第五章-分子熒光分析法.

1、第五章第五章 分子熒光分析法分子熒光分析法1.分子熒光分析分析法的基本原理（了解）3.影響熒光強(qiáng)度的因素（熟悉） 2.分子熒光分析儀器的結(jié)構(gòu)及類(lèi)型及新技術(shù)（了解） 4.分子熒光分析法的基本概念、熒光光譜、 激發(fā)光譜、定量分析的依據(jù)（掌握）發(fā)光分析法發(fā)光分析法：物質(zhì)吸收一定能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)以輻射的形式釋放能量返回低能態(tài)或基態(tài)的現(xiàn)象所建立的分析方法。 光致發(fā)光：以光能激發(fā)而產(chǎn)生的發(fā)光 熒光和磷光 光照、加熱、化學(xué)反應(yīng)、生物代謝等熒光分析法熒光分析法：利用物質(zhì)的熒光譜線(xiàn)位置及其強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 定性鑒別：由于不同的物質(zhì)其組成與結(jié)構(gòu)不同，所吸收光的波長(zhǎng)和發(fā)射光的波長(zhǎng)也不

2、同。 定量分析：如果該物質(zhì)的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強(qiáng)度就不同。1. 根據(jù)發(fā)光物質(zhì)分類(lèi)：分子熒光與原子熒光2. 根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)范圍分類(lèi)： 紫外-可見(jiàn)熒光、紅外熒光、X射線(xiàn)熒光熒光熒光分析法分類(lèi)分析法分類(lèi)熒光分析法特點(diǎn)： 靈敏度高、選擇型好、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；2.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷躍遷( (發(fā)光發(fā)

3、光) )和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移 外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫非輻射能量傳遞過(guò)程 振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高 振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍 遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12 s。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無(wú)輻射能 級(jí)交換。 通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。非輻射能量傳遞過(guò)程外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換

4、：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生 相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。 系間跨越系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的 非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋軌道耦合進(jìn)行輻射能量傳遞過(guò)程 發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)； l 2 l 2 l 1 熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)；二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜 固定熒光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)光波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線(xiàn) （圖中曲線(xiàn)I ） 。 選最強(qiáng)熒光強(qiáng)度的激

5、發(fā)光波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，以提高靈敏度。1.熒光熒光(磷光磷光)的激發(fā)光譜曲線(xiàn)的激發(fā)光譜曲線(xiàn)2.熒光光譜(或磷光光譜) 固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與激發(fā)光波長(zhǎng)關(guān)系曲線(xiàn)(圖中曲線(xiàn)II或III)。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜3. 熒光光譜的特征 a. Stokes位移位移:熒光光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) c. 與與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系 通常熒光

6、發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似； 基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。 200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 1.1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件aFII 吸收的光量子數(shù)吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù) 熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。

7、（1）具有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大 鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（） （1）具有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收的特征結(jié)構(gòu)(共軛大 鍵)（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率（） 2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類(lèi)型：* 的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強(qiáng) 吸電子基，使熒光減弱甚至熄滅2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（4）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 abcI

8、IF03 . 2 KcIF 稀溶液五、影響熒光強(qiáng)度的因素2. 溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。3. 溶液溶液pH 對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。1. 溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去激活的幾率減少，增加熒光效率，從而增加熒光強(qiáng)度。pH值值NH3+NH-NH2OH-OH-H+H+ pH13 弱酸、弱堿弱酸、弱堿藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光 4. 散射光：瑞利散射光：選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y(cè)定波長(zhǎng)或選用濾光片可消除拉曼散射光：選擇適當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)的方法消除 一部分光由于光子與物質(zhì)分子的相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)

9、方向發(fā)生改變而向不同方向散射。硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與拉曼光譜與拉曼光譜(b)熒光光譜熒光光譜拉曼光譜拉曼光譜瑞利光瑞利光320nm拉曼光拉曼光360nm拉曼光拉曼光400nm熒光熒光448nm激發(fā)激發(fā)320nm激發(fā)激發(fā)350nm瑞利光瑞利光350nm5. 熒光熄滅熒光熄滅熒光熄滅（熒光猝滅）：熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強(qiáng)度降低熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線(xiàn)性關(guān)系的現(xiàn)象。度與濃度不呈線(xiàn)性關(guān)系的現(xiàn)象。 熒光熄滅劑熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)

10、。：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。羰基、羧基化合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。 熒光自熄滅：熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度超過(guò)熒光物質(zhì)濃度超過(guò)1g/L時(shí)，增加熒光分時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法：熒光熄滅法：利用利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系滅劑的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。 (濃度限量濃度限量1g1mg/ml)930型熒光計(jì)光路示意圖型熒

11、光計(jì)光路示意圖激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片發(fā)射濾光片第二節(jié)第二節(jié) 熒光分析儀器熒光分析儀器熒光分析儀器的主要部件熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：激發(fā)光源：汞燈、鹵鎢燈、氙燈、汞燈、鹵鎢燈、氙燈、分光系統(tǒng)：分光系統(tǒng)：濾光片（兩個(gè)）、單色器（光柵）濾光片（兩個(gè)）、單色器（光柵）樣器池：樣器池：低熒光材料或石英材料，四面透光低熒光材料或石英材料，四面透光檢測(cè)器：檢測(cè)器：紫外紫外- -可見(jiàn)（光電倍增管）可見(jiàn)（光電倍增管）顯示系統(tǒng)顯示系統(tǒng)：指針式、數(shù)字式及計(jì)算機(jī)顯示：指針式、數(shù)字式及計(jì)算機(jī)顯示二、熒光分析儀器的類(lèi)型二、熒光分析儀器的類(lèi)型1.1.熒光光度計(jì)熒光光度計(jì)2.2.熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)熒

