無菌工藝驗證--培養(yǎng)基灌封試驗

1、2022-3-29-1-無菌工藝驗證 培養(yǎng)基灌封試驗主講人：崔強2008年3月E-mail: 2022-3-29-2-為什么需要 進行培養(yǎng)基灌封試驗？2022-3-29-3-來自生產工藝的要求對產品進行最終滅菌，是降低微生物污染風險的常用辦法。但有大量藥品不適用于最終滅菌而只能采用無菌生產工藝方法。無菌生產工藝是制藥領域中最難的工藝之一，確保產品無菌是該工藝最大的難點。減少無菌工藝藥品污染風險的兩項重要措施人員培訓無菌工藝驗證2022-3-29-4-最終滅菌工藝與無菌生產工藝的差異最終滅菌工藝在高潔凈凈環(huán)境下進行灌裝和密封通常，產品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中進行最終滅菌無菌

2、生產工藝產品、容器和密封件分別進行滅菌，然后進行灌封在極高潔凈環(huán)境下進行灌裝和密封產品在最終容器中不再做進一步的滅菌處理對各個組成部分的滅菌工藝需要進行嚴格驗證和監(jiān)控在灌封前和灌封過程中的操作會帶來污染風險空瓶滅菌隧道密封件蒸汽滅菌釜除菌過濾人員半壓塞瓶凍干機全壓塞瓶2022-3-29-5-來自FDA和USP的要求FDA CGMP 無菌工藝藥品指南（2004年版） An aseptic processing operation should be validated using a microbiological growth medium in place of the product. T

3、his process simulation, also known as a media fill. USP 31 潔凈室和其它控制環(huán)境的微生物學評價 To assure that minimal bioburden is achieved, additional information on the evaluation of the microbiological status of the controlled environment can be obtained by the use of media fills. An acceptable media fill shows th

4、at a successful simulated product run can be conducted on the manufacturing line at that point in time.2022-3-29-6-來自EU GMP和國內的要求EU GMP 附件1 無菌藥品的生產（2008年2月新版） Validation of aseptic processing should include a process simulation test using a nutrient medium (media fill).中國藥品生產質量管理規(guī)范附錄（1998年修訂）SFDA 化學

5、藥品注射劑基本技術要求（試行） 培養(yǎng)基灌裝驗證是對設備、環(huán)境以及人員操作的一種系統(tǒng)驗證,是判斷無菌保證水平的關鍵手段 采用無菌生產工藝的粉針劑，應能保證SAL不大于10-3 2022-3-29-7-無菌工藝產品的無菌保證 無菌工藝產品PersonnelEnvironment工藝驗證人員原料環(huán)境無菌檢驗2022-3-29-8-作業(yè)環(huán)節(jié)與風險作業(yè)環(huán)節(jié)驗證難易度人員依賴程度相關風險滅菌易低低房間設計N/AN/A中等環(huán)境監(jiān)測中等可變高消毒難高高更衣難很高很高物品轉移難高高無菌技術（灌封）難很高很高無菌裝配難很高很高2022-3-29-9-培養(yǎng)基灌封實驗的 常規(guī)要求2022-3-29-10-定義與目的

6、目的證明生產線采用無菌工藝生產無菌產品的能力對人員進行資格確認符合cGMP的要求使用培養(yǎng)基模擬藥品進行無菌灌封，對無菌工藝進行驗證。又稱為“工藝模擬試驗”.2022-3-29-11-工藝模擬試驗的通常流程將培養(yǎng)基暴露于設備、容器膠塞密封系統(tǒng)的表面和關鍵環(huán)境條件中，并模擬實際生產完成工藝操作。對裝有培養(yǎng)基的密閉容器進行培養(yǎng)以檢查微生物的生長。評價結果，確定實際生產中（如灌裝前的調試、加入無菌原輔材料、無菌連接、灌裝和密封）產品污染的可能性。 2022-3-29-12-培養(yǎng)基灌封試驗的時機 初始驗證與再驗證初始驗證需要重復多次，以確保結果的一致性和有效性。有差異的多次實驗結果工藝過程失控的象征定期

7、再驗證定期進行，評估無菌工藝的受控情況。應綜合考慮每一班次及班次變化過程中有代表性的活動及干預。對人員的資格再確認應納入到定期再驗證中。2022-3-29-13-培養(yǎng)基灌封試驗的時機 增補性培養(yǎng)基灌封試驗變更及其評估對產品或生產線的每一種變更，均應根據(jù)書面的變更控制系統(tǒng)進行評估 。如果通過評估認為此項變更會影響到無菌生產工藝產品的無菌保證水平，則需要進行增補性培養(yǎng)基灌封實驗。比如，設施或設備的變化、生產線配置的變動、人員重要變動、環(huán)境監(jiān)控結果異常、容器-膠塞系統(tǒng)變更、停車時間延長、無菌檢查結果陽性等。2022-3-29-14-實驗用培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度的選擇選擇時的注意事項適應廣譜微生物生長，包括

