氣相色譜的分類靜態(tài)頂空靜態(tài)頂空GC動態(tài)頂空動態(tài)頂空GC 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v頂空氣相色譜法頂空氣相色譜法主要特點主要特點v樣品前處理簡單樣品前處理簡單v檢測限低檢測限低v可分析含量低、組成復雜的樣品可分析含量低、組成復雜的樣品v適用于易揮發(fā)或易分解或無法直接進樣分析的適用于易揮發(fā)或易分解或無法直接進樣分析的液體或固體樣品的分析液

2、體或固體樣品的分析 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v頂空氣相色譜法頂空氣相色譜法應用實例應用實例靜態(tài)頂空靜態(tài)頂空GC(GC(內(nèi)標法內(nèi)標法) )測定血液中乙醇含量測定血液中乙醇含量對照品溶液的制備對照品溶液的制備 將10g/l的乙醇儲備液稀釋10倍，精密吸取此液1ml置于10ml頂空樣品瓶中，同時精密加1ml內(nèi)標溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，即得。樣品制備樣品制備 精密吸取1ml充分混勻的血樣轉(zhuǎn)移至10ml頂空樣品瓶中，同時精密加1ml內(nèi)標溶液（0.25%的正丙醇水溶液），迅速密封，即得。 色譜條件色譜條件 （略）（略）頂空分析條件頂空分析條件 平衡溫度為50，平衡時間為10分鐘

3、（快速攪拌下），閥、輸送管及定量管溫度為80，加壓為13.8kPa，加壓時間、充樣時間和壓力平衡時間均為0.15分鐘，定量管為1.0ml。 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v超高效液相色譜超高效液相色譜（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）主要特點主要特點v固定相固定相雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團顆粒粒度小，僅為1.7m耐壓，顆粒度分布范圍很窄v裝柱裝柱v檢測器檢測器響應快響應快樣品池樣品池10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一） 優(yōu)點優(yōu)點v更高的分析速度，更好分離效果和更高的靈敏

4、度，速度、靈敏度及分離度，分別是HPLC的9倍、 1.7倍及3倍 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v超臨界流體色譜超臨界流體色譜（SFC, supercritical fluid chromatography）以超臨界流體（低黏度、高密度以及較高的擴散系數(shù)）作為流動相。對GC及HPLC的檢測器均可兼容使用適用于分析GC難以處理的高沸點、不揮發(fā)性樣品分離速度較HPLC，分離效果更好。v應用實例超臨界流體色譜法測定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量 1 1 現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)v色譜聯(lián)用技術(shù)色譜聯(lián)用技術(shù)多維色譜如：二維薄層色譜等氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 2

5、 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳(HPCE,high(HPCE,high performance capillary electrophoresis) performance capillary electrophoresis)v電泳電泳: 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。 由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。1937年 Tiselius (瑞典) 利用自由溶液電泳自由溶液電泳將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白1981年 Jorgenson 和 Luckas 發(fā)展了高效毛細高效毛細管

6、電泳分離分析技術(shù)管電泳分離分析技術(shù) (使用75m內(nèi)徑石英毛細管和采用了高達數(shù)千伏的電壓)， 2 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳 各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為： + + = =電滲流電滲流 + + +ef+ef 陽離子運動方向與電滲流一致陽離子運動方向與電滲流一致 - - = =電滲流電滲流 - - -ef-ef 陰離子運動方向與電滲流相反陰離子運動方向與電滲流相反 0 0 = =電滲流電滲流 中性粒子運動方向與電滲流一致中性粒子運動方向與電滲流一致 可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離v分離原理分離原理

7、 電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象流現(xiàn)象。 2 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳v儀器裝置儀器裝置電壓：030KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導熒光檢測器可檢測到：10-1910-21mol/L 2 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳v主要特點主要特點優(yōu)點優(yōu)點v高分辨率：理論塔板數(shù)高達數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。v高靈敏度：可檢測出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。v高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).v試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣v儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液

8、2 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳v常見的毛細管電泳模式常見的毛細管電泳模式毛細管區(qū)帶電泳(CZE)毛細管膠束電動色譜(MECC)（膠束作為假固定相的電動色譜）毛細管凝膠電泳(CGE)（凝膠作為支持物，起分子篩的作用）毛細管等電聚焦電泳(CIEF)（用于蛋白質(zhì)、多肽等兩性物質(zhì)的分離）毛細管等速電泳(CITP) 2 2 高效毛細管電泳高效毛細管電泳v應用應用離子分析離子分析藥物分析藥物分析手性化合物分析手性化合物分析氨基酸分析氨基酸分析核酸分析及核酸分析及DNA測序測序vHPCE在在中藥制劑分析中的應用中藥制劑分析中的應用v生物堿的測定、動物類藥材的鑒別、指紋圖譜生物堿的測定、動物類藥材的鑒別

9、、指紋圖譜高效毛細管電泳法測定心舒口服液中腺苷、蘆丁和高效毛細管電泳法測定心舒口服液中腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量阿魏酸的含量對照品溶液對照品溶液 （略）（略）供試品溶液的配制供試品溶液的配制取心舒口服液10 mL，加熱濃縮至約1 mL，加60 %甲醇定容10 mL，冰箱放置過夜，經(jīng)0. 45 mm濾膜濾過備用。電泳條件電泳條件以熔融石英毛細管( 50 mm 66 . 5 cm，有效分離長度58 cm) 為分離通道，以105 mmol/L硼砂液為運行緩沖液，壓力進樣50 mpa，6 s，毛細管柱溫度為20 ，運行電壓為0 30 min : 24 kV，30 60 min : 28 kV，檢測波長為

