第二章 病原致病基因

1、第二章第二章 病原物致病基因的類型病原物致病基因的類型 胞壁水解酶酶基因、毒素胞壁水解酶酶基因、毒素基因、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)合成有關(guān)酶的基因、編碼未知產(chǎn)物的基因、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)合成有關(guān)酶的基因、編碼未知產(chǎn)物的基因?；?。 病原菌中還有正向調(diào)控寄主范圍的基因，將這些基因轉(zhuǎn)移病原菌中還有正向調(diào)控寄主范圍的基因，將這些基因轉(zhuǎn)移到相關(guān)細(xì)菌中，可使受體菌擴(kuò)大寄主范圍，使原來的不親和互到相關(guān)細(xì)菌中，可使受體菌擴(kuò)大寄主范圍，使原來的不親和互作變?yōu)橛H和互作，這在植物病原細(xì)菌的小種和致病變種中都有作變?yōu)橛H和互作，這在植物病原細(xì)菌的小種和致病變種中都有發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)。 目前已報(bào)道的有植物目前已報(bào)道的有植物病原真菌對植

2、保素解毒酶基因（病原真菌對植保素解毒酶基因（pda）。）。 無毒基因編碼特異性激發(fā)子與抗病基因產(chǎn)物受體互作。病原無無毒基因編碼特異性激發(fā)子與抗病基因產(chǎn)物受體互作。病原無毒基因編碼的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有些是直接起激發(fā)子的作毒基因編碼的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)有些是直接起激發(fā)子的作用，如番茄葉霉病菌的無毒基因用，如番茄葉霉病菌的無毒基因avr9編碼編碼63個個AA的多肽。而有些的多肽。而有些是編碼激發(fā)子合成的酶，如番茄丁香假單胞菌的無毒基因是編碼激發(fā)子合成的酶，如番茄丁香假單胞菌的無毒基因avrD的產(chǎn)的產(chǎn)物是物是3.4104u的蛋白，在合成激發(fā)子中具有酶的功能。的蛋白，在合成激發(fā)子中具有酶的

3、功能。 TMV的外殼蛋白在含有的外殼蛋白在含有N抗病基因的煙草中是過敏反應(yīng)的激抗病基因的煙草中是過敏反應(yīng)的激發(fā)子；其發(fā)子；其avr表型決定因子可能是復(fù)制酶蛋白，有些植物病毒的運(yùn)表型決定因子可能是復(fù)制酶蛋白，有些植物病毒的運(yùn)動蛋白基因也具有無毒基因的功能動蛋白基因也具有無毒基因的功能 （Padgett et al，1993） 。 目前，在植物病原細(xì)菌和真菌中都已分離到非寄主?；缘募つ壳?，在植物病原細(xì)菌和真菌中都已分離到非寄主專化性的激發(fā)子。韋忠民（發(fā)子。韋忠民（1993）證明梨火疫病菌）證明梨火疫病菌hrpN的編碼蛋白（的編碼蛋白（harpin）具有激發(fā)子功能，能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)。具

4、有激發(fā)子功能，能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)。第一節(jié)第一節(jié) 植物病毒的侵染過程植物病毒的侵染過程 及其與致病相關(guān)基因及其與致病相關(guān)基因1.1.植物病毒基因組特征植物病毒基因組特征 以核酸為核心，外被外殼蛋白亞基形成的外殼以核酸為核心，外被外殼蛋白亞基形成的外殼, ,多不具包膜。多不具包膜。 外殼蛋白多為一種，偶爾兩種。外殼蛋白多為一種，偶爾兩種。 如果外面具有包膜，則結(jié)構(gòu)蛋白往往比較復(fù)雜，如植物彈狀如果外面具有包膜，則結(jié)構(gòu)蛋白往往比較復(fù)雜，如植物彈狀病毒有五種結(jié)構(gòu)蛋白；植物呼腸病毒含病毒有五種結(jié)構(gòu)蛋白；植物呼腸病毒含7 7種結(jié)構(gòu)蛋白。種結(jié)構(gòu)蛋白。 植物病毒核酸絕大多數(shù)為（植物病毒核酸絕大多數(shù)為（

5、+ +）ssRNAssRNA，少數(shù)為（，少數(shù)為（- -） ssRNAssRNA 、dsDNAdsDNA（double-stranded ）、）、 ssDNAssDNA、 dsRNAdsRNA。 （1）（）（+）ssRNA的植物病毒基因組主要包括的植物病毒基因組主要包括4種類型：種類型：單分體基因組單分體基因組 整套基因的遺傳信息儲藏在一條核酸分子中。整套基因的遺傳信息儲藏在一條核酸分子中。 例如例如TMV、PXV、PYV、TYMV、SBMV(南方菜豆花葉）等。南方菜豆花葉）等。兩分體基因組兩分體基因組 基因組分布在兩條核酸上，并被分別包裝在兩個顆粒中。如煙草環(huán)斑病基因組分布在兩條核酸上，并被分

6、別包裝在兩個顆粒中。如煙草環(huán)斑病毒毒(TRSV)、石竹環(huán)斑病毒、石竹環(huán)斑病毒(CRSV)和豇豆花葉病毒和豇豆花葉病毒(CPMV)。三分體基因組三分體基因組 整套基因組分布在整套基因組分布在3-4條核酸中，并分裝于三個病毒顆粒中。如條核酸中，并分裝于三個病毒顆粒中。如CMV、AMV(苜蓿）、苜蓿）、BMV（雀麥）和（雀麥）和BSMV（大麥條紋），均有（大麥條紋），均有4條，其中條，其中RNA1包裝在一個顆粒中，包裝在一個顆粒中，RNA2包裝在另一顆粒中，包裝在另一顆粒中，RNA3+RNA4包裝于第三顆包裝于第三顆粒中。粒中。多組分病毒多組分病毒 如絨煙斑駁病毒，離體內(nèi)含線狀和環(huán)狀兩種如絨煙斑駁病

7、毒，離體內(nèi)含線狀和環(huán)狀兩種ssRNA，侵染性要求兩種同時，侵染性要求兩種同時存在。存在。 (2) ssDNA植物病毒植物病毒 最主要的為最主要的為雙生病毒雙生病毒(Geminiviridae)，也稱也稱聯(lián)體病毒，是一類廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱聯(lián)體病毒，是一類廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)植物上的帶地區(qū)植物上的,具有兩個單鏈具有兩個單鏈DNA，分別，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)衣殼，具有孿生顆粒蛋白的單產(chǎn)生蛋白質(zhì)衣殼，具有孿生顆粒蛋白的單鏈鏈ssDNA植物病毒。植物病毒。 該科是植物病毒中惟一具有單鏈DNA的單分體或二分體基因組病毒。病毒包裹單分子或兩分子閉環(huán)狀ssDNA，每分子DNA長2.53.0kb，總基因長約2

8、.55.2kb。病毒復(fù)制是經(jīng)一個雙鏈復(fù)制中間體，通過滾環(huán)復(fù)制，ssDNA合成起始于基因間隔區(qū)的一段保守序列TAATATT/AC，病毒基因雙向轉(zhuǎn)錄，在基因間隔區(qū)具有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。大多數(shù)雙生病毒的增殖部位局限于植物韌皮部組織，在細(xì)胞核中形成病毒粒子聚集體。 典型的雙生病毒為典型的雙生病毒為1830 nm，每個單鏈大小為，每個單鏈大小為2.53.0 knt。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、寄主范圍等根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、寄主范圍等,可分為玉米線條病毒屬可分為玉米線條病毒屬(Mastrevirus)主要侵染禾本科、甜菜曲頂病毒屬主要侵染禾本科、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)、萊豆金黃花葉病毒屬，主要侵染雙子葉萊豆金黃

