三七總苷對應(yīng)激大鼠胃黏膜褪黑素受體mRNA表達的影響(精)

1、1182藥理 JournalofChineseMedicinalMaterials第 31 卷第 8 期 2008 年 8 月三七總苷對應(yīng)激大鼠胃黏膜褪黑素受體 mRNA 表達的影響 鄧響潮，李燕舞,王汝俊 (廣州中醫(yī)藥大學,廣東廣州 510405)摘要 目的:觀察三七總苷對應(yīng)激大鼠胃黏膜組織中褪黑素受體(MR)表達以及含量的影響。方法：采用經(jīng)典的水浸 束縛應(yīng)激模型，總 RNA 提取產(chǎn)物應(yīng)用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit 進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，經(jīng)KODAK1Dlmage 成像系統(tǒng)分析，以目的基因(MT1 受體)與內(nèi)參(GAPDH)光密

2、度比 值表示 MT1 受體 mRNA 的相對表達水平。結(jié)果：水浸 束縛應(yīng)激 6h 后,所有以 MT1 為引物的RT PCR 產(chǎn)物中，均可見大小為 360 bp 的陽性條帶；模型組 MR 的相對含量比正常組略低,三七總苷組、 雷尼替丁組與 正常組和模型組比較,MR的相對含量均升高(P0 05或P001)。結(jié)論:應(yīng)激大鼠 胃黏膜中確實存在 MT1 受體 mRNA 的表達,三七總苷組通過上調(diào) MR表達而發(fā)揮 胃黏膜保護作用，其機理可能是三七總苷促進褪黑素分泌或提高其與受體結(jié)合容量 所表現(xiàn)的 MR 高表達。關(guān)鍵詞 三七總苷;應(yīng)激大鼠;胃黏膜;褪黑素受體中圖分類號:R285 5文獻標識碼:A文章編號:1

3、001 4454(2008)08 1182 03EffectofTotalSap onin sfromPa naxno togi nsengon Expessio no fMelato ninReceptormRNAi nGastricMucosaofStressRats DENGXiang chao,LIYan wu,WANGRujun(Gua ngzhouU niversityofTraditio nalChi neseMedici ne,Gua ngzhou510405,Chi na)Abstract Objective:Toobservetheeffectoftotalsaponins

4、fromPanaxnotoginseng(PNS)onmelatoninreceptor(MR)expressionanditscontentingastricmucosaofstressratsMethods :Waterimmersionrestraintstress(WRS)wasusedtoinducestressratmodelRevertAidFir stStrandcDNAS yn thesisKitwasusedforthereversetra nscriptio no fthetotalRNAfromgastricmucosaofstressrats ThePCRproduc

5、twasa nalyzedbyagarosegelelectrophoresisfirstlyand thenbyKODAK1Dlmagesystem Theexpressionlevelofmelatonin 1(MT1)receptormRNAwascalculatedwiththeoptimaldensityofratioofMT1receptorandGAPDH Results:SixhoursafterWRS,therewere360bppositivebandsinRT PCRproductofMT1 Therelativecont entofMRwasloweri nthemod

6、elgrouptha nthatinthenormalgroup MRcontentinPNSgroupandranitidinegroupwerebothhigherthanthatinthenormalgroupandthemodelgroup(P0 05orP60%符合中國藥典 2000 版規(guī)定標準；鹽酸雷尼替丁 膠囊,批號:H44021231,雅來(佛山)制藥有限公司。基金項目：廣州中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科研創(chuàng)新基金(2006F31)(女,研究方向:;mai:lm。JournalofChineseMedicinalMaterials第 31 卷第 8 期 2008 年 8 月11831 2

7、主要試劑及儀器 PTC 200 基因擴增儀,MJ 公司;Stratos 高速冷凍離心機,Heraeus 公司;KO DAK1Dlmage 成像系統(tǒng)。1 3 動物分組與給藥 SPF 級 SD 大鼠,32只，體重 180220g 雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證書:SCXK(粵)2003 0002,粵監(jiān)證字 2007A004;試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周(溫度2426?。濕度 6070%),隨機分為正常對照組、SU 模型組、三七總苷組、陽性對 照(雷尼替丁)組。各組預(yù)防性灌胃給藥或給予同體積蒸餾水。三七總苷組分別預(yù) 防性給藥3d(66mg/kg),1 次/d,陽性對照組造模前預(yù)防性給藥一次