8、細菌和真菌較好的澄明度，較小的粘度易于除菌過濾常用培養(yǎng)基：3大豆胰蛋白肉湯（TSB）厭氧培養(yǎng)基僅在特殊情況下使用培養(yǎng)溫度FDA - 20-35，目標值2.5，不少于14天；如選擇兩個溫度，則每一溫度下至少培養(yǎng)7天，從低溫開始。PIC - 20-25下至少14天，或，先20-25下7天， 然后30-35下7天。2022-3-29-15-灌裝體積與數(shù)量灌裝體積每只容器的灌裝體積不少于總容積的1/3同樣，灌裝體積也不宜過大既要考慮到瓶倒轉或旋轉時，培養(yǎng)基能充分接觸到容器和密封件的內表面，又要保證容器內有足夠的氧氣支持微生物生長。灌封數(shù)量綜合考慮統(tǒng)計學要求和實際生產批量。FDA (5000瓶)：如果正

9、常生產的批次量低于5000瓶，則培養(yǎng)基灌封至少應為實際生產線的最大批次量。PIC (3000瓶)：如果正常生產的批次量低于3000瓶，則培養(yǎng)基灌封至少應為實際生產線的最大批次量。2022-3-29-16-灌封時間與批次量控制灌裝時間對于初始性驗證，培養(yǎng)基灌封實驗應安排在一周內的不同時間進行。對于再驗證，可選擇在一周結束或其它最差條件下進行。灌封時間要涵蓋實際生產班次。批次量控制初次驗證，至少要連續(xù)成功灌封3個批次。再驗證至少需要成功灌封1個批次。2022-3-29-17-培養(yǎng)基灌封實驗的合格標準FDA指南（2004版）與EU GMP 附件1標準統(tǒng)一l灌封量10000瓶時，若有1瓶污染，需徹底調

10、查；若有兩瓶污染，必須進行徹底調查，并重新驗證（3批）。1.注：歐盟標準將自注：歐盟標準將自2009年年3月起執(zhí)行。月起執(zhí)行。2022-3-29-18-培養(yǎng)基灌封實驗的合格標準2009年3月以前歐盟通用標準：污染率低于0.1%計算公式：實際污染率 = (95%置信限值)/(灌封容器數(shù)) 100%污染瓶數(shù)與95%置信限值間的關系污染瓶數(shù)01234567891095%置信限值34.746.37.759.1510.51 11.8413.1514.4315.7116.962022-3-29-19-培養(yǎng)基灌封實驗的合格標準SFDA 化學藥品注射劑基本技術要求（試行）培養(yǎng)基灌裝試驗的批量與判斷合格的標準批

11、量（瓶）3000475063007760允許污染的數(shù)量（瓶）0 1 2 32022-3-29-20-不同劑型的特殊要求2022-3-29-21-凍干制劑對培養(yǎng)基灌封的要求凍干制劑的典型生產流程配制灌裝凍干加塞軋蓋第一種方式，模擬裝載/卸載過程，縮短放置時間（首選）容器內灌封好培養(yǎng)基，以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機凍干機內部分抽真空（500mbar），在室溫放置一定的時間，不得冷凍。用無菌空氣破真空（不使用惰性氣體），全壓塞軋蓋注意，若所使用的容器透明度不高，應將內容物倒出進行檢查。凍干制劑培養(yǎng)基灌封試驗的特殊性對產品在凍干機內放置步驟的模擬2022-3-29-22-凍干制劑對培養(yǎng)基灌封的要求第二種方式

12、，模擬凍干時間半壓塞產品在凍干機腔室內的放置時間同于正常工藝。缺點：耗時長第三種方式，以經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基模擬凍干過程容器內灌封好經(jīng)稀釋的培養(yǎng)基（diluted medium），以半壓塞狀態(tài)裝入凍干機模擬凍干過程，直到容器內的培養(yǎng)基大致達到正常濃度（full strength）為止。缺點：耗時長，需開發(fā)特殊的凍干程序，營養(yǎng)支持性不均一，影響微生物的存活力。2022-3-29-23-粉針劑對培養(yǎng)基灌封的要求第一種方法在灌裝線上直接灌裝液體培養(yǎng)基，灌裝后壓塞-軋蓋或熔封。第二種方法先灌裝干粉培養(yǎng)基，再加入注射用水第三種方法先灌裝惰性劑，再加入液體培養(yǎng)基要點采用第二、三種方法時，所用惰性劑或干粉培養(yǎng)基需