9、花葉病毒屬，主要侵染雙子葉。 玉米線條病毒屬和甜菜曲頂病毒屬的病毒成員由葉蟬玉米線條病毒屬和甜菜曲頂病毒屬的病毒成員由葉蟬傳播，持久性，但不經(jīng)卵傳染，有單組分基因組；萊豆金傳播，持久性，但不經(jīng)卵傳染，有單組分基因組；萊豆金黃花葉病毒屬的病毒成員由粉虱傳播，含有雙組分基因組。黃花葉病毒屬的病毒成員由粉虱傳播，含有雙組分基因組。 (3) dsDNA病毒病毒雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA，分子量，分子量5106 u，如花椰菜花葉病毒（如花椰菜花葉病毒（CaMV)，。，。 ?？稍诩闹骷?xì)胞內(nèi)堆積，形成內(nèi)含體。?？稍诩闹骷?xì)胞內(nèi)堆積，形成內(nèi)含體。(4) dsRNA病毒病毒 基因組有基因組有1012個片段，每段分子量

10、個片段，每段分子量0.81062.6106例如植物呼腸病毒、三葉草傷瘤病毒和水稻普通矮縮病。例如植物呼腸病毒、三葉草傷瘤病毒和水稻普通矮縮病。（5）（）（-）ssRNA病毒病毒 包括彈狀病毒科，如萵苣壞死黃花病毒、馬鈴薯黃矮病毒。包括彈狀病毒科，如萵苣壞死黃花病毒、馬鈴薯黃矮病毒。該該RNA鏈為非感染性的，沒有與核糖體的連接點(diǎn)，或者翻譯產(chǎn)物無意義。鏈為非感染性的，沒有與核糖體的連接點(diǎn)，或者翻譯產(chǎn)物無意義。以其為模板產(chǎn)生互補(bǔ)的以其為模板產(chǎn)生互補(bǔ)的RNA，起信使，起信使RNA作用。作用。2 2 侵染過程及相關(guān)問題侵染過程及相關(guān)問題（1）傷口侵入，表皮毛通常為侵染位點(diǎn)，外突原生質(zhì)連絲）傷口侵入，表皮

11、毛通常為侵染位點(diǎn)，外突原生質(zhì)連絲可能參與病毒侵入過程?？赡軈⑴c病毒侵入過程。 （2）通過媒介或人工擦傷的細(xì)胞壁來感染）通過媒介或人工擦傷的細(xì)胞壁來感染 （3）病毒侵入寄主細(xì)胞后，存在脫外殼過程，且脫外殼在）病毒侵入寄主細(xì)胞后，存在脫外殼過程，且脫外殼在細(xì)胞的不同地方完成。細(xì)胞的不同地方完成。 3 病毒的復(fù)制病毒的復(fù)制病毒的復(fù)制是很復(fù)雜的問題，不同于真核生物病毒的復(fù)制是很復(fù)雜的問題，不同于真核生物DNA復(fù)制程序。復(fù)制程序。一般一種類型的病毒復(fù)制以同樣的方式進(jìn)行。一般一種類型的病毒復(fù)制以同樣的方式進(jìn)行。（1）ssRNA病毒病毒RNA具有感染性，可起信使具有感染性，可起信使RNA的作用，能翻譯產(chǎn)生蛋

12、白，包括復(fù)制酶。的作用，能翻譯產(chǎn)生蛋白，包括復(fù)制酶。復(fù)制酶首先合成反平行的互補(bǔ)鏈，然后再優(yōu)先復(fù)制合成與原始鏈相同的復(fù)制酶首先合成反平行的互補(bǔ)鏈，然后再優(yōu)先復(fù)制合成與原始鏈相同的RNA序列。序列。（2）dsRNA病毒病毒類似于類似于DNA基因組病毒，不同于單鏈基因組病毒，不同于單鏈RNA病毒，復(fù)制酶是病毒粒體的核心病毒，復(fù)制酶是病毒粒體的核心組成部分，把核酸上的基因復(fù)制成相應(yīng)的信使組成部分，把核酸上的基因復(fù)制成相應(yīng)的信使RNA，再翻譯成蛋白。同時模，再翻譯成蛋白。同時模板板RNA 仍配對保持完整。仍配對保持完整。（3）含）含DNA的病毒的病毒進(jìn)入核內(nèi)形成微染色體進(jìn)入核內(nèi)形成微染色體-轉(zhuǎn)錄成信使轉(zhuǎn)

13、錄成信使RNA-進(jìn)入胞漿進(jìn)入胞漿-翻譯成蛋白并反轉(zhuǎn)翻譯成蛋白并反轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈錄合成負(fù)鏈DNA,-合成正鏈合成正鏈DNA-包裝形成病毒顆粒包裝形成病毒顆粒-轉(zhuǎn)運(yùn)并傳播轉(zhuǎn)運(yùn)并傳播RNA病毒復(fù)制模型病毒復(fù)制模型1.吸附；吸附；2.侵入；侵入；3.脫殼；脫殼；4.初期翻譯初期翻譯RNA多聚酶，合成細(xì)胞代謝的抑制物；多聚酶，合成細(xì)胞代謝的抑制物；5.形成復(fù)制型；形成復(fù)制型；6.形形成復(fù)制中間型；成復(fù)制中間型；7.形成子代形成子代RNA；8.翻譯晚期蛋白質(zhì)翻譯晚期蛋白質(zhì)(合成病毒蛋白質(zhì)合成病毒蛋白質(zhì))；9.子代子代RNA與病毒蛋白質(zhì)與病毒蛋白質(zhì)裝配，形成成熟病毒；裝配，形成成熟病毒；10.釋放釋放(aa表

14、示病毒感染后可見到細(xì)胞核的變形表示病毒感染后可見到細(xì)胞核的變形)DNA病毒復(fù)制模型病毒復(fù)制模型1.吸附；吸附； 2.穿入；穿入； 3.脫殼，脫出的脫殼，脫出的DNA向核內(nèi)移動；向核內(nèi)移動；4.轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA；5.轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄“早期蛋早期蛋白質(zhì)白質(zhì)”；6.復(fù)制子代復(fù)制子代DNA，合成與轉(zhuǎn)錄晚期，合成與轉(zhuǎn)錄晚期mRNA；7.帶有遺傳信息的晚期帶有遺傳信息的晚期mRNA在在細(xì)胞質(zhì)中移動并翻譯病毒蛋白質(zhì)；細(xì)胞質(zhì)中移動并翻譯病毒蛋白質(zhì)； 8.合成的病毒蛋白質(zhì)向核內(nèi)移動；合成的病毒蛋白質(zhì)向核內(nèi)移動； 9.病毒病毒DNA和和蛋白質(zhì)裝配形成成熟病毒粒子；蛋白質(zhì)裝配形成成熟病毒粒子；10.細(xì)胞崩解，病毒釋放細(xì)胞崩

15、解，病毒釋放 4 病毒蛋白的合成病毒蛋白的合成 通常是利用寄主核糖體系統(tǒng)，翻譯病毒專一的通常是利用寄主核糖體系統(tǒng)，翻譯病毒專一的RNA（基因組或轉(zhuǎn)錄（基因組或轉(zhuǎn)錄得到的信使得到的信使RNA),并且基本上都是利用寄主細(xì)胞質(zhì)核糖體，受放線菌酮并且基本上都是利用寄主細(xì)胞質(zhì)核糖體，受放線菌酮抑制。抑制。 5 病毒在植物中的移動和積累病毒在植物中的移動和積累(1)病毒的移動病毒的移動 通過胞間連絲在細(xì)胞間移動，通過維管系統(tǒng)從不同組之間轉(zhuǎn)移，但與通過胞間連絲在細(xì)胞間移動，通過維管系統(tǒng)從不同組之間轉(zhuǎn)移，但與CP蛋白和運(yùn)動蛋白有關(guān)。蛋白和運(yùn)動蛋白有關(guān)。 (2)病毒的積累病毒的積累 不同病毒在植物中可達(dá)的濃度極

