蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)4蛋白質(zhì)制備 ppt課件

1、蛋白質(zhì)的電泳電泳分別的原理電泳分別的原理: 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),在一定的在一定的pH下下,可以可以解離為帶電荷的離子。在電場(chǎng)中可以電泳挪解離為帶電荷的離子。在電場(chǎng)中可以電泳挪動(dòng)。動(dòng)。電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的快慢，用電泳遷移率快慢，用電泳遷移率(M)表示：表示： M為遷移率；為遷移率；dL為顆粒挪動(dòng)的間隔；為顆粒挪動(dòng)的間隔；L為為通電的時(shí)間。通電的時(shí)間。E為兩個(gè)電極之間的電勢(shì)差。為兩個(gè)電極之間的電勢(shì)差。M=EtdL蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。 分子的電荷、大小和外形。分子的電荷、大小和外形。電場(chǎng)電場(chǎng) 與電流和電壓成正比

2、。與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強(qiáng)度緩沖液和離子強(qiáng)度 緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降緩沖液離子強(qiáng)度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。低，樣品的泳動(dòng)速度會(huì)減緩。支持介質(zhì)支持介質(zhì) 紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。用較小。自在界面電泳自在界面電泳運(yùn)用支持物的區(qū)帶電泳。運(yùn)用支持物的區(qū)帶電泳。 區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為上或支持介質(zhì)中遷移。支持介質(zhì)的作用主要是為了防

3、止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液了防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。 區(qū)帶電泳運(yùn)用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、區(qū)帶電泳運(yùn)用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺維素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺PAGE和和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠。SDS-PAGE凝膠等電聚焦凝膠等電聚焦在蛋白質(zhì)中參與摩爾比為在蛋白質(zhì)中參與摩爾比為1.4：1(SDS:蛋白質(zhì)蛋白質(zhì))的的SDS(

4、十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉)。使一切蛋白質(zhì)都帶上負(fù)。使一切蛋白質(zhì)都帶上負(fù)電。電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基方式。合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基方式。在上樣緩沖液中參與巰基乙醇，可以使二硫鍵復(fù)在上樣緩沖液中參與巰基乙醇，可以使二硫鍵復(fù)原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長(zhǎng)原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋白質(zhì)的電荷與外形，只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。白質(zhì)的電

5、荷與外形，只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。當(dāng)分子量在當(dāng)分子量在15KD15KD到到200KD200KD之間時(shí)，蛋白之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：符合下式：logM=K-bXlogM=K-bX M M為分子量，為分子量，X X為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常均為常數(shù)，假設(shè)將知分子量的規(guī)范蛋白質(zhì)的遷移數(shù)，假設(shè)將知分子量的規(guī)范蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條規(guī)范曲率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條規(guī)范曲線，未知蛋白質(zhì)在一樣條件下進(jìn)展電泳，線，未知蛋白質(zhì)在一樣條件下進(jìn)展電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在規(guī)范曲線上求根據(jù)它的電泳遷移率即可

6、在規(guī)范曲線上求得分子量。得分子量。繪制規(guī)范曲線：繪制規(guī)范曲線： 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：按下式計(jì)算相對(duì)遷移率： 以每個(gè)蛋白規(guī)范的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移以每個(gè)蛋白規(guī)范的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得規(guī)范曲線，量出未知蛋白的遷移率即可率作圖得規(guī)范曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。= 蛋白樣品距加樣端遷移距離（cm）溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離（cm） 相對(duì)遷移率PAGEPAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為延續(xù)系統(tǒng)和不根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為延續(xù)系統(tǒng)和不延續(xù)

7、系統(tǒng)兩大類，延續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液延續(xù)系統(tǒng)兩大類，延續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度一樣，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，值及凝膠濃度一樣，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不延續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不延續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pHpH，凝膠，凝膠濃度及電位梯度的不延續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中濃度及電位梯度的不延續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因此其分別條帶明晰度及分辨率均較前者效應(yīng)，因此其分別條帶明晰度及分辨率均較前者佳。佳。 分離膠分離膠(10%.5ml) 濃縮膠濃縮

8、膠(5%.3ml) H2O 2.6ml 0.7ml 30%Acr 1.7ml 1.5ml Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 10%SDS 0.05ml 0.03ml 10%Ap 0.05ml 0.03ml TEMED 5l 4l 不延續(xù)不延續(xù)SDS-PAGE各部分凝膠配制各部分凝膠配制電泳槽中參與緩沖液，接通電源，進(jìn)展電泳，開場(chǎng)電流恒電泳槽中參與緩沖液，接通電源，進(jìn)展電泳，開場(chǎng)電流恒定在定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分別膠后改為，當(dāng)進(jìn)入分別膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約邊緣約5m

