病毒感染的檢查和防治

1、病毒學(xué)診斷一、標(biāo)本的采集與送檢基本原則與細(xì)菌的相似，但還要特別注意：1.對(duì)本身帶有雜菌或易受污染的標(biāo)本，分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用抗生素。2.低溫保存并盡快送檢，因病毒在室溫易失去活性。3.血清學(xué)診斷標(biāo)本應(yīng)采集發(fā)病初期和病后23w內(nèi)各一份血清，觀察其抗體的動(dòng)態(tài)變化。二、病毒的分離與鑒定（金標(biāo)準(zhǔn)）病毒的分離 1. 動(dòng)物接種 2. 雞胚培養(yǎng)：按病毒種類接種不同部位 絨毛尿囊膜 天花病毒、痘苗病毒、HSV等 尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒等 羊膜腔 流感病毒的初次培養(yǎng) 卵黃囊 某些嗜神經(jīng)病毒 3. 細(xì)胞培養(yǎng)：病毒分離鑒定中最常用的方法。 按其生長方式分為單層培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 按來源、染色體特征及傳代次數(shù)等分為

2、原代細(xì)胞、二倍 體細(xì)胞和傳代細(xì)胞系 病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo)1. 細(xì)胞的變化 細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）：有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可引起特有的細(xì)胞病變。 細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等； 鄰近的細(xì)胞相互融合形成巨細(xì)胞(融合細(xì)胞)如：麻疹病毒、巨細(xì)胞病毒； 在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體，如狂犬病病毒、麻疹病毒2. 紅細(xì)胞吸附(hemadsorption,HAd) 具有血凝素的病毒（流感病毒等），使受染細(xì)胞膜含有病毒血凝素抗原成分，能與紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，以檢測(cè)是否有病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不

3、出現(xiàn)CPE、Had等變化，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。4. 細(xì)胞代謝的改變 培養(yǎng)液的PH改變 病毒的數(shù)量與感染性測(cè)定 常用的方法：蝕斑測(cè)定法和50%組織細(xì)胞感染量（ID50或TCID50） 空斑形成單位（PFU）：可測(cè)定病毒數(shù)量，空斑（P1aque）是病毒在單層細(xì)胞中增殖并擴(kuò)散而形成的不易著色的病灶區(qū)。一般是由一個(gè)感染性病毒體大量復(fù)制形成，類似細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位。病毒懸液中感染性病毒量以每毫升中的空斑形成單位數(shù)來表示。 50組織細(xì)胞感染量（TCID50） 是病毒毒力測(cè)定的方法，應(yīng)用不同稀釋度的病毒懸液接種動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，引起50發(fā)生病變或死亡

4、的最小病毒量?？梢怨烙?jì)病毒感染的強(qiáng)弱程度及含量。 新分離病毒的鑒定1.病毒核酸類型的測(cè)定 DNA病毒和RNA病毒2.理化形狀的測(cè)定 包括病毒顆粒大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對(duì)稱類型、有無包膜等3.形態(tài)學(xué)觀察 通過電鏡和免疫電鏡檢查4.血清學(xué)鑒定 病毒型別的最后鑒定須靠血清學(xué)方法5.基因測(cè)序和生化對(duì)比三、病毒感染的血清學(xué)診斷1.中和試驗(yàn)(neutralizing test) 病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)，可用來檢查患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結(jié)構(gòu)。適用于人群免疫情況的調(diào)查。2. 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(comolement fixation test

5、, CF test) 用已知病毒可溶性補(bǔ)體抗原來檢測(cè)病人血清中相應(yīng)的補(bǔ)體抗體。3.血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 相應(yīng)的抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面的HA與紅細(xì)胞的結(jié)合。常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。4.凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 主要用于診斷HBV與乙型腦炎病毒等感染。四、病毒感染的快速診斷形態(tài)學(xué)檢查 1.電鏡和免疫電鏡檢查 2.普通光學(xué)顯微鏡檢查病毒蛋白抗原檢查 1.免疫熒光法 ( IF ) 2.固相放射免疫測(cè)定（SPRIA） 3.酶免疫測(cè)定（EIA）特異性IgM抗體的檢測(cè)檢測(cè)病毒

6、核酸 1.核酸雜交技術(shù) 斑點(diǎn)雜交、DNA印跡技術(shù) 2.核酸擴(kuò)增技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reation,PCR)連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reation,LCR)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 3.基因芯片技術(shù)(gene chip) 特異性預(yù)防與治療 特異性防治是應(yīng)用獲得性免疫的原理，給機(jī)體注射或服用病原微生物抗原（包括類毒素）或特異性抗體以達(dá)到預(yù)防和治療的目的。這種方法稱為人工免疫(artifical immunization)。 人工免疫分為人工主動(dòng)免疫和人工被動(dòng)免疫。 人工主動(dòng)免疫(artifical active immunization)：將