16、不相同，并且和寄主植物種類、生長階不同病毒在植物中可達(dá)的濃度極不相同，并且和寄主植物種類、生長階段、組織部位有關(guān)，同時受溫度等環(huán)境條件影響。段、組織部位有關(guān)，同時受溫度等環(huán)境條件影響。 病毒可以分散在細(xì)胞質(zhì)或者以多種形式聚集。例如各種內(nèi)含體主要是由病毒可以分散在細(xì)胞質(zhì)或者以多種形式聚集。例如各種內(nèi)含體主要是由病毒粒體組成。病毒粒體組成。6 6 植物病毒致病相關(guān)基因植物病毒致病相關(guān)基因6.1 6.1 外殼蛋白基因外殼蛋白基因（coat protein gene） 外殼蛋白對病毒外殼蛋白對病毒RNA具有保護(hù)作用，防止病毒具有保護(hù)作用，防止病毒核酸被細(xì)胞內(nèi)酶降解。核酸被細(xì)胞內(nèi)酶降解。 外殼蛋白不僅是

17、病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，同時協(xié)外殼蛋白不僅是病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，同時協(xié)同介導(dǎo)病毒的長距離運(yùn)動。同介導(dǎo)病毒的長距離運(yùn)動。 會大大提高感染效率和發(fā)病程度。會大大提高感染效率和發(fā)病程度。有時在非寄主植物和抗性寄主上起無毒基因作用。有時在非寄主植物和抗性寄主上起無毒基因作用。并且并且CP基因可介導(dǎo)植物抗病性?；蚩山閷?dǎo)植物抗病性。 R.Beachy(1986)首次將首次將TMV 的的CP基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出穩(wěn)定遺基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出穩(wěn)定遺傳的抗病毒工程植物以來，已經(jīng)克隆了至少傳的抗病毒工程植物以來，已經(jīng)克隆了至少15個病毒組中個病毒組中30種病毒種病毒的的CP基因，并成功轉(zhuǎn)化了基因，并成功轉(zhuǎn)化了20多種植

18、物，其中一些植株已經(jīng)進(jìn)入田間多種植物，其中一些植株已經(jīng)進(jìn)入田間試驗(yàn)。試驗(yàn)。 CP基因的抗性機(jī)理基因的抗性機(jī)理：（：（1）抑制病毒脫殼。（）抑制病毒脫殼。（2）干擾病毒的復(fù)）干擾病毒的復(fù)制。（制。（3）限制病毒粒子的擴(kuò)展與運(yùn)轉(zhuǎn)。（）限制病毒粒子的擴(kuò)展與運(yùn)轉(zhuǎn)。（4）CP基因所表達(dá)的基因所表達(dá)的mRNA與侵入病毒與侵入病毒RNA之間相互作用之間相互作用（RNA介導(dǎo)的病毒抗性介導(dǎo)的病毒抗性）。）。 存在的問題存在的問題（1）多表現(xiàn)為延遲發(fā)病和降低發(fā)病嚴(yán)重度，免疫類）多表現(xiàn)為延遲發(fā)病和降低發(fā)病嚴(yán)重度，免疫類型和高抗類型較少。（型和高抗類型較少。（2）具有潛在危險性。）具有潛在危險性。6.2 6.2 復(fù)制

19、酶基因復(fù)制酶基因（replicase gene） 病毒編碼的復(fù)制酶蛋白存在多個保守序列，其中病毒編碼的復(fù)制酶蛋白存在多個保守序列，其中一個是存在于所有一個是存在于所有RNA聚合酶中的聚合酶中的Gly-Asp-Asp（天（天門冬）門冬）三肽基元序列（三肽基元序列（GDD motif）, ,對維持聚合酶對維持聚合酶活性必不可少。另一個保守序列是三磷酸核苷酸結(jié)合活性必不可少。另一個保守序列是三磷酸核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域（NTP binding domain），在病毒復(fù)制時的解），在病毒復(fù)制時的解螺旋過程中起重要作用。螺旋過程中起重要作用。 Zaitlin et al(1990)將將TMV的的54K

20、D蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得抗性煙草蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草并獲得抗性煙草后，國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了此類由病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因介導(dǎo)的植物對病毒后，國內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了此類由病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因介導(dǎo)的植物對病毒的抗性。的抗性。 復(fù)制酶介導(dǎo)抗性的特點(diǎn)：復(fù)制酶介導(dǎo)抗性的特點(diǎn)： （1）對完整病毒粒子和裸露病毒對完整病毒粒子和裸露病毒RNA均具有高度抗性。均具有高度抗性。 （2）抗性水平與整合到染色體上的基因拷貝數(shù)無關(guān)?？剐运脚c整合到染色體上的基因拷貝數(shù)無關(guān)。 （3）抗性持續(xù)時間長，并對高溫（抗性持續(xù)時間長，并對高溫（31）不敏感。）不敏感。 （4）具有明顯的株專化性。具有明顯的株?；?。 抗性機(jī)理：抗性機(jī)理： （1 1）在蛋

21、白質(zhì)水平上，復(fù)制酶蛋白在病毒的侵染過在蛋白質(zhì)水平上，復(fù)制酶蛋白在病毒的侵染過程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮正常功能，從而打破了病毒正程中作為一種調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮正常功能，從而打破了病毒正鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡或干擾了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制鏈和負(fù)鏈復(fù)制的平衡或干擾了控制復(fù)制酶活性的反饋抑制途徑。途徑。 （2 2）在在RNARNA水平上，轉(zhuǎn)錄出的水平上，轉(zhuǎn)錄出的mRNA與病毒的復(fù)制酶與病毒的復(fù)制酶進(jìn)行了無效結(jié)合而抑制其正常功能，或者是進(jìn)行了無效結(jié)合而抑制其正常功能，或者是mRNA誘導(dǎo)了誘導(dǎo)了植物的自然抗性。植物的自然抗性。 缺損型復(fù)制酶基因也可以介導(dǎo)抗性缺損型復(fù)制酶基因也可以介導(dǎo)抗性。T.M.Anderson

22、 et al (1992)將將TMV Fny株系的株系的RNARNA內(nèi)部缺失內(nèi)部缺失94個核苷酸后個核苷酸后導(dǎo)入煙草，結(jié)果，缺失造成導(dǎo)入煙草，結(jié)果，缺失造成ORF的移碼，其翻譯產(chǎn)物只的移碼，其翻譯產(chǎn)物只有完整的有完整的97KD蛋白的蛋白的75左右，但仍然表達(dá)對左右，但仍然表達(dá)對CMV的高的高度抗性。度抗性。6.3 6.3 運(yùn)動蛋白基因運(yùn)動蛋白基因（movement protein gene） 病毒基因編碼的基因產(chǎn)物病毒基因編碼的基因產(chǎn)物MP能與胞間連絲能與胞間連絲結(jié)合，使胞間連絲可以通過物質(zhì)的孔徑增大，以結(jié)合，使胞間連絲可以通過物質(zhì)的孔徑增大，以允許病毒粒子或基因組核酸進(jìn)入鄰近細(xì)胞中，從允許病

