蛋白質(zhì)的純化與鑒定-2p

1、Advanced Biochemistry Fall 20143/28/202223/28/20224GF v03 Aug 20005I. Gel FiltrationChromatography （GFC）n凝膠過濾 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959)n分子篩層析（molecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)n排阻層析 （exclusion chromatography）(Pedersen, 1962) 指混合物隨流動相經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。

2、 Gel filtration is a technique of liquid chromatography which separates molecules according to their sizes.GF v03 Aug 20007 基本原理 凝膠層析的數(shù)理關(guān)系 凝膠層析的優(yōu)點(diǎn) 凝膠層析的缺點(diǎn) 凝膠介質(zhì) 凝膠類型的選擇 其它條件選擇固定相流動相小分子被延滯小分子大分子較快流出 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 分子大小不同分子大小不同, ,在凝膠受到的在凝膠受到的阻滯作用有差阻滯作用有差異異, ,從而造成各從而造成各組分在凝膠柱組分在凝膠柱中的遷移速度中的遷移速度不同得到分不同得到分離。10

3、M - LMW markers1 - Start material2 - Pool from ion exchange3 - Pool from HIC4 - Pool from Superdex 75 pg4321MM67k43k30kHighly efficient desalting in less than 1 minute 10 20 30 40 50 secAlbuminNaCl柱床體積柱床體積VT凝膠干體積凝膠干體積Vg內(nèi)水體積內(nèi)水體積Vi存在于柱床內(nèi)凝膠存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一相體積，相應(yīng)于一般層析法中流動相般層析法中流動相的體積。的體積

4、。顆粒內(nèi)部所含水相顆粒內(nèi)部所含水相的體積它可從干凝的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水膠顆粒重量和吸水重量相減求得。重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內(nèi)凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。外間隙體積的總和。 VT = 1/4 D2h 外水體積外水體積V0V VT T = Vg + V= Vg + V0 0 + Vi+ Vi數(shù)理關(guān)系數(shù)理關(guān)系Void volume VoVolume of the gel matrix VgPore volume ViGF v03 Aug 2000VoVeVolumeConcentration Ve -VoVe -Vo Kd = Kd = Vi Vi分配系數(shù)（分配系數(shù)（ K

5、d ）：）：特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）與被分離物質(zhì)分）與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小有關(guān)孔隙的大小有關(guān) （2）與柱的長短粗細(xì)）與柱的長短粗細(xì)無關(guān)無關(guān) Kd is difficult to get because Vi is difficult to measure(3)Ve = Vo + Vi(3)Ve = Vo + Vi Kd = 1 Kd = 1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝膠顆粒內(nèi)完全向凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散部擴(kuò)散n在兩相分配的比值在兩相分配的比值為為1, 1,最后流出最后流出. .(1)Ve = Vo(1)Ve = Vo Kd = 0 Kd = 0n分子完

6、全被排分子完全被排阻于凝膠顆粒阻于凝膠顆粒之外之外n全部分布于流全部分布于流動相里動相里, ,n最先流出。最先流出。(2) 0 Kd 1 (2) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKdVe = Vo +ViKd為溶質(zhì)以某種程為溶質(zhì)以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)度向凝膠顆粒內(nèi)擴(kuò)散散 2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠（商品名為（商品名為Sepharose，Biogel-A)型號型號 近似的瓊脂糖濃度近似的瓊脂糖濃度(%)多糖多糖 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) Sepharose 2B 220106 40106Sepharose 4B45106 20106Sepharose 6B61106 4106各種層析膠體：Pharmac

7、iaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose六、凝膠類型的選擇六、凝膠類型的選擇Ixv_2 JB 98091035GF v03 Aug 200036 基本原理 離子交換劑的類型 離子交換劑與緩沖液的選擇 應(yīng)用 離子交換層析的優(yōu)點(diǎn)低鹽高鹽分離結(jié)束帶電荷洗脫樹脂與樹脂結(jié)合力膠體膠體陽離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂弱酸性

8、，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素（二）按載體種類不同（二）按載體種類不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯可引入的解離基團(tuán)可引入的解離基團(tuán)操作過程：操作過程： 1.裝柱； 2.離子交換； 3.洗脫選用何種類型離子交換劑?-取決于離子交換劑對諸反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此，強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離于交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。（二）緩沖液的選擇（二）緩沖液的選擇( (三三) )洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇64Af