10、210 nm，毛細管柱使用前以0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液、注射用水和運行緩沖液依次沖洗5 ,5 ,8 min，每次電泳后以運行緩沖液沖洗8 min 。在此條件下，同時測定腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量。（隋印等. 中國醫(yī)院藥學雜志. 2005, 25(3):232-234） 3 3 原子吸收光譜原子吸收光譜（AAS,atomAAS,atom absorption spectrometry absorption spectrometry）v工作原理工作原理1）各種元素的原子結(jié)構(gòu)和外層電子排布不同， 基態(tài)第一激發(fā)態(tài): 躍遷吸收能量不同具有特征性 2）各種元素的基態(tài)第一激發(fā)態(tài) 最易發(fā)生，吸收最強，最

11、靈敏線。特征譜線(共振線)。 3）利用待測元素的原子蒸氣中基態(tài)原子與共振線吸收之間的關(guān)系來定量分析。 3 3 原子吸收光譜原子吸收光譜v工作原理工作原理 3 3 原子吸收光譜原子吸收光譜v原子吸收光譜儀原子吸收光譜儀銳線光源銳線光源空心陰極燈 3 3 原子吸收光譜原子吸收光譜v原子吸收光譜儀原子吸收光譜儀原子化系統(tǒng)原子化系統(tǒng)將試樣中離子轉(zhuǎn)變成原子蒸氣。v原子化方法原子化方法火焰法無火焰法電熱高溫石墨管，激光冷原子化法單色器（色散元件（棱鏡、光柵），凹凸鏡、狹縫等）檢測系統(tǒng)（光電池、光電倍增管、光敏晶體管） 3 3 原子吸收光譜原子吸收光譜v優(yōu)缺點優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)點：原子化程度高，試樣用量少（：原子

12、化程度高，試樣用量少（1 1100L100L），可測固體及粘稠試樣，靈敏），可測固體及粘稠試樣，靈敏度高，檢測限度高，檢測限1010-12-12 g/L g/L。缺點缺點：精密度差，測定速度慢，操作不：精密度差，測定速度慢，操作不夠簡便，裝置復雜。夠簡便，裝置復雜。 4 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜 從整體上評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量v中藥指紋圖譜建立的原則中藥指紋圖譜建立的原則盡可能多的覆蓋全貌特征明顯，專屬性強，重現(xiàn)性好方便操作與應用 4 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜v中藥（化學）指紋圖譜鑒別中藥（化學）指紋圖譜鑒別標準圖譜的建立標準圖譜的建立v中藥材的選擇中藥材的選擇 選用經(jīng)品種鑒定的正品優(yōu)質(zhì)地

13、道藥材，確定圖譜的特征參數(shù)。另收集多產(chǎn)地，具充分代表性，符合藥用規(guī)格的樣品，對圖譜特征的重現(xiàn)性進行考查。隨之收集一些易混淆或曾出現(xiàn)的偽品，以所確定的特征若能加以區(qū)別和辨認，則更為理想。v實驗樣品的制備實驗樣品的制備 可根據(jù)藥材所含成分選定，盡可能考慮對不同成分的兼容性，通常用不同極性的溶劑23種，制成供試品，供一組圖譜綜合鑒定應用。 注意取樣代表性與均勻性。 4 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜v中藥指紋圖譜鑒別中藥指紋圖譜鑒別標準圖譜的建立標準圖譜的建立v檢測方法檢測方法現(xiàn)代光譜（紅外光譜，紫外光譜）色譜（氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜、毛細管電泳）其它（X光衍射） 4 4 中藥指紋圖譜中藥指

14、紋圖譜v中藥指紋圖譜鑒別中藥指紋圖譜鑒別指紋圖譜的解析指紋圖譜的解析v研究指紋圖譜中特征信號的歸屬v各指紋圖譜的相關(guān)性研究直觀比較相對指數(shù)、重疊率、八強峰等量化數(shù)據(jù)計算機輔助中藥指紋圖譜相似度計算軟件 4 4 中藥指紋圖譜中藥指紋圖譜酸醇提取液中紫外吸收成分的HPLC 分析（=254 nm）二甲亞砜提取液中可見吸收成分的HPLC 分析（=451 nm）體外培育牛黃與天然牛黃指紋圖譜的比較研究(丁崗等. 中國天然藥物, 2004,2(5)309-312）5 其他技術(shù)v 用生物檢定法來評價中藥質(zhì)量用生物檢定法來評價中藥質(zhì)量例1：用生化指標評價中藥質(zhì)量與藥效相關(guān)性更 為密切，以淀粉酶活力比較測定雞內(nèi)金、 鴿內(nèi)金、鵪鶉內(nèi)金的比活力，提出了量化 數(shù)據(jù)。例2：利用大蒜提取物中大蒜辣素和大蒜新素具 有抗菌作用這一特點，用生物檢定方法進 行檢測，結(jié)果與氣相色譜法測定結(jié)果一致。5 其他技術(shù)v DNA分子遺傳標記技術(shù) DN