23、毒粒子或基因組核酸進(jìn)入鄰近細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動。而實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動。 研究證明，完整的研究證明，完整的TMV的的MP基因表達(dá)并不能介導(dǎo)抗性基因表達(dá)并不能介導(dǎo)抗性的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。M. Lapidot et al(1993) & SI Malyshenko et al（1993）將）將TMV的缺陷型的缺陷型MP（dMP）基因轉(zhuǎn)入煙草）基因轉(zhuǎn)入煙草后能獲得抗后能獲得抗TMV植株，進(jìn)一步研究表明，轉(zhuǎn)植株，進(jìn)一步研究表明，轉(zhuǎn)dMP基因的基因的煙草不僅對煙草不僅對TMV，還對其他病毒如，還對其他病毒如CMV、BMV等具有等具有不同程度的抗性。由此可見，各種病毒不同程度的抗性。由

24、此可見，各種病毒MP之間雖然缺之間雖然缺乏同源性，但具有相同的功能。乏同源性，但具有相同的功能。 抗性機(jī)制：由于缺陷型抗性機(jī)制：由于缺陷型MP與野生型與野生型MP競爭胞間連競爭胞間連絲上的結(jié)合位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。絲上的結(jié)合位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的。6.4 6.4 衛(wèi)星病毒衛(wèi)星病毒（satellite RNA ） 某些病毒除基因組外，還伴有一些小片段某些病毒除基因組外，還伴有一些小片段RNA，它們本身并沒有編碼外殼蛋白的遺傳信息，它們本身并沒有編碼外殼蛋白的遺傳信息，稱為衛(wèi)星稱為衛(wèi)星RNA。攜帶衛(wèi)星。攜帶衛(wèi)星RNA的病毒稱為輔助病的病毒稱為輔助病毒。迄今已報(bào)道有毒。迄今已報(bào)道有6組共組共26種植物病毒帶有衛(wèi)星種植

25、物病毒帶有衛(wèi)星RNA。 衛(wèi)星衛(wèi)星RNA對植物病毒的影響有對植物病毒的影響有3種表現(xiàn)：種表現(xiàn)：1986年，年，Baulcombe等首次將等首次將CMV的的sat RNA 克隆轉(zhuǎn)入煙草，克隆轉(zhuǎn)入煙草，獲得了抗獲得了抗CMV的基因工程植株。的基因工程植株。 衛(wèi)星衛(wèi)星RNA與病毒基因組爭奪病毒復(fù)制酶。由于衛(wèi)星與病毒基因組爭奪病毒復(fù)制酶。由于衛(wèi)星 RNA能更有效地占據(jù)能更有效地占據(jù)RNA復(fù)制酶，而且其分子小、復(fù)制酶，而且其分子小、復(fù)制周期短，因此，隨著復(fù)制循環(huán)的增加，復(fù)制周期短，因此，隨著復(fù)制循環(huán)的增加， sat RNA的復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組的復(fù)制量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組RNA復(fù)制量，最終是病毒基復(fù)制量，最終是

26、病毒基因組的復(fù)制受阻。因組的復(fù)制受阻。 雖然衛(wèi)星雖然衛(wèi)星RNA只需低水平表達(dá)，不產(chǎn)生異源蛋只需低水平表達(dá)，不產(chǎn)生異源蛋白，但這種抗性僅在侵染晚期發(fā)揮作用，白，但這種抗性僅在侵染晚期發(fā)揮作用，而且轉(zhuǎn)基因而且轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)減輕癥狀的衛(wèi)星植物體內(nèi)減輕癥狀的衛(wèi)星RNA有可能突變成加重癥狀有可能突變成加重癥狀的衛(wèi)星的衛(wèi)星RNA，因此具有一定的潛在危險性。，因此具有一定的潛在危險性。6.5 6.5 核酶基因核酶基因（ribozyme gene） 核酶是一類具有特殊二級結(jié)構(gòu)、能特異性催化切核酶是一類具有特殊二級結(jié)構(gòu)、能特異性催化切割自身及其它割自身及其它RNA分子的小分子分子的小分子RNA。廣泛存在于。廣泛

27、存在于一些類病毒和病毒衛(wèi)星一些類病毒和病毒衛(wèi)星RNA序列中。序列中。 根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)可分為錘頭型和發(fā)夾型，其中錘根據(jù)核酶的結(jié)構(gòu)可分為錘頭型和發(fā)夾型，其中錘頭型核酶較為普遍。人們可根據(jù)核酶可切割任何生頭型核酶較為普遍。人們可根據(jù)核酶可切割任何生物的物的RNA，而且對底物作用位點(diǎn)的堿基序列要求不，而且對底物作用位點(diǎn)的堿基序列要求不嚴(yán)格這一特性，設(shè)計(jì)出切割已知序列的病原性嚴(yán)格這一特性，設(shè)計(jì)出切割已知序列的病原性RNA人工核酶。人工核酶。 目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功目前，人工核酶在植物抗病毒方面，也成功地在體外合成了能切割馬鈴薯紡錘塊莖類病毒地在體外合成了能切割馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PST

28、V）等的基因組）等的基因組RNA的核酶、能切割蘋果的核酶、能切割蘋果銹果類病毒的核酶等，但是，在轉(zhuǎn)基因植物水平銹果類病毒的核酶等，但是，在轉(zhuǎn)基因植物水平上的進(jìn)展緩慢。體內(nèi)表達(dá)不如體外表達(dá)有效。上的進(jìn)展緩慢。體內(nèi)表達(dá)不如體外表達(dá)有效。 該方法也存在潛在危險性，即核酶可能將細(xì)該方法也存在潛在危險性，即核酶可能將細(xì)胞胞RNA作為靶作為靶RNA切割而破壞細(xì)胞正常功能。切割而破壞細(xì)胞正常功能。6.6 蚜傳因子蚜傳因子 也稱輔助因子也稱輔助因子(Helper component, 簡稱簡稱HC)：在蚜蟲傳：在蚜蟲傳播的非持久病毒的寄主細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有一種病毒編碼的蛋播的非持久病毒的寄主細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有一種病毒

29、編碼的蛋白（白（HC-Pro)與傳毒有關(guān)，如除去它，蚜蟲也就失去傳毒與傳毒有關(guān)，如除去它，蚜蟲也就失去傳毒能力，這種輔助因子被稱為蚜傳因子。能力，這種輔助因子被稱為蚜傳因子。 最早在馬鈴薯最早在馬鈴薯Y病毒侵然的植物中發(fā)現(xiàn)，具有協(xié)生作用，病毒侵然的植物中發(fā)現(xiàn)，具有協(xié)生作用，并幫助長距離運(yùn)輸。但輔助因子的作用方式尚未完全明確并幫助長距離運(yùn)輸。但輔助因子的作用方式尚未完全明確。7.TMV基因組及其編碼蛋白的功能基因組及其編碼蛋白的功能煙草花葉病毒（煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）屬于煙草花葉?。儆跓煵莼ㄈ~病毒屬。該屬基因組編碼四種蛋白，大小分別為毒屬。該屬基因組編碼四

30、種蛋白，大小分別為126kD、183kD、30kD和和17.5kD. 其中其中126kD和和183kD蛋白參與病毒的復(fù)制，稱為蛋白參與病毒的復(fù)制，稱為RNA依賴的依賴的RNA聚合酶（聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRP）的亞基；）的亞基；183kD的蛋白是的蛋白是126kD蛋白的閱讀框終止子通讀的產(chǎn)物。蛋白的閱讀框終止子通讀的產(chǎn)物。30kD蛋白參與病毒在寄主細(xì)胞間的移動，稱為運(yùn)動蛋白蛋白參與病毒在寄主細(xì)胞間的移動，稱為運(yùn)動蛋白（Movementpro2tein，MP）。）。 17.5kD的蛋白為病毒的外殼蛋白（的蛋白為病毒的外殼蛋白（Capsidprotein，

