益生枯草芽孢桿菌MA139增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

1、.腿肄蠆蝕衿艿薅蠆羈肂薁蚈膃莈蕆蚇袃膀莃蚆羅莆蟻蚆肈腿薇蚅膀莄蒃螄袀膇荿螃羂莂芅螂肄膅蚄螁襖蒁薀螁羆芄蒆螀聿葿莂蝿膁節(jié)蝕螈袁肅薆袇羃芀蒂袆肅肅莈裊螅羋莄裊羇肁蚃襖聿莇蕿袃膂腿蒅袂袁蒞莁袁羄膈蝕羀肆莃薆罿膈膆蒂罿袈莂蒈薅肀芄莄薄膃蒀螞薃袂芃薈薂羅蒈蒄薂肇芁莀蟻腿肄蠆蝕衿艿薅蠆羈肂薁蚈膃莈蕆蚇袃膀莃蚆羅莆蟻蚆肈腿薇蚅膀莄蒃螄袀膇荿螃羂莂芅螂肄膅蚄螁襖蒁薀螁羆芄蒆螀聿葿莂蝿膁節(jié)蝕螈袁肅薆袇羃芀蒂袆肅肅莈裊螅羋莄裊羇肁蚃襖聿莇蕿袃膂腿蒅袂袁蒞莁袁羄膈蝕羀肆莃薆罿膈膆蒂罿袈莂蒈薅肀芄莄薄膃蒀螞薃袂芃薈薂羅蒈蒄薂肇芁莀蟻腿肄蠆蝕衿艿薅蠆羈肂薁蚈膃莈蕆蚇袃膀莃蚆羅莆蟻蚆肈腿薇蚅膀莄蒃螄袀膇荿螃羂莂芅螂肄膅蚄

2、螁襖蒁薀螁羆芄蒆螀聿葿莂蝿膁節(jié)蝕螈袁肅薆袇羃芀蒂袆肅肅莈裊螅羋莄裊羇肁蚃襖聿莇蕿袃膂腿蒅袂袁蒞莁袁羄膈蝕羀肆莃薆罿膈膆蒂罿袈莂蒈薅肀芄莄薄膃蒀螞薃袂芃薈薂羅蒈蒄薂肇芁莀蟻腿肄蠆蝕衿艿薅蠆羈肂薁蚈膃莈蕆蚇袃膀莃蚆羅莆蟻蚆肈腿薇蚅膀莄蒃螄袀膇荿螃羂莂芅螂肄膅蚄螁襖蒁薀螁羆芄蒆螀聿葿莂蝿膁節(jié)蝕螈袁肅薆袇羃芀蒂袆肅肅莈裊螅羋莄裊羇肁蚃襖聿莇蕿袃膂腿蒅袂袁蒞莁袁羄膈蝕羀肆莃薆罿膈膆蒂罿袈莂蒈薅肀芄莄薄膃蒀螞 益生枯草芽孢桿菌MA139增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化郭小華1 陸文清1,2 鄧萍1 黃德仕(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心，北京100193；2.北京晟育達(dá)生物科技有限公司，北京100193)摘 要 為得

3、到益生芽抱桿菌Bacillus subtilis MA139產(chǎn)芽抱的最佳的培養(yǎng)基，以搖瓶發(fā)酵的方法，用P1ackett-Burman設(shè)計(jì)從l1種原料中篩選出4種對(duì)芽抱產(chǎn)量有顯著影響的因素，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，然后針對(duì)這4個(gè)主要因素，用最陡爬坡試驗(yàn)及中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)芽抱的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果證明，當(dāng)培養(yǎng)基的配方為：玉米粉3.17g/L、大豆粉5.80g/L、蛋白胨3.62g/L、MnSO4·H2O1.06g/L、葡萄糖5g/L、尿素3g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L和KH2PO43g/L時(shí)，MAI39發(fā)酵36h細(xì)菌總數(shù)可以從8.32&