9、m時(shí)，停頓電泳。時(shí)，停頓電泳。Figure 6.2.4 SDS-PAGE results of fraction S1 (SRA)制備凝膠時(shí)，制備凝膠時(shí)，TEMED要加膠之前再加。要加膠之前再加。電泳之前蛋白質(zhì)要溶解在含電泳之前蛋白質(zhì)要溶解在含1%的的SDS和和1%的巰的巰基乙醇的磷酸緩沖液基乙醇的磷酸緩沖液(0.01 mol/L, pH 7.2),1000C加熱加熱25分鐘。分鐘。如凝膠中含有雜質(zhì)，可以在參與樣品前先預(yù)電泳如凝膠中含有雜質(zhì)，可以在參與樣品前先預(yù)電泳0.51小時(shí)。小時(shí)。SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，解離為亞單位，電泳結(jié)

10、果顯示的只是亞生變化，解離為亞單位，電泳結(jié)果顯示的只是亞單位的大小，同時(shí)蛋白質(zhì)也會(huì)失去原來(lái)的活性。單位的大小，同時(shí)蛋白質(zhì)也會(huì)失去原來(lái)的活性。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGE測(cè)定分子量。測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)某些糖蛋白以及一些構(gòu)造蛋白，如的蛋白質(zhì)某些糖蛋白以及一些構(gòu)造蛋白，如膠原蛋白等。膠原蛋白等。 蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化 。在電場(chǎng)存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負(fù)極挪動(dòng)而帶負(fù)電的蛋白分子將向正極挪動(dòng)，在某一pH時(shí)，蛋白

11、分子在電場(chǎng)中不再挪動(dòng)，此時(shí)的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 等電聚焦(IEF電泳就是在凝膠中參與兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸添加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。根據(jù)要分別的蛋白質(zhì)的根據(jù)要分別的蛋白質(zhì)的pI的不同，訂購(gòu)不同的不同，訂購(gòu)不同pH梯度的凝膠，可以對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展分別。梯度的凝膠，可以對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展分別。 如如3.59.5、2.56.0、5.08.5、7.510等。等。凝膠的凝膠的pH值范圍越窄，分辨力越高?？煞謩e等值范圍越窄，分辨力越高?？煞謩e等電點(diǎn)相差電點(diǎn)相差0.01個(gè)個(gè)

12、pH單位的蛋白質(zhì)，最高可以分單位的蛋白質(zhì)，最高可以分辨辨0.0025個(gè)個(gè)pH單位的蛋白質(zhì)。單位的蛋白質(zhì)。等電凝膠可以抵消分散作用，蛋白質(zhì)可以富集在等電凝膠可以抵消分散作用，蛋白質(zhì)可以富集在很窄的區(qū)帶上。很窄的區(qū)帶上。適用于少量蛋白質(zhì)樣品的分析鑒定，不適用于大適用于少量蛋白質(zhì)樣品的分析鑒定，不適用于大量制備。量制備。要求用無(wú)鹽的溶液，而蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液中容易要求用無(wú)鹽的溶液，而蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液中容易沉淀；在等電點(diǎn)發(fā)生沉淀和變性的蛋白質(zhì)也不適沉淀；在等電點(diǎn)發(fā)生沉淀和變性的蛋白質(zhì)也不適宜用次方法分別。宜用次方法分別?？梢杂萌旧ú炜吹鞍踪|(zhì)，然后用外表電可以用染色法察看蛋白質(zhì)，然后用外表電極直接丈量極

13、直接丈量pH值。值?；?qū)⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝或?qū)⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝膠塊并且丈量膠塊并且丈量pH。雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)組成，組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分別，第二向使第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分別，第二向使分子量不同的蛋白得到分別，兩向結(jié)合便得到高分子量不同的蛋白得到分別，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。分辨率的蛋白圖譜。1975年，年，OFarrell首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分別出腸桿菌總蛋白分別

14、出1100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來(lái)此多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來(lái)此技術(shù)不斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。技術(shù)不斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的開展，雙向電泳技術(shù)越目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的開展，雙向電泳技術(shù)越來(lái)越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。來(lái)越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白?？捡R斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色法 可檢出可檢出0.31ug的蛋白質(zhì)。的蛋白質(zhì)。銀染色法銀染色法 銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價(jià)絡(luò)鹽的方式結(jié)合，銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價(jià)絡(luò)鹽的方式結(jié)合，用甲醛將銀離子復(fù)原為可見(jiàn)的銀顆粒?？蓹z測(cè)用甲醛將銀離子復(fù)原為可見(jiàn)的銀顆粒。可檢測(cè)ng程度的蛋白質(zhì)。程度的蛋白質(zhì)。熒光染色技術(shù)熒光染色技術(shù) 熒光合成物質(zhì)