12、光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖光柵光柵測(cè)定測(cè)定激發(fā)光譜激發(fā)光譜、熒光光譜熒光光譜及及定量分析定量分析。 最大激發(fā)波長(zhǎng)最大激發(fā)波長(zhǎng)l lexexmaxmax和最和最大熒光波長(zhǎng)大熒光波長(zhǎng)l lememmaxmax是鑒定物是鑒定物質(zhì)的依據(jù)和定量測(cè)定時(shí)最質(zhì)的依據(jù)和定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件。靈敏的條件。 激發(fā)單色器激發(fā)單色器發(fā)射單色器發(fā)射單色器熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別 紫外紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)光路光路光源光源儀器儀器校正校正吸收池吸收池入射光與吸收光入射光與吸收光同方向同方

13、向入射光與熒光垂入射光與熒光垂直方向直方向兩種光源兩種光源(紫外紫外+可見(jiàn)可見(jiàn))一種光源一種光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=0)熒光對(duì)照品溶液熒光對(duì)照品溶液(F=100%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外無(wú)吸收紫外無(wú)吸收兩面透光兩面透光低熒光材料低熒光材料四面透光四面透光紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量池(吸收池)I0ItI0ItIF,p第三節(jié)第三節(jié) 定性和定量分析定性和定量分析定量依據(jù)：定量依據(jù)：F=Kc定性依據(jù)熒光光譜和激發(fā)光譜定性依據(jù)熒光光譜和激發(fā)光譜一、定性分析一、定性分析二、定量分析二、定量分析直接比較法直接比較法xsxsCCFFFF00ssxxCFFFFC00第四節(jié)第四

14、節(jié) 熒光分析新技術(shù)熒光分析新技術(shù)激光熒光分析激光熒光分析時(shí)間分辨熒光分析時(shí)間分辨熒光分析一、熒光新技術(shù)一、熒光新技術(shù)三維熒光分析三維熒光分析核酸分子熒光探針核酸分子熒光探針薄層掃描法中的熒光掃描法薄層掃描法中的熒光掃描法熒光分析的應(yīng)用熒光分析的應(yīng)用1.有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物的熒光分析芳香芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物 有機(jī)化合物：多環(huán)胺類(lèi)、萘酚類(lèi)、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)有機(jī)化合物：多環(huán)胺類(lèi)、萘酚類(lèi)、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類(lèi)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸類(lèi)及蛋白質(zhì)藥物：生物堿類(lèi)；甾體類(lèi)；抗生素類(lèi)藥物：生物堿類(lèi)；甾體類(lèi)；抗生素類(lèi)(青霉素、四環(huán)；青霉素、四環(huán)；維生素類(lèi)維生素類(lèi)(維

15、生素維生素A、B1、B2、B6、B12等等)中草藥：有效成分（芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類(lèi)）中草藥：有效成分（芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類(lèi)）熒光試劑熒光試劑熒光胺熒光胺 l lex=275、390nm， l lem=480nmOOOONRHOHOOCOR-NH2 -NH2熒光胺吡咯啉酮(pyrrolinone)脂肪族和芳香族伯胺脂肪族和芳香族伯胺鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛(OPA)伯胺類(lèi)、伯胺類(lèi)、 -氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸）羥脯氨酸） l lex=340nm， l lem=455nm (2-巰基乙醇存在，巰基乙醇存在，pH910的緩沖溶液的緩沖溶液) 2.無(wú)機(jī)化合物

16、的熒光分析無(wú)機(jī)化合物的熒光分析與具有與具有電子共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物形成電子共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物形成熒光配合物熒光配合物陽(yáng)離子：陽(yáng)離子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr陰離子：陰離子：CN-、F-與與Al、Zr離子強(qiáng)烈配合離子強(qiáng)烈配合原有熒光原有熒光配合物的熒光減弱甚至熄滅配合物的熒光減弱甚至熄滅 課后練習(xí)課后練習(xí) 名詞解釋?zhuān)簾晒馀c磷光、振動(dòng)弛豫名詞解釋?zhuān)簾晒馀c磷光、振動(dòng)弛豫溶液熒光光譜有哪些特征？溶液熒光光譜有哪些特征？能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)分子應(yīng)同時(shí)具備哪些條件？能夠發(fā)

17、射熒光的物質(zhì)分子應(yīng)同時(shí)具備哪些條件？為什么熒光分析法適用于稀溶液的測(cè)定？為什么熒光分析法適用于稀溶液的測(cè)定？填空題填空題1熒光是 物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的 返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光2熒光和磷光的區(qū)別在于熒光是從單線(xiàn)激發(fā)態(tài)開(kāi)始的，磷光是由 。3熒光發(fā)射光譜也稱(chēng)熒光光譜，其發(fā)射波長(zhǎng)總是 激發(fā)波長(zhǎng)。4能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)應(yīng)具備的條件是 、 。5影響熒光強(qiáng)度的外部因素有 。選擇題選擇題1熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與紫外吸收光譜的形狀：（ ） A完全一樣 B基本相似 C肯定不一樣 D難以說(shuō)清B 2對(duì)熒光測(cè)定最有干擾的是：（ ） A波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的瑞利光 B波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)的拉曼光 C波長(zhǎng)比入射光短的瑞利光 D波長(zhǎng)比入射光短的拉