7、疫苗及類毒素（抗原）接種于人體，使機(jī)體主動(dòng)產(chǎn)生獲得性免疫力。主要用于預(yù)防。 人工被動(dòng)免疫(artifical passive immunization)：輸入含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細(xì)胞因子等免疫制劑，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力的過程一、人工主動(dòng)免疫疫苗 1. 死疫苗(killed vaccine) 用物理或化學(xué)方法將其殺死病原微生物，但仍保持其抗原性的一種生物制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗等。 2. 活疫苗(living vaccine) 通過毒力變異或人工選擇發(fā)而獲得的減毒或無毒株，或從自然界篩選得到的毒力弱毒或無毒株經(jīng)培養(yǎng)后制成的疫苗亦稱減毒疫苗(att

8、enuated vaccine) 。如BCG、鼠疫、脊髓灰質(zhì)炎等減毒活疫苗。死疫苗和活疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，見下表。 3. 新型活疫苗 活疫苗與死疫苗的比較區(qū)別點(diǎn)活疫苗死疫苗制品特點(diǎn)減毒或無毒的疫苗死菌，仍保持免疫原性制備方法通過非正常培養(yǎng)減毒株 通過物理化學(xué)方法使病原體失活接種次數(shù)1次23次接種量量小量大接種反應(yīng)可在體內(nèi)增殖，類似于 在體內(nèi)不增殖，可出現(xiàn)發(fā)熱、全輕型感染或隱性感染身或局部腫痛等反應(yīng)免疫的類型體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫免疫效果較好，維持長(15年)較差，維持短(0.51年)毒力回升有可能不可能安全性對(duì)免疫缺陷者有危險(xiǎn)安全性好疫苗穩(wěn)定性相對(duì)不穩(wěn)定相對(duì)穩(wěn)定保存不宜保存，4存活2w，宜保存

9、，4存活1年真空凍干可長期保存生產(chǎn)和成本生產(chǎn)較復(fù)雜，成本高生產(chǎn)簡單，成本低 4. 基因工程疫苗 利用基因工程方法獲得帶有病原體保護(hù)性抗原表位的目的基因，將其導(dǎo)入原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)該種保護(hù)性抗原，提純后研制成疫苗。 5. 重組載體疫苗 將編碼某一蛋白抗原的基因轉(zhuǎn)入減毒的病毒或細(xì)菌而制成的疫苗。 6. 合成疫苗 根據(jù)病原體抗原的氨基酸序列合成的多肽作為疫苗。 7. 亞單位疫苗 利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，稱為亞單位疫苗 。 8. DNA疫苗 9. 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 將編碼某一病原體保護(hù)性抗原的基因轉(zhuǎn)入植物并在植物中表達(dá)，當(dāng)人們吃這些植物性食物的

10、同時(shí)，完成一次預(yù)防接種。10. 治療疫苗 以治療為目的的一種新興疫苗。病毒感染的治療 抗病毒化學(xué)試劑 1. 核苷類藥物： 無環(huán)鳥苷(阿昔洛韋)、丙氧鳥苷(庚昔洛韋)、阿糖腺苷、疊氮胸苷、雙脫氧肌苷、拉米呋定等。 作用機(jī)制：抑制病毒基因復(fù)制模擬核苷成分摻入病毒基因組競(jìng)爭(zhēng)病毒復(fù)制酶抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄2. 非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 nevirapine(第一個(gè)新合成的非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，1996年獲準(zhǔn)用于治療HIV )、 pyridone 3. 蛋白酶抑制劑 賽科納瓦(saquinavir) 1995年批準(zhǔn)的第一個(gè)蛋白酶抑制劑 英迪納瓦(indinavir) 1996年批準(zhǔn)的新一代蛋白酶抑制劑，用于

11、HIV4.其他抗病毒藥物 金剛烷胺(amantadine)和 甲基金剛烷胺(rimantadine)：主要用于治療甲型流感。 甲酸磷霉素(phosphonoformic acid,PFA)：可抑制多種皰疹病毒。 干擾素和干擾素誘生劑的應(yīng)用1.干擾素 主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳頭瘤病毒和鼻病毒等感染的治療。2.IFN誘生劑 polyI:C、甘草甜素、蕓芝多糖3.中草藥防治病毒感染 黃芪、板藍(lán)根、大青葉等能抑制多種病毒4.基因治療(gene therapy) 目前還處于研究階段。 主要有如下幾種治療方法 ： 反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, asON) 根據(jù)病毒基因組已知序列，設(shè)計(jì)能與病毒基因的