13、事先經(jīng)過輻射滅菌。常用惰性劑有聚乙二醇8000、羧甲基纖維素、乳糖。2022-3-29-24-混懸劑/半固體制劑對培養(yǎng)基灌封的要求懸浮劑需要模擬攪拌或循環(huán)流動的過程。如果有無菌添加過程，也應進行模擬。半固體制劑需要將液體培養(yǎng)基增稠到適當粘度?？蛇x用瓊脂或羧甲基纖維素作為增稠劑，也可選用其它試劑，但要證明其沒有抑制細菌或真菌的作用。在培養(yǎng)結束后，需將培養(yǎng)基從塑料或金屬管中擠出檢查其混濁度和真菌菌落，也可進行無菌檢查實驗。如果選擇顯色培養(yǎng)基遇到污染物變色的方法，則需要對其進行驗證。2022-3-29-25-方案與報告2022-3-29-26-制訂培養(yǎng)基灌封實驗方案的考慮因素（一）生產線最長運行時間

14、及其造成的相關風險干預的次數(shù)、類型和復雜程度是否有凍干工序設備的無菌裝配總人數(shù)和所從事的操作無菌加入和無菌轉移的次數(shù)班次更換、暫停和必要的更衣無菌設備的拆卸與連接環(huán)境監(jiān)測2022-3-29-27-制訂培養(yǎng)基灌封實驗方案的考慮因素（二）生產線的配置和運行速度產品重量檢查容器/密封系統(tǒng)與無菌操作相關的各種特殊規(guī)定總人數(shù)和所從事的操作n總的原則n綜合考慮生產線可能造成污染的各種因素 n盡可能模擬實際生產的無菌操作 n可能時，應包括最差條件的模擬測試2022-3-29-28-驗證開始前的準備工作設備確認通風系統(tǒng)（HVAC）的確認設備的在線清洗和滅菌CIP,SIP滅（除）菌工藝驗證濕熱、干熱滅菌工藝除菌

15、過濾空氣過濾器的完好性檢測容器/膠塞密封完好性測試人員培訓潔凈室環(huán)境達到設計要求2022-3-29-29-培養(yǎng)基灌封實驗方案的內容舉例定義被模擬的工藝定義使用的房間，灌封線和設備使用的容器和密封件的類型灌裝線的速度灌封數(shù)量模擬過程中的干擾和中斷的數(shù)目和類型參與的人員數(shù)目使用的培養(yǎng)基灌封到容器內培養(yǎng)基的體積選擇的最差條件及其原理培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間所進行的環(huán)境監(jiān)測批記錄復印件職責說明所有工作的合格標準列舉最終報告中需要的文件本次模擬的持續(xù)時間2022-3-29-30-方案的執(zhí)行與記錄（一）培養(yǎng)基灌封的日期和時間使用的房間和設備容器膠塞的型號和尺寸培養(yǎng)基種類和滅菌方式每容器中的灌裝體積灌裝

16、速度灌封的瓶數(shù)，燈檢丟棄的瓶數(shù)和原因培養(yǎng)的瓶數(shù)，陽性的數(shù)量培養(yǎng)時間和溫度2022-3-29-31-方案的執(zhí)行與記錄（二）環(huán)境監(jiān)測的數(shù)據(jù)參與培養(yǎng)基灌封的人員培養(yǎng)基靈敏度檢查的結果有無陽性結果。如有，要給出微生物鑒定的結果。如發(fā)生異常情況，需給出調查報告。2022-3-29-32-培養(yǎng)基灌封實驗中的環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測按照相應的規(guī)程進行，包括：空氣粒子數(shù)沉降碟浮游菌表面監(jiān)測人員監(jiān)測n對無菌生產區(qū)環(huán)境的評估2022-3-29-33-培養(yǎng)基灌封實驗中的靈敏度檢查實驗n培養(yǎng)基靈敏度檢查實驗： 使用完成14天培養(yǎng)的灌封前期培養(yǎng)基樣品n用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和環(huán)境菌作