8、，正常對照組給予 同體積蒸餾水。2 方法21 試藥劑量設(shè)計臨床成人靜滴絡(luò)泰粉針劑（三七總苷制劑）用量為 200mg,1 次 /d,按成人體重 60kg,用藥劑量 3 3mg/kg d。大鼠給藥量為成人 20 倍計算為 66mg/kg,各組動物預(yù)定給藥體積 1ml/100g 體重。2 2 應(yīng)激試驗方法 采用經(jīng)典的水浸 束縛應(yīng)激1!模型。三七總苷組預(yù)防性給藥 3d，陽性對照組預(yù)防性給藥 1d,末次給藥后，禁食 24h、禁水 1h,將各組大鼠放入自制應(yīng)激籠中，頭部朝上，固定四肢，將應(yīng)激籠垂直放 入恒溫水槽中（19#1）?水浴，水面平胸骨劍突，持續(xù) 6h。水浸 束縛應(yīng)激模型制作完 成后,將大鼠拉頸處死

9、，剖腹取胃,沿胃大彎剪開胃壁使黏膜面外翻，用冰冷生理鹽水 漂洗后，將胃黏膜面向上平展于潔凈濾紙上，用玻璃片刮下部分胃黏膜，放入凍存管 內(nèi)速凍,-80?冰箱保存。2 3 大鼠胃黏膜 MT1 受體 mRNA 檢測2 3 1 模板制備:取出-80?保存?zhèn)溆梦葛つ?，?50mg 胃黏膜組織加入 1mlTrizol 試劑混勻，靜置 5min,加入 200 l 氯仿劇烈振蕩 15s 靜置 3min,4? 10000? g 離心 15min,小心吸取上清至另一離心管中，加入異丙醇 500 ,l 混勻，靜置10min,4? 10000? g 離心 10min,棄上清,75%乙醇洗滌兩次，風干后加入 DEPC

10、水充 分溶解，調(diào)整濃度為 0 2 g/ ;l 分光光度計測定其 260nm/280nm 比值在 1 82 0 之間。2 3 2 PCR 操作:胃黏膜總 RNA 提取參照 RNAi soReagen 提取說明書進行。 提取產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度計定量后應(yīng)用 RevertAidFirstStrandcDNASyn thesisKit 進行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄體系為 20。丨逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行 PCR 反應(yīng),引物由寶生生物工程 有限公司合 GATATGG 3%,下游:5% GGATCTGAGGCCACAATA AGAC 3%,360bp;GAPDH 上游:5% CTACCCACGGCAAGTTCAAT 3%,下游

11、:5% ACTGTGGTCATGAGCCCTTC 3%,382bpo PCR 反應(yīng)條件：94? ,1min 變性;55? ,1min 退火;72? ,2min 延伸;40 個循環(huán)。23 3 PCR 產(chǎn)物電泳及半定量:PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，經(jīng) K0DAK1Dlmage 成 像系統(tǒng)分析，以目的基因(MT1 受體)與內(nèi)參(GAPDH)光密度比值表示 MT1 受體 mRNA 的相對表達水平。2 4 統(tǒng)計學處理全部數(shù)據(jù)以 x#s 表示,組間兩兩比較 用 t 檢驗。3 結(jié)果31 大鼠胃黏膜 MT1(MR)的 mRNA 表達 如圖 1 所示,所有以 MT1 為引物的 RT PCR 產(chǎn)物中，均可見大小分

12、別為 360bp 左右有陽性條帶，陽性對照 GAPDHRT PCR 產(chǎn)物也可見 382bp 左右的陽性條帶。測序結(jié)果表明應(yīng)激大鼠胃 黏膜 MT1 的 RT PCR 產(chǎn)物序列與GeneBank 中 MT1 的 cDNA 序列相吻合，說明大 鼠胃黏膜中確實存在 MT1(MR)mRNA的表達。圖 1 應(yīng)激大鼠胃黏膜 MT1 受體 mRNA 表達電泳圖3 2 三七總苷對應(yīng)激大鼠胃黏膜褪黑素受體表達的影響結(jié)果如表 1 所示，表明三七總苷有上調(diào)應(yīng)激大鼠胃黏膜中 MR 的作用。表 1三七總苷對應(yīng)激大鼠胃黏膜 MR 表達的影響(!x#s,n=8)組別正常組模型組三七總苷組雷尼替丁組注:與模型組比較，*劑量/m

13、g/kg 等體積蒸餾水等體積蒸餾水66 012 5P0 05,*MT1recptor/GAPDH0 56#0 100 54#0 05*067#0 13*073#012*P0 014 討論褪黑素(MTatonin,MT)是松果體細胞合成的一種吲哚胺，是體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌 的活性小分子(1184JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31 卷第 8 期 2008 年 8 月成及分泌旺盛，一經(jīng)合成立即釋放入血，能調(diào)節(jié)生物節(jié)律。一些研究表明,MT 的生 物學作用十分廣泛，具有抑制性腺、甲狀腺、腎上腺，鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等功能，并有免疫 調(diào)節(jié)、抗腫瘤、延緩衰老作用，還對腦、心