4、#215;108cfu/ml提高到3.10×109cfu/mL，芽抱率達(dá)到96%。試驗(yàn)表明，通過(guò)統(tǒng)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件可有效提高B.subtilis MA139產(chǎn)芽孢的得率。關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化；試驗(yàn)設(shè)計(jì) 抗生素添加劑在動(dòng)物日糧中廣泛使用，但其弊端和危害日益體現(xiàn)出來(lái)1，而抗生素替代品的微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)已得到應(yīng)用2。微生態(tài)制劑常用的細(xì)菌是乳酸菌，而芽孢桿菌作為動(dòng)物腸道的外源菌群，也有廣泛應(yīng)用，它能夠改善動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)平衡，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料利用率3-6。優(yōu)良的微生態(tài)制劑必須有足夠的活菌數(shù)量7。因此，為了盡量提高產(chǎn)品芽孢的數(shù)量，需要對(duì)其產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基進(jìn)行系

5、統(tǒng)優(yōu)化，以降低生產(chǎn)成本，提高芽孢得率8。芽孢桿菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化一般采用單因子試驗(yàn)以及結(jié)合均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)的方法9-10。目前趨向采用統(tǒng)計(jì)軟件構(gòu)建高效試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬和優(yōu)化，可以簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，提高準(zhǔn)確性11-14。本試驗(yàn)旨在以本試驗(yàn)室分離篩選得到的一株枯草芽孢桿菌MA139為出發(fā)菌株，優(yōu)化產(chǎn)芽孢的最適培養(yǎng)基。1、材料與方法1.1、菌株枯草芽孢桿菌MA139，本實(shí)驗(yàn)室自行分離和保存。該菌株經(jīng)中科院微生物所鑒定，其16S rRNA基因序列在GenBank的登錄號(hào)為DQ415893。該菌株具有飼用益生菌的應(yīng)用潛力。1.2、培養(yǎng)基1)種子及斜面保存

6、培養(yǎng)基(SC培養(yǎng)基)成分為葡萄糖5g/L；蛋白胨5g/L；酵母粉1g/L；牛肉膏3g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；MnSO4·H2O 0.005g/L；pH7.0。固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基中添加1.8%的瓊脂作為凝固劑。2)發(fā)酵培養(yǎng)基分別按照Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合設(shè)計(jì)的方法來(lái)配制。1.3、試劑和原料玉米、大豆為市售，粉碎后過(guò)2O目篩備用；試驗(yàn)中其他試劑均為分析純。1.4、培養(yǎng)條件1)種子培養(yǎng)條件 250 mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基5OmL，接斜面活化后的種子一環(huán)，37，225r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)20h。2)發(fā)酵培養(yǎng)條件250

7、mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基5OmL，按照4的接種量接種后在37，225r/min旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)36h。1.5、細(xì)菌總數(shù)和芽孢總數(shù)的測(cè)定平板稀釋法計(jì)數(shù)活菌數(shù)。芽孢計(jì)數(shù)則將稀釋液放入8O水浴中處理20min后培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1.6、培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)1)Plackett-Burman設(shè)計(jì)在優(yōu)化初期利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法15，以葡萄糖(X1)、可溶性淀粉(X2)、玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、(NH4)2SO4(X5)、尿素(X6)、蛋白胨(X7)、MgSO4·7H2O(X8)、KH2PO4(X9)、CaC12(X10)、MnSO4·H2O(X11)等為試驗(yàn)因子，對(duì)這11

8、種原料進(jìn)行全面考察，并將其編碼為-1和+1的高低二階層，其所代表的質(zhì)量濃度值，見(jiàn)表1。選用”n=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，并加上3個(gè)中心點(diǎn)來(lái)篩選和探討11個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)細(xì)菌總數(shù)和芽孢總數(shù)的影響，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告為2個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值，見(jiàn)表2。表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各參數(shù)的編碼值及其質(zhì)量濃度 g/L獨(dú)立變量編碼水平-1+1葡萄糖(X1)515可溶性淀粉(X2)515玉米粉(X3)515大豆粉(X4)1030(NH4)2S04(X5)26尿素(X6)39蛋白胨(X7)515MgS04·7H2O(X8)0.51.5KH2P04(X9)13CaCl2(X