31、CP）。）。31041.261051.831055.41041.75104TMV基因組結(jié)構(gòu)示意圖基因組結(jié)構(gòu)示意圖5運(yùn)動蛋白3CP蛋白復(fù)制酶涉及RNA復(fù)制 7.1126kD/183kD蛋白煙草花葉病毒通過機(jī)械傷口或者借助媒介昆蟲進(jìn)入細(xì)胞煙草花葉病毒通過機(jī)械傷口或者借助媒介昆蟲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在病毒顆粒部分脫殼露出基因內(nèi)，在病毒顆粒部分脫殼露出基因RNA的的5端時即侵染后端時即侵染后1-10分鐘內(nèi)，翻譯開始首先合成分鐘內(nèi)，翻譯開始首先合成126KDa和和183KDa的兩種蛋的兩種蛋白質(zhì)。白質(zhì)。183KDa是由是由126KDa基通讀而產(chǎn)生，基通讀而產(chǎn)生，Tyr插在這個琥插在這個琥珀型終止子上，有珀型終止

32、子上，有6個保守的核苷酸。個保守的核苷酸。兩種蛋白功能兩種蛋白功能煙草花葉病毒復(fù)制所需依賴煙草花葉病毒復(fù)制所需依賴RNA的聚合酶由兩部分組成：的聚合酶由兩部分組成：一是由寄主提供的亞基，一是由病毒編碼的特異的復(fù)制酶亞一是由寄主提供的亞基，一是由病毒編碼的特異的復(fù)制酶亞基組合成有專一性的全酶?；M合成有專一性的全酶。2183KDa有有RNA依賴的依賴的RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)，聚合酶的結(jié)構(gòu)，126KDa的的C端有類似于螺旋酶和甲基轉(zhuǎn)移端有類似于螺旋酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的基本結(jié)構(gòu)。所以，這兩種蛋白質(zhì)在酶的基本結(jié)構(gòu)。所以，這兩種蛋白質(zhì)在TMVRNA的復(fù)制過的復(fù)制過程中起重要的作用。程中起重要的作用。 7.2運(yùn)動

33、蛋白（運(yùn)動蛋白（MP） 運(yùn)動蛋白（運(yùn)動蛋白（MP）是）是TMV的運(yùn)動蛋白質(zhì)，在整個的運(yùn)動蛋白質(zhì)，在整個TMV的的表達(dá)蛋白質(zhì)中比例很小。運(yùn)動蛋白是在病毒復(fù)制過程中形成表達(dá)蛋白質(zhì)中比例很小。運(yùn)動蛋白是在病毒復(fù)制過程中形成的。的。 以以TMV + RNA為模板的為模板的3-端開始復(fù)制合成全長的（端開始復(fù)制合成全長的（-）RNA，形成雙鏈，稱復(fù)制型，形成雙鏈，稱復(fù)制型RNA（replicative，RF型）。在型）。在感病細(xì)胞與膜相連的病毒合成中除發(fā)現(xiàn)感病細(xì)胞與膜相連的病毒合成中除發(fā)現(xiàn)RF型外，也發(fā)現(xiàn)有以型外，也發(fā)現(xiàn)有以（）RNA為模板同時合成多達(dá)為模板同時合成多達(dá)56條的（條的（+）RNA，稱為，稱

34、為復(fù)制中間型（復(fù)制中間型（replicativeintermediate，RI型）。型）。 這些（這些（+）RNA的出路有三：一是被外殼蛋白包裝形成子的出路有三：一是被外殼蛋白包裝形成子代病毒顆粒；二是進(jìn)一步作為模板形成代病毒顆粒；二是進(jìn)一步作為模板形成RFRI；三是做；三是做mRNA，而，而1.5Kb和和0.7kb分別翻譯為分別翻譯為30KDa和外殼蛋白。和外殼蛋白。運(yùn)動蛋白的功能煙草花葉病運(yùn)動蛋白的基因全長為煙草花葉病運(yùn)動蛋白的基因全長為807bp. TMV的運(yùn)動蛋白（的運(yùn)動蛋白（30KDa）與與TMV在植株體內(nèi)擴(kuò)散密切相關(guān)，主要功能是介導(dǎo)在植株體內(nèi)擴(kuò)散密切相關(guān)，主要功能是介導(dǎo)TMV在臨近

35、細(xì)胞間在臨近細(xì)胞間的運(yùn)動（的運(yùn)動（Cell-to-cell movement），且），且MP的功能是高度保守的。研的功能是高度保守的。研究表明究表明MP定位于胞間連絲（定位于胞間連絲（Plasmodesma），可能與細(xì)胞骨架的某），可能與細(xì)胞骨架的某些因子形成一種核孔復(fù)合物，有利于轉(zhuǎn)運(yùn)些因子形成一種核孔復(fù)合物，有利于轉(zhuǎn)運(yùn)TMV基因組通過植株的維管基因組通過植株的維管系統(tǒng)，侵染整個植株。系統(tǒng)，侵染整個植株。 而而30KDa蛋白質(zhì)與新合成的子代病毒蛋白質(zhì)與新合成的子代病毒RNA結(jié)合產(chǎn)生有兩個重要影結(jié)合產(chǎn)生有兩個重要影響：一是使響：一是使TMA-RNA不折疊而成舒展的線性；二是使胞間連絲改變構(gòu)不折疊

36、而成舒展的線性；二是使胞間連絲改變構(gòu)型，通道變寬，型，通道變寬，30KDa蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-RNA復(fù)制物可魚貫通過。因此，復(fù)制物可魚貫通過。因此，30KDa蛋白質(zhì)較早地以亞基因組形成被表達(dá)，有助于病毒在體內(nèi)的擴(kuò)展和增蛋白質(zhì)較早地以亞基因組形成被表達(dá)，有助于病毒在體內(nèi)的擴(kuò)展和增殖。殖。3外殼蛋白（外殼蛋白（CP）TMV的外殼蛋白有的外殼蛋白有156161個氨基酸，共有個氨基酸，共有2130個個亞基，亞基右螺旋排列。外殼蛋白質(zhì)在侵染細(xì)胞中表達(dá)量亞基，亞基右螺旋排列。外殼蛋白質(zhì)在侵染細(xì)胞中表達(dá)量是最大的，占整個細(xì)胞總蛋白質(zhì)的是最大的，占整個細(xì)胞總蛋白質(zhì)的10%. 復(fù)制過程種，形復(fù)制過程種，形成的部分（成

37、的部分（+）RNAmRNA，而，而0.7kb翻譯為外殼蛋白。外翻譯為外殼蛋白。外殼蛋白對殼蛋白對TMVRNA具有保護(hù)作用。外殼蛋白不僅是病毒粒具有保護(hù)作用。外殼蛋白不僅是病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，同時協(xié)同介導(dǎo)病毒的長距離運(yùn)動。子的結(jié)構(gòu)亞基，同時協(xié)同介導(dǎo)病毒的長距離運(yùn)動。TMV在在植物體內(nèi)的移動必須以外殼蛋白聚集體的形成為前提。植物體內(nèi)的移動必須以外殼蛋白聚集體的形成為前提。 8 花椰菜花葉病毒（花椰菜花葉病毒（CaMV）基因組）基因組病毒粒子為二十面體對稱病毒粒子為二十面體對稱(T=7)(T=7)，直徑為，直徑為54nm54nm，其外殼由，其外殼由420420個蛋個蛋白亞基組成，該病毒在自然條件下通

