基因芯片在嗜鉻細胞瘤患者基因突變中的檢測作用

1、基因芯片在嗜鉻細胞瘤患者基因突變中的檢測作用徐州醫(yī)學(xué)院研4班泌尿外科： 劉文彬、韓學(xué)超 韓學(xué)超、許小兵 神經(jīng)外科：劉長濤 主要內(nèi)容主要內(nèi)容背景介紹背景介紹12基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)3基因芯片的應(yīng)用基因芯片的應(yīng)用4討論討論背景介紹1、嗜鉻細胞瘤 嗜鉻細胞瘤是由腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細胞及交感神經(jīng)節(jié)細胞形成的腫瘤 ， 瘤組織持續(xù)或間斷地釋放大量兒茶酚胺 引起持續(xù)性或陣發(fā)性高血壓和多個器官功能及代謝紊亂 。 嗜鉻細胞瘤 分為散發(fā)型和家族型，約10%的嗜鉻細胞瘤患者為某些孟德爾遺傳疾病。家族性嗜鉻細胞瘤呈常染色體顯性遺 傳，目前已知這些疾病的嗜鉻細胞瘤發(fā)生與 RET原癌基因、 HL基因、S DHD基因和S

2、DHB基因 4種基因有關(guān)。背景介紹2、近年來研究表明家族性嗜鉻細胞瘤患者中這四種 基因的突變頻率較高，突變頻率的總和接近30%，目前國內(nèi)外普遍采用DNA直接測序技術(shù)， 在嗜鉻細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)和診斷某些孟德爾遺傳疾病，耗費大量的時間和金錢，臨床上難以廣泛的開展。3、最新的基因芯片技術(shù)可以高效快速的探測疾病機制，診斷疾病病因。基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是將大量探針固化于固相支持物上 ，然后與標(biāo)記 的樣品雜交 ，通過對雜交信號的檢測分析 ，得出樣品的遺傳信息。該技術(shù)具有高通量、大規(guī)模 、快速、高效 、高靈敏度等優(yōu)點 ，在科研領(lǐng)域 、生物制藥和醫(yī)學(xué)診斷上都具有良好 的應(yīng) 用前景 ?；蛐酒谑茹t細胞瘤

3、患者中的應(yīng)用1、材料與方法1.1、基因芯片的選擇 選擇與嗜鉻細胞瘤相關(guān)的 4個基因( RET、 V HL、SDHB和SDHD) 共 8 7個突變位點 ， 檢測位點全部位于基 因外顯子區(qū)域 ，涵蓋與嗜鉻細胞瘤相關(guān)的 85 %的已知變異位 點。1.2、患者DNA的提取 取患者外周血5ml，用酚氯仿方法提取DNA?；蛐酒谑茹t細胞瘤患者中的應(yīng)用1.3、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 標(biāo)本的擴增反應(yīng)采用2 5uL 混合體系:： 將2 5 n g D NA樣本， 2 .5 u L 1 0 擴增緩沖液、2u L 2.5 mm o l L d N T P s 、 1 .0u L 2 5 mmol L Mg 、 1

4、 .5ul DMS O、1 u L 2 0 g / LBSA、 1 3 u L d d N2 0、 上、 下游引物 ( 1 umo l L) 各 1 u L分和 2 .5 U T a g聚合 物加入200 L 擴增管。1.4、雜交反應(yīng) 雜交步驟按 照基 因芯 片操作說明書進行。將 P C R擴增液和 陰性、 陽性擴增液加 入 同一個薄壁管 中， 9 8熱變性5 mi n ， 取出后迅 速放入冰盒 ， 一20放置5 mi n。取 出基 因芯 片，做好樣品編號 ， 在雜交艙 中加入預(yù)雜交液4 2。 C靜 置5 mi n ， 吸除該緩沖液； 吸取雜交緩 沖液與 已變 性的 P C R擴增產(chǎn)物混 合物

5、， 混勻 ， 將 液體 全部加 入雜交艙中， 4 2雜交3 0 mi n。吸除雜交艙 中溶 液后清洗兩次。 基因芯片在嗜鉻細胞瘤患者中的應(yīng)用1.5、顯色反應(yīng) 檢測探針采用 Bioti n標(biāo)記， 堿性 磷酸酶( AP ) 催化 的 NBT BCIP顯色反應(yīng)。在雜 交艙中加入抗 體溶液，室溫放 置20 mi n 。吸除雜 交艙中溶液后清洗兩次。向雜交艙 中加入顯色液 溶液 ， 42避光放置40 mi n。吸除雜交艙 中溶液 ，小心揭除雜交艙 ， 用蒸餾水沖洗后 ， 置4 2烘干 。將顯色載玻片面朝下置于 BaiO生物芯片識讀儀 片槽上檢測。 基因芯片在嗜鉻細胞瘤患者中的應(yīng)用1.6、檢測分析 圖像經(jīng)

6、 Ar r a y D o c t o r 軟件分析可 自動輸出檢測結(jié)果。各個信號值均經(jīng)過背景信號值 的矯正。芯片中 1個檢測位點由相鄰的 3個雜交點組成 ， 計算 3個雜交點 的均值為該檢測位點的信號值， 然后將野生型與突變型位點的信號值進行比較， 以判斷是否存在位點突變。 基因芯片在嗜鉻細胞瘤患者中的應(yīng)用2、結(jié)果 基因芯片檢測結(jié)果顯示 ， 9 1 .4% ( 3235 ) 的基因 芯片雜交與基因測序結(jié)果一致。 基因芯片和基因測序的結(jié)果比較 突變基因 基因測序檢出例數(shù) 芯片雜交檢出例數(shù) 符合率SDHB 10 8 80SDHD 2 2 100VHL 7 6 86RET 10 10 100無突變

7、對照 6 6 100 討論 1、 嗜 鉻 細 胞 瘤 占 高 血 壓 病 因 的（ 0.5-1.0）%。 因為本病發(fā)作 時有 引起急癥意外的危 險， 加之尚有 10 為惡性嗜鉻細胞瘤， 故應(yīng)及早診治。新的研究表明，散發(fā) 的嗜鉻細胞瘤中基因 突變頻率較高，某些研究中發(fā)現(xiàn)50%的嗜鉻細胞瘤患者中存在一個易感的等位基因。而傳統(tǒng)的基因測序雖然比較的準(zhǔn)確，但往往要花費大量的時間和金錢，臨床推廣有一定的困難?；蛐酒夹g(shù)相比傳統(tǒng)的基因測序具有快速、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟適用等特點，在嗜鉻細胞瘤的基因診斷中具有較好的應(yīng)用前景。討論2、小樣本的實驗證明基因芯片在嗜鉻細胞瘤的診斷中具有較好的準(zhǔn)確性，但目前還不能完全檢測所有