9、10)26MnS04·H2O(X11)0.050.5 2)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)結(jié)果，故只有在最先逼近最大目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程16。以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，從而快速逼近產(chǎn)量最大值。根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果，來(lái)確定是否進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。 3)中心組合設(shè)計(jì)根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出的試驗(yàn)因子和最陡爬坡試驗(yàn)確定的逼近濃度，以JMP5.0軟件設(shè)計(jì)中的DOE程序進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，擬合數(shù)據(jù)得到一個(gè)描述因變量(細(xì)菌總數(shù))與自變

10、量(培養(yǎng)基組分)關(guān)系的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1-17：y=bo+biXi +bijXiXj+biiX2ii；式中：y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，即細(xì)菌總數(shù)(1gNtot(cfu/mL)；b為回歸系數(shù)；Xi為自變量的編碼水平。用JMP5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，并對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)和方差分析。 2、結(jié)果與討論2.1、影響芽孢桿菌增殖的重要因素按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在發(fā)酵36h時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液當(dāng)中的細(xì)菌總數(shù)(total number，Ntot)和芽孢總數(shù)(spore number，Ns)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2并對(duì)其進(jìn)行一階模式回歸分析(表3)。細(xì)菌總

11、數(shù)和芽孢總數(shù)2種結(jié)果回歸分析的檢定系數(shù)分別為0.96和0.94，說(shuō)明回歸分析能夠確切地描述試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)B.subtilis MA139發(fā)酵起主要作用有4種原料，即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和MnSO4·H2O，并對(duì)11種原料成分歸納調(diào)整，作為下一步試驗(yàn)分析的依據(jù)。質(zhì)量濃度調(diào)整說(shuō)明見(jiàn)表4。表2 Plackeet-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果(n=12)編號(hào)變量水平響應(yīng)值X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11lgNtot/(cfu/ml)lgNs/(cfu/ml)1-11-111-11-1-11-18.698.482-1-1-1-11-111-1-119.379.35

12、3000000000009.018.9941-1-111-11-11-1-18.418.405-111-11-1-111-1-19.319.296111111111118.438.327-11-1-1-111-11-119.259.24811-11-1-1-11-1-119.079.069-1-111-1111-1-1-18.238.1810000000000009.059.0511111-1-1-11-1-11-18.308.26121-1-1-1-11-1111-19.159.1513-1-111-1-1-1-11119.068.9414000000000009.029.01151-11-

13、111-1-1-1-118.798.74 表3 Plackeet-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果 cfu/L截距參數(shù)細(xì)菌總數(shù)Ntot芽孢總數(shù)Ns參數(shù)估計(jì)tP參數(shù)估計(jì)tPintercept8.876203.0440.0008.831163.2940.000X1-0.147-3.0010.058-0.129-2.1360.122X20.0030.0680.950-0.009-0.1520.889X3-0.152-3.1030.053*-0.163-2.6880.075*X4-0.190-3.8880.030*-0.221-3.6520.035*X5-0.005-0.1020.925-0.021-

14、0.3450.753X6-0.082-1.6710.193-0.099-1.6400.200X7-0.173-3.5470.038*-0.159-2.6330.078*X80.0881.8070.1680.1081.7880.173X90.0971.9780.1420.1061.7500.178X10-0.005-0.1020.925-0.034-0.5650.612X110.1573.2050.049*0.1582.6050.080*P=0.082，RSq=0.96 P=0.125，RSq=0.94        