38、過蚜蟲以非持久性方式進(jìn)行傳播，白亞基組成，該病毒在自然條件下通過蚜蟲以非持久性方式進(jìn)行傳播，侵染十字花科植物，但不在蚜蟲體內(nèi)增殖。侵染十字花科植物，但不在蚜蟲體內(nèi)增殖。 CaMVCaMV基因組基因組 dsDNAdsDNA呈環(huán)狀，大小約為呈環(huán)狀，大小約為8kb8kb，含有，含有 8 8個個ORFsORFs，其中，其中為主要為主要ORFsORFs，和和為兩個附加為兩個附加ORFsORFs，在，在和和之間還有一個大之間還有一個大的基因間隔區(qū)的基因間隔區(qū)(intergenic(intergenic region) region)，雙鏈，雙鏈DNADNA上有上有3 3個缺刻，個缺刻，1 1個個( (1)

39、1)在負(fù)鏈在負(fù)鏈(鏈鏈) )上，另外上，另外2 2個個( (2 2 和和3)3)在正鏈在正鏈(1(1和和22鏈鏈) )上。除了上。除了第第基因外，其余的基因外，其余的7 7個基因相距很近，甚至有部分重疊個基因相距很近，甚至有部分重疊( (如下圖如下圖) )。蚜傳因子蚜傳因子外殼蛋白外殼蛋白反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)含體蛋白內(nèi)含體蛋白與復(fù)制有關(guān)蛋白與復(fù)制有關(guān)蛋白運(yùn)動蛋白運(yùn)動蛋白(二二)花椰菜花葉病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制花椰菜花葉病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制 當(dāng)當(dāng)CaMV病毒粒子侵人細(xì)胞后，首先在細(xì)胞質(zhì)中脫去病毒粒子侵人細(xì)胞后，首先在細(xì)胞質(zhì)中脫去外殼，然后病毒基因組外殼，然后病毒基因組dsDNA進(jìn)人細(xì)胞核內(nèi)，并且在核內(nèi)進(jìn)人細(xì)

40、胞核內(nèi)，并且在核內(nèi)其基因組其基因組dsDNA的重疊區(qū)核苷酸被去除，缺刻經(jīng)過共價結(jié)的重疊區(qū)核苷酸被去除，缺刻經(jīng)過共價結(jié)合形成完整的閉環(huán)合形成完整的閉環(huán)dsDNA，這一閉環(huán)，這一閉環(huán)dsDNA再與寄主組再與寄主組蛋白結(jié)合生成一個微型染色體蛋白結(jié)合生成一個微型染色體(minichromosome)，最后，最后病毒微型染色體在宿主細(xì)胞病毒微型染色體在宿主細(xì)胞RNA聚合酶的催化下，以一條聚合酶的催化下，以一條負(fù)鏈負(fù)鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄生成為模板轉(zhuǎn)錄生成2個多聚腺苷酸化的個多聚腺苷酸化的 RNA分子，分子，即即 35S RNA和和 19SRNA (如下圖如下圖)。9.黃瓜花葉病毒黃瓜花葉病毒 （CMV) 病

41、毒粒子為二十面體對稱病毒粒子為二十面體對稱(T3)，直徑，直徑 26nm，由，由180個外殼蛋白亞基構(gòu)成，個外殼蛋白亞基構(gòu)成，在病毒懸液中，在病毒懸液中，PH、二價陽離子都會使病毒粒子的直徑和構(gòu)型產(chǎn)生可逆性的、二價陽離子都會使病毒粒子的直徑和構(gòu)型產(chǎn)生可逆性的變化。變化。BMV基因組有基因組有3個個RNA組分，即組分，即RNA1(3.2kb)，RNA2(2.5kb)和和RNA3(2.1kb)，每個，每個RNA組分的組分的5端有帽子結(jié)構(gòu)，端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有端有 Trna樣結(jié)構(gòu)，并帶有樣結(jié)構(gòu)，并帶有假結(jié)假結(jié)(pseudoknot)，能接受酪氨酸，能接受酪氨酸(Tyr)。 RNA1編碼單一的蛋白質(zhì)，

42、分子量為編碼單一的蛋白質(zhì)，分子量為l09kD，位于，位于N末端和末端和C末端的氨基酸末端的氨基酸基序分別類似于甲基轉(zhuǎn)移酶和解旋酶；基序分別類似于甲基轉(zhuǎn)移酶和解旋酶； RNA2單一單一ORF翻譯合成翻譯合成94kD蛋白，蛋白產(chǎn)物有聚合酶樣的區(qū)域，這兩種蛋蛋白，蛋白產(chǎn)物有聚合酶樣的區(qū)域，這兩種蛋白質(zhì)與病毒基因組白質(zhì)與病毒基因組RNA復(fù)制密切相關(guān)；復(fù)制密切相關(guān)； RNA3有有2個個ORF，一個，一個ORF編碼編碼32kD蛋白，它影響病毒的宿主嗜親性和介蛋白，它影響病毒的宿主嗜親性和介導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間運(yùn)動，另一個導(dǎo)病毒在細(xì)胞之間運(yùn)動，另一個ORF編碼編碼20kD外殼蛋白。外殼蛋白。 第二節(jié)第二節(jié) 植物

43、病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因植物病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因（一）植物細(xì)菌基因組的特點(diǎn)（一）植物細(xì)菌基因組的特點(diǎn) 同于一般原核生物基因組，包括染色體基因組和質(zhì)同于一般原核生物基因組，包括染色體基因組和質(zhì)?；蚪M兩部分?；蚪M兩部分。 染色體是一個高度折疊的環(huán)狀染色體是一個高度折疊的環(huán)狀DNA大分子，大小約為大分子，大小約為3106 5106bp，可攜帶，可攜帶500基因。游離于染色體的基因。游離于染色體的一定區(qū)域，沒有包膜包被一定區(qū)域，沒有包膜包被。 質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外基因組，也是環(huán)狀質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外基因組，也是環(huán)狀DNA分子，并能獨(dú)分子，并能獨(dú)立復(fù)制。立復(fù)制。DNA分子量在分子量在106 u 108

44、u，所攜帶基因比染，所攜帶基因比染色體少。但一般每個細(xì)菌菌體內(nèi)包含色體少。但一般每個細(xì)菌菌體內(nèi)包含1多個質(zhì)粒多個質(zhì)粒。 1 基因克隆的策略和研究方法基因克隆的策略和研究方法 1.1 基因克隆策略基因克隆策略 由里及表的研究途徑，創(chuàng)建突變體由里及表的研究途徑，創(chuàng)建突變體-通過基因標(biāo)記和互通過基因標(biāo)記和互補(bǔ)法獲得基因，再推斷其產(chǎn)物，并證明其致病。補(bǔ)法獲得基因，再推斷其產(chǎn)物，并證明其致病。 （1）方法導(dǎo)向）方法導(dǎo)向 （2）概念導(dǎo)向）概念導(dǎo)向 （3）異源基因克隆法）異源基因克隆法 1.2 突變誘變方法突變誘變方法 1.2.1 物理誘變物理誘變 1.2.2 化學(xué)誘變化學(xué)誘變 1.2.3 轉(zhuǎn)座子誘變轉(zhuǎn)座子

45、誘變突變方法突變方法 1.1.物理誘變物理誘變 紫外線（紫外線（UVUV）、）、X X射線和射線和射線誘變；射線誘變；離子束誘變，離子束是元素的離子經(jīng)高能加速器加速后獲得的放射線；中子 2.2.化學(xué)誘變化學(xué)誘變 化學(xué)誘變劑：堿基類似物、亞硝酸如亞硝基胍(NTG）、丫定橙染料、烷化劑如甲基磺酸乙脂（EMS）等 3.3.轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變物理和化學(xué)誘變獲得的突變體轉(zhuǎn)座子插入突轉(zhuǎn)座子插入突變變轉(zhuǎn)座子誘變致病性測定，獲得致病性發(fā)生變化的突變體獲得相應(yīng)的突變體以轉(zhuǎn)座子的側(cè)端序列為探針進(jìn)行Southern雜交，確定轉(zhuǎn)座子插入的拷貝數(shù)，明確突變表型是由于轉(zhuǎn)座子的插入引起得突變體的遺傳穩(wěn)定性分析 1