14、、肝等重要臟器具有保護作用。MT 兼具親水性和親脂性，可自由通過任何器官組織細胞的形態(tài)生理屏障及各種體液，極 易通過血腦屏障，具有重要的生理藥理作用，它可以直接或間接清除自由基和活性 氧族,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加其他氧化酶的活 3!力。Tan 于 1993 年發(fā)現(xiàn) MT 具有清除自由基的作用。此后，大量研究報道 MT 對各種氧 化應(yīng)激模型49!有保護作用。MT 保護抗氧化酶活性的可能機制包括兩方面：&自由基清除作用,MT 可直接清除氧自由基，從而減輕氧自由基對抗氧化酶的破壞作用;?間接抗氧 化作用,MT 可能通過細胞內(nèi)機制影6!響抗氧化酶的表達而發(fā)揮抗氧化作用。有文獻報道MT 對應(yīng)激

15、誘導的胃黏膜損傷具有明顯的保護作用，其作用與清除氧自由基、增加胃黏膜的抗氧化能力有關(guān)。這 一結(jié)果與國外的相關(guān)研究結(jié)論一 7,8!致。由于胃腸道組織存在 MR,應(yīng)用外源性 MT 可能對應(yīng)激性潰瘍具有一定的保護作用 其對消化道疾9!病的影響也逐漸受到人們的關(guān)注。中藥防治應(yīng)激性潰瘍有一定的療效和優(yōu)勢，但缺乏有針對性的防治 SU 藥物,其作用 機制研究也欠深入,是研究工作的重點和難點。本實驗根據(jù)中醫(yī)藥理論，以活血化瘀為治則，預(yù)先給予三七總苷，觀察其抗氧化損傷作用。前期工作已發(fā)現(xiàn)三七總苷 對胃黏膜損傷、氧自由基均有影響，具有明顯的胃黏膜保護作用。現(xiàn)再從三七總苷調(diào)節(jié)內(nèi)源性 MT 受體環(huán)節(jié)上，重點探討其抗應(yīng)

16、激性胃黏膜損傷作用機制和預(yù)防機制，為其進一步開發(fā)提供科學依據(jù)，為臨床防治應(yīng)激性潰瘍提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。本研究顯示,以 MT1 受體為引物的 RT PCR 產(chǎn)物中，可見大小分別為 360bp 左右的 陽性條帶，陽性對照 GAPDHRT PCR 產(chǎn)物也可見 382bp 左右的陽性條帶，說明大鼠 胃黏膜中確實存在 MT1(MR)mRNA 的表達。研究結(jié)果還表明，應(yīng)激大鼠模型組 MR 的相對含量與正常組比較略有降低；三七總 苷組、雷尼替丁2!組與正常組和模型組比較,MR 含量均顯著升高(P0 05 或 P0 01),說明三七總苷 有上調(diào)應(yīng)激大鼠胃黏膜中 MR 的作用，其機制可能是三七總苷促進 MT 分

17、泌或加強其與 MR 結(jié)合, 從而參與了抗自由基氧化損傷的過程，二者可能具有協(xié)同作用。由于實驗條件限制，筆者沒能及時購到 MT 放免測定試劑盒，未能同步測定應(yīng)激大 鼠胃黏膜中的 MT 含量，以及運用放射性配基飽和法測定大鼠胃黏膜褪黑素受體的 最大結(jié)合量(Bmax)和解離常數(shù)(Kd 值)，這對討論 MT 與 MR 受體之間的效應(yīng)關(guān)系是 一個缺陷，希望在今后的實驗中能實現(xiàn)同步、定量檢測，以便更確切地探討和求證 MT 受體在體內(nèi)的分布及表達，以及闡明三七總苷和 MT 抗氧自由基損傷的協(xié)同作 用機制。參 考 文 獻1 Pang ,SF 褪黑素及其受體的研究現(xiàn)狀和展望第二軍醫(yī)大學學報，2001,22(1)

18、:5 92 梁嵐 褪黑素作用機制的研究進展中華實用中西醫(yī)雜志,2007,20(17):1551 15533 Karbow nikM,ReiterRJ,GarciaJ,eta1.MTato nin reducesohenydrazine inducedoxidativedamagetocellularmem branes:evidencefortheinvoIvemen tofiro n.I ntJBiochemCellbio,l2000,32:l045 l0544 TanDX,ManchesterLC,ReiterRJ,etal SignificanceofMTat onininanti oxidativedefe nsesystem:reactio nsan dp