15、;                注：*為P0.1，*0.05。表4 Plackeet-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子結(jié)果的質(zhì)量濃度分析試驗(yàn)因子質(zhì)量濃度（g/L）說(shuō)明調(diào)整前調(diào)整后葡萄糖(X1)5-155對(duì)細(xì)菌總數(shù)和芽孢總數(shù)為負(fù)相關(guān)，對(duì)細(xì)菌總數(shù)影響達(dá)到顯著水平，而對(duì)芽孢總數(shù)的影響不顯著，為了減少試驗(yàn)因子，維持在低水平可溶性淀粉(X2)5-15刪除無(wú)顯著影響，可信度大于20%，刪除此因子玉米粉(X3)5-151-5負(fù)顯著，降低篩選濃度大豆粉(X4)10-

16、301-10負(fù)極顯著，降低篩選濃度(NH4)2S04(X5)2-6刪除無(wú)顯著影響，可信度大于20%，刪除此因子尿素(X6)3-93不顯著，負(fù)相關(guān)，可信度小于20%，為減少試驗(yàn)因子，維持在低水平蛋白胨(X7)5-151-5負(fù)顯著，降低篩選濃度MgS04·7H2O(X8)0.5-1.51.5不顯著，可信度小于20%，為減少試驗(yàn)因子，維持在高水平KH2P04(X9)1-33不顯著，正相關(guān)，P值相對(duì)較小，維持在高水平CaCl2(X10)2-6刪除不顯著，可信度大于20%，刪除此因子MnS04·H2O(X11)0.05-0.50.5-1.5顯著，正相關(guān)，提高篩選濃度2.2、最陡爬坡試

17、驗(yàn)選取對(duì) B.subtilis MA139發(fā)酵 4種主要原料。對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中得到的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較中心點(diǎn)水平的平均響應(yīng)值與試驗(yàn)點(diǎn)處的平均響應(yīng)值間的差異顯著性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，中心點(diǎn)水平與試驗(yàn)點(diǎn)間在a=005水平上不顯著(P值分別是0.460和0.388)，這就表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選取的中心點(diǎn)水平還沒(méi)有接近最大的響應(yīng)區(qū)域內(nèi)，因此還必須進(jìn)一步尋找中心點(diǎn)值，也就是最陡爬坡試驗(yàn)。 以回歸系數(shù)最大的大豆粉(X4)為基準(zhǔn)，以每次減少濃度1%為基本步長(zhǎng)()。處理5中的細(xì)菌總數(shù)和芽孢總數(shù)達(dá)到了最高，這一結(jié)果表明，處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnS

18、O4·H20(X11)這4種物質(zhì)濃度已在最優(yōu)點(diǎn)附近，可以此濃度為中心點(diǎn)采用中心組合設(shè)計(jì)來(lái)對(duì)培養(yǎng)基作進(jìn)一步的優(yōu)化(表5)。而且在Plackett-Burman設(shè)計(jì)及最陡爬坡試驗(yàn)中，細(xì)菌總數(shù)與芽孢總數(shù)的分析結(jié)果一致，故在以下的中心組合設(shè)計(jì)僅以發(fā)酵液的細(xì)菌總數(shù)作為考察目標(biāo)。表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果處理序號(hào)培養(yǎng)基成分/（g/L）結(jié)果玉米粉（X3）大豆粉（X4）蛋白胨（X7）MnSO4·H20（X11）lgNtot/(cfu/ml)lgNs/(cfu/ml)15.0010.005.000.509.339.2824.529.004.520.619.379.3034.088.004

19、.080.729.139.1243.647.003.640.839.349.2953.206.003.200.949.439.4062.765.002.761.059.399.3472.324.002.321.169.109.0181.883.001.881.279.179.1591.442.001.441.389.068.95101.001.001.001.508.918.84 2.3、中心組合設(shè)計(jì)以最陡爬坡試驗(yàn)中處理5的玉米粉(X3)、大豆粉(X4)、蛋白胨(X7)、MnSO4·H2O(X11)的濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，選擇中心試驗(yàn)點(diǎn)為3，星號(hào)臂長(zhǎng)=1.547。各自變量水