46、.3 1.3 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建 將細(xì)菌的基因組切成許多片段，分別連到載體將細(xì)菌的基因組切成許多片段，分別連到載體上，構(gòu)建一個能攜帶該菌所有基因信息的克隆庫。上，構(gòu)建一個能攜帶該菌所有基因信息的克隆庫。 構(gòu)建基因文庫常用的載體有質(zhì)粒（構(gòu)建基因文庫常用的載體有質(zhì)粒（plasmid）、黏粒）、黏粒（cosmid）和）和 噬菌體噬菌體(phase (phase ) )。適用于作基因克隆的。適用于作基因克隆的質(zhì)粒載體必須具備質(zhì)粒載體必須具備3 3個共同的組成部分，即復(fù)制因子、選個共同的組成部分，即復(fù)制因子、選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。 理想基因文庫應(yīng)具備的條件：理想基因文庫應(yīng)具備的

47、條件：（1）以一種穩(wěn)定的形式含有基因組以一種穩(wěn)定的形式含有基因組DNA的序列。的序列。（2）克隆總數(shù)不宜過大?？寺】倲?shù)不宜過大。（3）文庫的克隆片段大小必須足夠包含一個完整的基因。文庫的克隆片段大小必須足夠包含一個完整的基因。（4）克隆片段大小適應(yīng)于載體的容納能力，便于進(jìn)行酶切圖譜分析?？寺∑未笮∵m應(yīng)于載體的容納能力，便于進(jìn)行酶切圖譜分析。（5）應(yīng)從少量的起始材料進(jìn)行構(gòu)建并易于篩選理想的片段。應(yīng)從少量的起始材料進(jìn)行構(gòu)建并易于篩選理想的片段。（6）克隆片段之間需要有部分片段重疊以利于克隆片段之間需要有部分片段重疊以利于chromosome walking。（7）克隆片段應(yīng)易于從載體上切下而不帶

48、有任何載體序列。克隆片段應(yīng)易于從載體上切下而不帶有任何載體序列。（8）文庫應(yīng)能在克隆不損失的情況下得到擴(kuò)增，而且能長期保存。文庫應(yīng)能在克隆不損失的情況下得到擴(kuò)增，而且能長期保存。細(xì)菌文庫構(gòu)建常用載體 1質(zhì)粒載體 如PBR322PUC系列 （2）噬菌體載體 包括插入型和替代型兩種 一般可容納15-23Kb的外源DNA片段 （3）柯氏質(zhì)粒載體 又稱粘性質(zhì)粒（cosmid),是由噬菌體的cos片段和質(zhì)粒復(fù)制子組成。 能自主復(fù)制，可容納大約45Kb的DNA片段。1.4 1.4 基因克隆基因克隆1.4.11.4.1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子表簽法表簽法1.4.2 1.4.2 鳥槍法鳥槍法 在已獲得標(biāo)記基因突變體和基因

49、文庫的基礎(chǔ)上進(jìn)行，在已獲得標(biāo)記基因突變體和基因文庫的基礎(chǔ)上進(jìn)行，用基因庫互補(bǔ)突變體篩選使圖變體表型恢復(fù)的克隆。該克用基因庫互補(bǔ)突變體篩選使圖變體表型恢復(fù)的克隆。該克隆含有目的基因功能片段的序列，并將此克隆轉(zhuǎn)移到隆含有目的基因功能片段的序列，并將此克隆轉(zhuǎn)移到E.coli中得到純系克隆，在與突變體互補(bǔ)進(jìn)行驗(yàn)證。中得到純系克隆，在與突變體互補(bǔ)進(jìn)行驗(yàn)證。1.4.3 1.4.3 基因功能互補(bǔ)法基因功能互補(bǔ)法 常用來克隆控制寄主范圍的基因如無毒基因。常用來克隆控制寄主范圍的基因如無毒基因。 1.5 1.5 克隆片段的亞克隆分析克隆片段的亞克隆分析2 2 與病理過程有關(guān)的基因與病理過程有關(guān)的基因 植物病原菌

50、的侵染過程一般包括趨化性、吸附、定植物病原菌的侵染過程一般包括趨化性、吸附、定植和侵入。植和侵入。 已鑒定出土壤農(nóng)桿菌的一條染色體基因已鑒定出土壤農(nóng)桿菌的一條染色體基因chvE與其細(xì)與其細(xì)菌的趨化性有關(guān)，此外，該細(xì)菌染色體上的菌的趨化性有關(guān)，此外，該細(xì)菌染色體上的picA基因還基因還影響細(xì)菌的聚集而與毒性有關(guān)。影響細(xì)菌的聚集而與毒性有關(guān)。 A.Kelman等用轉(zhuǎn)座子誘變方法獲得了青枯假單胞菌等用轉(zhuǎn)座子誘變方法獲得了青枯假單胞菌類似多型性表型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，并在分子水平上進(jìn)行了研類似多型性表型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象，并在分子水平上進(jìn)行了研究，該基因?yàn)榫?，該基因?yàn)閜hcA.2.1 與病原菌侵染有關(guān)的基因與病原菌侵

51、染有關(guān)的基因 2.2 決定顯癥的基因決定顯癥的基因 植物病原細(xì)菌的癥狀類型與其致病生化因子有密切關(guān)植物病原細(xì)菌的癥狀類型與其致病生化因子有密切關(guān)系。如細(xì)胞降解酶與組織浸離癥狀有關(guān)；產(chǎn)生壞死癥狀的系。如細(xì)胞降解酶與組織浸離癥狀有關(guān)；產(chǎn)生壞死癥狀的病菌如丁香假單胞引起的各種葉斑病都涉及到毒素的作用；病菌如丁香假單胞引起的各種葉斑病都涉及到毒素的作用；毒素和多糖還和植物萎蔫癥狀有關(guān)。有關(guān)這些基因的克隆、毒素和多糖還和植物萎蔫癥狀有關(guān)。有關(guān)這些基因的克隆、結(jié)構(gòu)鑒定和功能分析早已展開并取得很大進(jìn)展。結(jié)構(gòu)鑒定和功能分析早已展開并取得很大進(jìn)展。 ? 黃單胞菌中一個黃單胞菌中一個800bp的的opsX基因參與

52、基因參與LPS的生物合的生物合成和修飾以及誘導(dǎo)水漬狀反應(yīng)；柑桔黃單胞的成和修飾以及誘導(dǎo)水漬狀反應(yīng)；柑桔黃單胞的pthA基因是基因是引起增生性潰瘍癥狀所必需的。引起增生性潰瘍癥狀所必需的。D.W.Gabriel, et al(1995)2.3 2.3 決定寄主范圍的基因決定寄主范圍的基因2.3.1 2.3.1 正向調(diào)控寄主范圍的基因正向調(diào)控寄主范圍的基因根癌土壤桿菌（根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）青枯假單胞菌（青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）黃單胞菌水稻白葉枯枝病致病變種（黃單胞菌水稻白葉枯枝病致病變種（X. Oxyzae pv