15、與熒光合成物質(zhì)與PAGE上的蛋白質(zhì)發(fā)生反響，上的蛋白質(zhì)發(fā)生反響，發(fā)出劇烈的熒光，可檢測(cè)到發(fā)出劇烈的熒光，可檢測(cè)到PAGE中的蛋白質(zhì)。中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)展檢測(cè)。對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)展檢測(cè)。對(duì)知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)展檢測(cè)，知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)展檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可經(jīng)過(guò)交融部分的抗體檢對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可經(jīng)過(guò)交融部分的抗體檢測(cè)。測(cè)。采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，質(zhì)，“探針是抗體，探針是抗體，“顯色用標(biāo)志的二抗。顯色用標(biāo)志的二抗。詳細(xì)操作為經(jīng)過(guò)詳細(xì)操作為經(jīng)過(guò)PAGE分別

16、的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移分別的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上，固相載到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上，固相載體以非共價(jià)鍵方式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的體以非共價(jià)鍵方式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反響，再與酶或同位素標(biāo)志的第二抗體起反響，經(jīng)響，再與酶或同位素標(biāo)志的第二抗體起反響，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分別的特異過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分別的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛運(yùn)用性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛運(yùn)用于檢測(cè)蛋白程度的表達(dá)。于檢測(cè)蛋白程度的表達(dá)?？乖坏膶?shí)驗(yàn)?zāi)l抗

17、原包被的實(shí)驗(yàn)?zāi)l 特異性人抗體特異性人抗體標(biāo)志的二抗標(biāo)志的二抗標(biāo)志標(biāo)志蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)的結(jié)晶可以作為蛋白質(zhì)提純的方法之一。蛋白質(zhì)可以作為蛋白質(zhì)提純的方法之一。蛋白質(zhì)純度到達(dá)一定值時(shí)可以結(jié)晶。經(jīng)過(guò)反復(fù)重純度到達(dá)一定值時(shí)可以結(jié)晶。經(jīng)過(guò)反復(fù)重結(jié)晶可以除去其中的雜質(zhì)，使蛋白質(zhì)得到結(jié)晶可以除去其中的雜質(zhì)，使蛋白質(zhì)得到更大程度的純化。更大程度的純化。蛋白質(zhì)結(jié)晶體是比較穩(wěn)定的構(gòu)造，所以結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)晶體是比較穩(wěn)定的構(gòu)造，所以結(jié)晶可以作為一個(gè)穩(wěn)定的儲(chǔ)存的方法。晶可以作為一個(gè)穩(wěn)定的儲(chǔ)存的方法。在蛋白質(zhì)結(jié)晶之后，可以提供作在蛋白質(zhì)結(jié)晶之后，可以提供作X射線衍射線衍射分析用的資料，來(lái)分析蛋白質(zhì)的構(gòu)造等射分析用的資料，

18、來(lái)分析蛋白質(zhì)的構(gòu)造等數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)溶液在適宜的過(guò)飽和形狀，溶質(zhì)分子經(jīng)過(guò)分散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運(yùn)動(dòng)方式，可以構(gòu)成晶核。溶質(zhì)分子以相互碰撞的作用方式有序而反復(fù)地堆砌在晶核上，直到晶核生長(zhǎng)到晶體，最后從溶液中析出。蛋白質(zhì)純度越高，結(jié)晶越容易，至少要在蛋白質(zhì)純度越高，結(jié)晶越容易，至少要在50%以以上。上。蛋白質(zhì)濃度。濃度越高，結(jié)晶時(shí)機(jī)越大。但過(guò)大蛋白質(zhì)濃度。濃度越高，結(jié)晶時(shí)機(jī)越大。但過(guò)大會(huì)因雜質(zhì)存在而導(dǎo)致晶形不好。普通結(jié)晶的蛋白會(huì)因雜質(zhì)存在而導(dǎo)致晶形不好。普通結(jié)晶的蛋白質(zhì)濃度在質(zhì)濃度在1050 mg/mL。溫度。蛋白質(zhì)結(jié)晶溫度在溫度。蛋白質(zhì)結(jié)晶溫度在0400C。普通在。普通在40C冷室或冷室或250C