9、finity chromatography is a technique of liquid chromatography which separates biomolecules through biospecific interactions. 基本原理 分離過程 特點(diǎn) 應(yīng)用MatrixSpecific ligand凝膠濃度越低凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松即多孔性越高結(jié)構(gòu)越疏松即多孔性越高機(jī)械強(qiáng)度越低機(jī)械強(qiáng)度越低特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)：物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng)抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強(qiáng) 可供化學(xué)反應(yīng)的可供化學(xué)反應(yīng)的KL無效洗脫吸附效率不高有效吸附IV. Hydrophob

10、ic interaction chromatography（HIC）疏水層析疏水層析GF v03 Aug 200085 基本原理 操作 介質(zhì)的選擇 配基的選擇 疏水層析的影響因素 疏水層析的優(yōu)點(diǎn) 疏 水 層 析 亦 稱 疏 水 作 用 層 析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，它也屬于吸附層析一類, 通過表面疏水性的差異來分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。一、疏水層析的原理一、疏水層析的原理 不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強(qiáng)弱、分布及空間位阻效應(yīng)各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。 在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強(qiáng)弱順序?yàn)?/p>

11、Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。（一）疏水作用（一）疏水作用蛋白質(zhì)與固定相結(jié)合原理蛋白質(zhì)與固定相結(jié)合原理蛋白質(zhì)表面存在的疏水補(bǔ)丁蛋白質(zhì)表面存在的疏水補(bǔ)丁蛋白質(zhì)發(fā)生（局部可逆性）變性時(shí)，原本隱藏于分蛋白質(zhì)發(fā)生（局部可逆性）變性時(shí)，原本隱藏于分子內(nèi)部的疏水殘基暴露至分子表面子內(nèi)部的疏水殘基暴露至分子表面疏水層析的特性：即在高鹽濃度下，暴露于分子表疏水層析的特性：即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水殘基容易與疏水性固定相結(jié)合面的疏水殘基容易與疏水性固定相結(jié)合洗脫原理洗脫原理 通過降低流動相的離子強(qiáng)度，將結(jié)合于固定相的物質(zhì)按結(jié)通過降低流動相的離子強(qiáng)度，將結(jié)合于固定相的物

12、質(zhì)按結(jié)合能力的大小依次洗脫下來（疏水作用弱的物質(zhì)先被洗脫下合能力的大小依次洗脫下來（疏水作用弱的物質(zhì)先被洗脫下來，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，結(jié)合能力強(qiáng)的物質(zhì)也被逐來，隨著離子強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，結(jié)合能力強(qiáng)的物質(zhì)也被逐漸洗脫）漸洗脫）（二）吸附劑（二）吸附劑根據(jù)基質(zhì)的性質(zhì)不同分為：根據(jù)基質(zhì)的性質(zhì)不同分為：1. 1.親水性吸附劑：親水性吸附劑：目前這類吸附劑主要是交聯(lián)瓊脂目前這類吸附劑主要是交聯(lián)瓊脂糖（糖（SepharoseSepharose）, , 配體有苯基和辛基化合物。二者配體有苯基和辛基化合物。二者耦合而成耦合而成特點(diǎn)：特點(diǎn)：不耐壓，一般僅用于常壓層析系統(tǒng)不耐壓，一般僅用于常壓層析系統(tǒng)2.2

13、.非親水性吸附劑：非親水性吸附劑：這類吸附劑的基質(zhì)有硅膠、樹這類吸附劑的基質(zhì)有硅膠、樹脂等，配體為苯基、辛基和烷基等，二者通過共脂等，配體為苯基、辛基和烷基等，二者通過共價(jià)鍵結(jié)合價(jià)鍵結(jié)合特點(diǎn)：特點(diǎn)：耐壓，機(jī)械性能好。不僅適用于常壓層析，耐壓，機(jī)械性能好。不僅適用于常壓層析，特別適用于高壓層析（如特別適用于高壓層析（如HPLCHPLC等）等）二、操作二、操作1. 1.制備層析柱制備層析柱2.2.加樣與洗脫加樣與洗脫3.3.層析柱再生層析柱再生921. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionEquilibrate the col

14、umn and adjust the sample to binding conditionsHydrophobic ligandGel matrixWater molecules931. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrixProteinsHydrophobic groups 941. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteins951. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbs96Conc. saltAbs1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionMore strongly bound proteins偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基 對某些蛋白，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，洗脫有時(shí)需用有機(jī)溶劑，有變性風(fēng)險(xiǎn)；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不僅可提供足夠的結(jié)合力，且避免了上述缺點(diǎn)。五、五、