17、為陽性菌n將每個菌種準備含100cfu/0.1ml的菌液，每個菌種接種2支培養(yǎng)基樣品，同時并平板計數(shù)（雙份）n對真菌在20-25C下培養(yǎng)，對細菌在30-35 C下培養(yǎng)，每天檢查，5天內需有生長跡象2022-3-29-34-再驗證與增補性驗證的要求再驗證對每條生產線，每年進行兩次再驗證，間隔時間為5-7個月 。人員至少每年參加一次再驗證，以進行資格再確認。每條生產線輪流使用最大和最小規(guī)格的容器，變換生產線的速度。增補性驗證根據(jù)風險程度決定培養(yǎng)基灌封實驗的批數(shù)。通常為1-3批。2022-3-29-35-培養(yǎng)基灌封實驗的總結報告最終報告中應包括以下內容模擬的最差條件事件清單環(huán)境監(jiān)測結果微生物鑒別結果

18、培養(yǎng)基的營養(yǎng)檢查實驗結果培養(yǎng)條件、結果讀取日、結果讀取人、每位參與者的灌裝瓶數(shù)等信息。結論（結果是否可以接受）合格證書工藝驗證/再驗證合格證書人員資格確認證書2022-3-29-36-難點討論2022-3-29-37-培養(yǎng)基灌封實驗陽性結果的調查 (一)n調查的范圍應包括環(huán)境微生物監(jiān)測數(shù)據(jù)，空氣懸浮粒子監(jiān)測數(shù)據(jù)CIP設備，清潔、消毒程序的執(zhí)行情況培養(yǎng)基、設備和零件的滅菌工藝，滅菌釜的校正情況高效過濾器檢測 (空氣懸浮粒子水平，過濾器檢漏，風速測量，密封系統(tǒng)檢查，使用年限等)除菌過濾器完好性房間氣流型式與壓差人員操作技術培訓情況2022-3-29-38-培養(yǎng)基灌封實驗陽性結果的調查 (二)n調查

19、的范圍還應包括以往產品無菌檢查實驗結果人員衛(wèi)生狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)培養(yǎng)基灌裝實驗中的干預方式分析該區(qū)域近期是否有過維修活動，生產線的改造情況該生產線培養(yǎng)基灌封實驗歷史數(shù)據(jù)已滅菌物品的儲存條件培養(yǎng)基灌封過程中的異常事件陽性污染菌與環(huán)境監(jiān)測污染菌的鑒別2022-3-29-39-培養(yǎng)基灌封實驗陽性結果的調查 (三)調查結論與風險評估培養(yǎng)基灌封實驗結果有效暫停生產，直至確定污染來源并采取有效的糾偏措施。再驗證合格后，產品方可放行。對培養(yǎng)基灌封實驗后和此前所生產的產品，進行風險評估培養(yǎng)基灌封實驗結果無效重新進行培養(yǎng)基灌封實驗條件1無菌灌裝區(qū)的物理條件不滿足要求條件2人員未按照正常生產程序操作2022-3-29-

20、40-培養(yǎng)基灌封后的生產n培養(yǎng)基灌封后可以進行生產，但要等培養(yǎng)基灌封合格后產品才能放行（產品有報廢的風險）。n無效的培養(yǎng)基灌封后可以進行生產，但所生產的批次要在成功培養(yǎng)基灌封后方可放行。n培養(yǎng)基灌封失敗 生產線不能用來生產，根據(jù)調查結果決定培養(yǎng)基灌封的次數(shù)和數(shù)量，培養(yǎng)基灌封合格后，才能生產。2022-3-29-41-討論：最差條件 Worst Case最差條件最差條件高于或低于正常范圍的條件限度，與正常生產條件相比最有可能造成工藝或生產失敗的條件。注意注意如果某些做法會帶來污染的風險，則不允許用培養(yǎng)基灌封的結果為它的不合理的進行辯護 2022-3-29-42-最差條件的設計（1）儲存時間Hol

21、ding timen灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料、藥液在實際灌封前能夠放置的最長時間n1. 灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料需要再滅菌（除菌）的時間間隔nWorst case: 用超出保存時間的灌封設備、灌封部件、儲罐、無菌物料參與培養(yǎng)基灌封n2. 產品從無菌過濾到灌封加塞完成所需要的時間nWorst case：無菌過濾后存放在儲罐內的培養(yǎng)基模擬實際生產時產品的最大儲存時間后再灌封n產品在灌裝后的儲存時間應在培養(yǎng)基灌封中驗證2022-3-29-43-最差條件的設計（2）灌封的持續(xù)時間Duration of runsn最保守的設計：在培養(yǎng)基灌封試驗中，模擬用時最長的瓶子滿批量生產所需要的時間，其中包括正常的干擾時間（換班、設備維修）。n其他的設計：1.在生產完成后接著進行培養(yǎng)基灌封實驗2.為了減少灌封瓶數(shù)，在每批實驗剛開始及結束前均灌裝培養(yǎng)基，中間空運行灌封機以達到所需要的時間n在任何情況下模