19、溫箱中進(jìn)展。溫箱中進(jìn)展。pH。普通在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的。普通在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH附近結(jié)晶。附近結(jié)晶。金屬離子和離子強(qiáng)度。一些二價(jià)離子可以引起或金屬離子和離子強(qiáng)度。一些二價(jià)離子可以引起或有利于蛋白質(zhì)的結(jié)晶過(guò)程。有利于蛋白質(zhì)的結(jié)晶過(guò)程。沉淀劑。沉淀劑沉淀劑。沉淀劑(如鹽類和各種有機(jī)溶劑如鹽類和各種有機(jī)溶劑)可改動(dòng)可改動(dòng)蛋白質(zhì)的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇蛋白質(zhì)的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇(PEG)和和2-甲基甲基-2，4-戊二醇戊二醇(MPD)。鹽析法鹽析法 在蛋白質(zhì)溶液中參與鹽，使蛋白質(zhì)溶解度降低，在蛋白質(zhì)溶液中參與鹽，使蛋白質(zhì)溶解度降低，之后以結(jié)晶方式從溶液中析出。之后以結(jié)晶方式從溶

20、液中析出。有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)介電常數(shù)降低，導(dǎo)致蛋有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)介電常數(shù)降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)晶析出。白質(zhì)結(jié)晶析出。等電點(diǎn)結(jié)晶。等電點(diǎn)結(jié)晶。 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，可以構(gòu)成結(jié)晶。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，可以構(gòu)成結(jié)晶。脫鹽結(jié)晶。脫鹽結(jié)晶。 一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶于鹽溶液的蛋白質(zhì)結(jié)晶而出，然后透析除鹽。于鹽溶液的蛋白質(zhì)結(jié)晶而出，然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)，不溫差除鹽。適用于一些對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)，不同溫度溶解度變化大。可運(yùn)用此法。同溫度溶解度變化大?？蛇\(yùn)用此法。金屬離子。在某些蛋白質(zhì)溶

21、液中參與金屬離子，金屬離子。在某些蛋白質(zhì)溶液中參與金屬離子，可以促進(jìn)晶體的構(gòu)成?？梢源龠M(jìn)晶體的構(gòu)成。蛋白質(zhì)提純過(guò)程中的定量蛋白質(zhì)提純過(guò)程中的定量定氮法丈量蛋白質(zhì)含量定氮法丈量蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量克蛋白質(zhì)含量克% =每克生物樣品中含氮的克數(shù)每克生物樣品中含氮的克數(shù) 6.25雙縮脲法雙縮脲法 第一個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。第一個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。 雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為雙縮脲試劑的成分是質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的的氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為氫氧化鈉溶液和質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的硫酸的硫酸銅溶液。在堿性溶液銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中中,雙縮脲雙縮脲(H2NOCNH

22、CONH2)能與能與Cu2+作用作用,構(gòu)成構(gòu)成紫色或紫紅色的絡(luò)合物紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反響叫做雙縮脲這個(gè)反響叫做雙縮脲反響。反響。 由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲構(gòu)造類由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲構(gòu)造類似的肽鍵似的肽鍵,因此因此,含兩個(gè)或亮個(gè)以上的肽鍵化合含兩個(gè)或亮個(gè)以上的肽鍵化合物尤其是蛋白質(zhì)都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反物尤其是蛋白質(zhì)都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反響。響。福林福林- -酚試劑法：酚試劑法： 在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反響，生成藍(lán)色劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反響，生成藍(lán)色化合物，在化合物，在600 nm 600 nm 下

23、測(cè)光吸收?？筛鶕?jù)下測(cè)光吸收?？筛鶕?jù)測(cè)得的規(guī)范曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。測(cè)得的規(guī)范曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。靈敏度較高，可達(dá)靈敏度較高，可達(dá)2525g-250 g-250 g/mlg/ml。靈敏度比靈敏度比280 nm 280 nm 處的紫外吸收法靈敏處的紫外吸收法靈敏1010倍，比雙縮脲法靈敏倍，比雙縮脲法靈敏100100倍。倍。 紫外吸收法紫外吸收法A.280nmA.280nm光吸收法光吸收法 根據(jù)得到的根據(jù)得到的280 nm280 nm的光吸收值與蛋白的光吸收值與蛋白質(zhì)的濃度正比，可以丈量蛋白質(zhì)溶液中質(zhì)的濃度正比，可以丈量蛋白質(zhì)溶液中的濃度。的濃度。B.280nmB.280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 用用280nm280nm下的紫外吸收減去下的紫外吸收減去260nm260nm下的下的紫外吸收，可以排除紫外吸收，可以排除260nm260nm下由于核酸吸下由于核酸吸光帶來(lái)的干擾。光帶來(lái)的干擾。蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45(mg/mL)=1.45* *A280nm-A280nm-0.740.74* *A260nmA26