20、平見(jiàn)表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。 分析結(jié)果表明(表8)，模型極顯著(P0.01)，并且有很好的確定系數(shù)，RSq=0.93。這表明B.subtilis MA139細(xì)菌總數(shù)93%的可靠性可由模型來(lái)預(yù)測(cè)。并可以通過(guò)回歸分析結(jié)果得出試驗(yàn)?zāi)Ｐ停簓=9.434-0.003X3-0.025X4+0.028X7-0.013X11-0.006X3X4-0.02X3X7-0.009X4X7-0.012X3X11-0.026X4X11-0.03X7Xll-0.068X3X3-0.013X4X4-0.043X7X7-0.025X11X11  自變量前的數(shù)值為回歸模型對(duì)應(yīng)項(xiàng)的 P值。 根據(jù)

21、JMP模型的分析結(jié)果以及二次回歸方程可以得出，此模型具有最大響應(yīng)值，極值分析結(jié)果見(jiàn)表9。根據(jù)結(jié)果換算成4個(gè)主因素的實(shí)際濃度值，即玉米粉3.17g/L，大豆粉5.80g/L，蛋白胨3.62g/L，MnSO4·H2O1.06g/L。采用優(yōu)化出的培養(yǎng)基，芽孢桿菌最終細(xì)菌濃度預(yù)測(cè)值為2.84×109cfu/mL。 為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化的培養(yǎng)基重復(fù)試驗(yàn)3次，發(fā)酵液當(dāng)中平均細(xì)菌數(shù)為 2.91×l09cfu/mL，這表明實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。表6 中心組合設(shè)計(jì)各因子及其編碼值 g/L獨(dú)立變量編碼水平-1.547-1011.54

22、7玉米粉（X3）1.652.203.204.204.75大豆粉（X4）4.455.006.007.007.55蛋白胨（X7）1.652.203.204.204.75MnSO4·H20（X11）0.550.690.941.191.32表7 中心組合設(shè)計(jì)及其結(jié)果編號(hào)變量水平lgNs/(cfu/ml)編號(hào)變量水平lgNs/(cfu/ml)X3X4X7X11X3X4X7X111-1-1119.3615-111-19.392-1-11-19.3616-11-119.2731.5470009.28171-1-1-19.244-1.5470009.271811-1-19.3150001.5479.

23、341900-1.54709.306-11119.23200-1.547009.467111-19.3021-1-1-119.298-1-1-1-19.2022001.54709.37900009.422300009.441000009.4324-11-1-19.20111-1119.292501.547009.341211119.2026000-1.5479.41131-1-119.34271-11-19.361411-119.20表8 中心組合設(shè)計(jì)(CCD)回歸分析結(jié)果回歸系數(shù)參數(shù)估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差tP回歸系數(shù)參數(shù)估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差tPIntercept9.4340.015638.8100.000Inte

24、rcept9.4340.015638.8100.000X3-0.0030.007-0.3910.702X3X11-0.0120.007-1.6350.128X4-0.0250.007-3.8600.002X4X11-0.0260.007-3.4910.004X70.0280.0074.2820.001X7X11-0.0300.007-4.0670.002X11-0.0130.007-1.9610.074X3X3-0.0680.009-7.6720.000X3X4-0.0060.007-0.8550.409X4X4-0.0130.009-1.5220.154X3X7-0.0200.007-2.6150.023X7X7-0.0430.009-4.8910.000X4X7-0.0090.007-1.2570.233X11X11-0.0250.009-2.8050.016表9 響應(yīng)面極值分析臨界值估計(jì)值細(xì)菌總數(shù)Nt/(cfu/ml)穩(wěn)定點(diǎn)模型X3X4X7X11-0.03-1.20.420.129.4542.84&