53、. oxyzae）2.3.2 2.3.2 負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因 植物病原細(xì)菌的無毒基因是負(fù)向調(diào)控寄主范圍的植物病原細(xì)菌的無毒基因是負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因，無毒基因直接產(chǎn)物或間接產(chǎn)物作為激發(fā)子與相基因，無毒基因直接產(chǎn)物或間接產(chǎn)物作為激發(fā)子與相應(yīng)抗病基因產(chǎn)物識別誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(dá)，從而表應(yīng)抗病基因產(chǎn)物識別誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(dá)，從而表現(xiàn)小種品種互作的不親和。無毒基因失活或缺乏相現(xiàn)小種品種互作的不親和。無毒基因失活或缺乏相應(yīng)的無毒基因則表現(xiàn)小種品種互作的親和反應(yīng)，所應(yīng)的無毒基因則表現(xiàn)小種品種互作的親和反應(yīng)，所以無毒基因的作用是病原菌小種對不同品種的寄主范以無毒基因的作用是病原

54、菌小種對不同品種的寄主范圍的負(fù)向調(diào)控基因。圍的負(fù)向調(diào)控基因。 此外，負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因也可以表現(xiàn)在不此外，負(fù)向調(diào)控寄主范圍的基因也可以表現(xiàn)在不同致病變種的致病能力上。同致病變種的致病能力上。植物病原細(xì)菌無毒基因的克隆植物病原細(xì)菌無毒基因的克隆 B.J.Staskawica （1984）首先通過基因互補(bǔ)）首先通過基因互補(bǔ)法從大豆丁香假單胞法從大豆丁香假單胞6號小種中篩選到一個具有號小種中篩選到一個具有無毒基因功能的克隆，無毒基因功能的克隆，Napoli（1987）將此基因）將此基因命名為命名為avrA。此后，已從丁香假單胞菌、甘藍(lán)黑。此后，已從丁香假單胞菌、甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯

55、假單胞中克隆到腐黃單胞桿菌的不同變種和青枯假單胞中克隆到40多個無毒基因。多個無毒基因。無毒基因的表達(dá)和調(diào)控?zé)o毒基因的表達(dá)和調(diào)控 以以P.syringae pv.glycinea中中avrB為代表，其不能在富為代表，其不能在富加培養(yǎng)基上表達(dá)，但可以在基本培養(yǎng)基上表達(dá)。其表達(dá)水加培養(yǎng)基上表達(dá)，但可以在基本培養(yǎng)基上表達(dá)。其表達(dá)水平依賴于碳源。在侵染期間，平依賴于碳源。在侵染期間，avrB在感病或抗病寄主上在感病或抗病寄主上都能高水平表達(dá)，在非寄主植物上也能表達(dá)，說明表達(dá)不都能高水平表達(dá)，在非寄主植物上也能表達(dá)，說明表達(dá)不受特異性植物因子調(diào)控。受特異性植物因子調(diào)控。 以以X.campestris p

56、v. Vesicatoria avrBs3為代表，能在為代表，能在富加、基本培養(yǎng)基以及植物上組成性表達(dá)。這類基因的表富加、基本培養(yǎng)基以及植物上組成性表達(dá)。這類基因的表達(dá)不依賴于達(dá)不依賴于hrp基因簇，但無毒表型的出現(xiàn)需要有功能的基因簇，但無毒表型的出現(xiàn)需要有功能的hrp基因，可能是需要基因，可能是需要hrp基因編碼的無毒蛋白通道?；蚓幋a的無毒蛋白通道。無毒基因的生理功能無毒基因的生理功能 研究表明研究表明,許多植物病原細(xì)菌中存在著無毒基因的許多植物病原細(xì)菌中存在著無毒基因的隱性同源序列隱性同源序列,但這種同源序列已喪失了誘導(dǎo)過敏性壞死但這種同源序列已喪失了誘導(dǎo)過敏性壞死反應(yīng)的功能。說明無毒基

57、因除了有誘導(dǎo)過敏性壞死反應(yīng)反應(yīng)的功能。說明無毒基因除了有誘導(dǎo)過敏性壞死反應(yīng)的功能外，還有其自身的生理功能。的功能外，還有其自身的生理功能。 無毒基因是病原物遺傳因子，除誘導(dǎo)寄主植物（含無毒基因是病原物遺傳因子，除誘導(dǎo)寄主植物（含抗性基因）產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)外，還具有決定病原物抗性基因）產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)外，還具有決定病原物致病性或適應(yīng)性的功能。致病性或適應(yīng)性的功能。 無毒基因的概念是相對的，在一種病原物中起無毒無毒基因的概念是相對的，在一種病原物中起無毒基因作用而在另一種病原物中起致病作用?；蜃饔枚诹硪环N病原物中起致病作用。無毒基因與無毒基因與hrp基因互作基因互作 無毒基因通常在體外、腐

58、生或非致病細(xì)菌中并不無毒基因通常在體外、腐生或非致病細(xì)菌中并不表達(dá)。因此，一般情況下無毒基因產(chǎn)物不足以在植物表達(dá)。因此，一般情況下無毒基因產(chǎn)物不足以在植物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，必須依賴于一個具有完全功能的中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，必須依賴于一個具有完全功能的hrp基因介導(dǎo)的機(jī)制分泌?；蚪閷?dǎo)的機(jī)制分泌。 近年來的研究表明，作為效應(yīng)分子，無毒基因產(chǎn)近年來的研究表明，作為效應(yīng)分子，無毒基因產(chǎn)物是通過物是通過hrp基因簇所編碼的基因簇所編碼的型通道分泌系統(tǒng)運(yùn)送至型通道分泌系統(tǒng)運(yùn)送至細(xì)菌細(xì)胞外與寄主發(fā)生相互作用的。細(xì)菌細(xì)胞外與寄主發(fā)生相互作用的。2.4 決定病原菌致病性或毒性的基因決定病原菌致病性或毒性的基因2.4.

59、1 胞壁降解酶基因胞壁降解酶基因 果膠酶基因果膠酶基因 果膠酶是軟腐歐氏桿菌的重要致病因子，并在果膠酶是軟腐歐氏桿菌的重要致病因子，并在萎蔫性病害（萎蔫性病害（P.solanacearum ）中也起作用，現(xiàn)）中也起作用，現(xiàn)已在至少已在至少5種病原細(xì)菌中克隆到果膠酶基因。種病原細(xì)菌中克隆到果膠酶基因。 除此之外，在青枯假單胞菌已鑒定出除此之外，在青枯假單胞菌已鑒定出4種胞外種胞外酶基因。酶基因。 纖維素酶基因纖維素酶基因 蛋白酶基因蛋白酶基因 編碼纖維素酶基因已在軟腐歐氏桿菌和青枯假單編碼纖維素酶基因已在軟腐歐氏桿菌和青枯假單胞中得到克隆，其主要類型都是內(nèi)聚葡聚糖酶基因。胞中得到克隆，其主要類型

60、都是內(nèi)聚葡聚糖酶基因。 在熒光假單胞（在熒光假單胞（P.flouorescens）胞外酶對馬鈴薯塊組織的）胞外酶對馬鈴薯塊組織的浸離作用研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶有軟化薯塊組織的浸離作用。王浸離作用研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶有軟化薯塊組織的浸離作用。王金生等（金生等（1984）研究表明，）研究表明，3中軟腐病菌產(chǎn)生的蛋白酶在離體中軟腐病菌產(chǎn)生的蛋白酶在離體條件下對馬鈴薯塊組織有較強(qiáng)的浸離力。目前已從軟腐歐氏桿條件下對馬鈴薯塊組織有較強(qiáng)的浸離力。目前已從軟腐歐氏桿菌中克隆了許多蛋白酶基因并對其產(chǎn)物特征進(jìn)行了研究，但這菌中克隆了許多蛋白酶基因并對其產(chǎn)物特征進(jìn)行了研究，但這些基因在致病過程中的作用及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。些基