活菌計(jì)數(shù)參考材料

1、細(xì)菌計(jì)數(shù)參考材料一、檢樣稀釋1、以無菌操作用1mL滅菌吸管吸取110稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1100的稀釋液。2、另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。3、根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。二、基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由

2、單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測出樣品中的活菌數(shù)。三、器材大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基， 1ml無菌吸管，無菌平皿，盛有9ml無菌水的試管，試管架和記號筆等。四、操作步驟1、編號：取無菌平皿 9套，分別用記號筆標(biāo)明10-6、10-7各2套。另取7支盛有9ml無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、107。2、稀釋用1ml無菌吸管精確地吸取1ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，另取1支吸管將管內(nèi)懸液來回吸吹三次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開水面，使其混合均勻

3、。換一支吸管自10-1試管吸1ml放入10-2試管中，吸吹三次，其余依次類推。整個(gè)稀釋過程如圖-3。3、取樣用3支1ml無菌吸管分別精確地吸取10-6、10-7的稀釋菌液01ml，對號放入編好號的培養(yǎng)皿中。4、計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10一般選擇每個(gè)平板上長有30300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由10-6、10-7兩個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗(yàn)不精確

4、。平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個(gè)稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。平板菌落計(jì)數(shù)法的操作是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號，并于 37溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無菌吸管吸取 0.1ml菌液對號接種于不同稀釋度編號的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺上2030分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于37的溫室中培養(yǎng)。五、無菌操作的基本要求 1、試驗(yàn)開始前，應(yīng)以濕式方法清潔臺面和打掃室內(nèi)地面，然后以紫外線或其他方法對實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣進(jìn)行消毒；2、實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、帽

5、子；進(jìn)行無菌檢驗(yàn)時(shí)，需經(jīng)風(fēng)淋后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，然后，正確穿戴好無菌隔離衣、帽和口罩；3、每吸取一次不同樣液應(yīng)更換無菌吸管，接種環(huán)（針）需在火焰上燒灼滅菌后，才可再次使用；4、要求無菌的試劑，如蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)硬水、中和劑等，均需滅菌或過濾除菌；5、無菌器材和試劑，使用前須檢查容器或包裝是否完整，有破損者不得使用；6、正在使用的無菌器材和試劑不得長時(shí)間暴露于空氣中；7、移液或接種時(shí)，應(yīng)將試管口和瓊脂平板靠近火焰，防止污染；8、所有用過的污染器材，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器中，以防止對周圍環(huán)境和清潔物品造成污染；9、若不慎發(fā)生微生物培養(yǎng)物摔碎或其他試驗(yàn)微生物泄

6、漏事故時(shí)，不論是否具有致病性，均應(yīng)立即對污染及可能波及的區(qū)域進(jìn)行消毒處理；10、全部試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)按常規(guī)對室內(nèi)空氣和環(huán)境表面進(jìn)行消毒處理。六、活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)1、適用范圍測定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。2、試驗(yàn)器材（1）刻度吸管（1.0ml、10.0ml）。（2）稀釋液：（3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：3、操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。其操作程序如下。（1）對菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。洗菌時(shí)，一般以稀釋液為洗液。具體方法如下: 取含 5.0ml 稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣

7、本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 4.5ml 稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上 10-1、10-2、10-3.等。（3）將菌懸液樣本在用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 0.5ml加至 10-1 管內(nèi)。（4）將 10-1 管依前法用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出0.5ml加入10-2 管內(nèi)。如此類推，直至最后一管。必要時(shí)，還可作某稀釋度的1:1或

8、1:4稀釋。（5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長菌落數(shù)每平板為 15cfu300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 1.0ml 加于無菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種 3個(gè)平皿。一般需接種2個(gè)3個(gè)不同稀釋度。平皿加樣前，應(yīng)先按組編號，以免弄混。（6）將冷至4045的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml20ml。（7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動混勻，平放于臺上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37溫箱內(nèi)培養(yǎng)。（8）每日觀察細(xì)菌生長情況。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。（9）對菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，先

9、按各試驗(yàn)要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（10）計(jì)數(shù)菌落時(shí)，一般以肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu300cfu的平板為準(zhǔn)，每個(gè)稀釋度 3 個(gè)平板生長菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該3個(gè)平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有2個(gè)符合上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的兩個(gè)平板菌落的平均值為結(jié)果。對估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá)15時(shí)，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為cfu。4、注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格無菌操作，防止污染。（2）認(rèn)真檢查試驗(yàn)器材有無破損（要特別注意

10、試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。（3）注意菌液的均勻分散。（4）稀釋或取液時(shí)要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。（5）每吸取一個(gè)稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。（7）傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過45，以防損傷細(xì)菌或真菌。傾注和搖動時(shí)，動作應(yīng)盡量平穩(wěn)，以利細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。（8）為提高試驗(yàn)成功率，最好先用濁度計(jì)對原菌液含菌量做出估計(jì)，盡可能在首次試驗(yàn)時(shí)所取的有限稀釋范圍內(nèi)（2個(gè)3個(gè) 稀釋度）即有長菌在 15cfu300c

11、fu 之間的平板。（9）結(jié)果計(jì)算時(shí)，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯(cuò)誤。菌落數(shù)計(jì)算參考1計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在30300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25250個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均在30300之間時(shí)，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報(bào)告）。 2若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如

12、所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計(jì)算出的菌落數(shù)按估算值報(bào)告。 3不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)（有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。 4當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時(shí)，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另

13、一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。 5當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。 6菌落數(shù)的報(bào)告，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g）為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。獸藥典的活菌計(jì)數(shù)法取菌液或疫苗（如果為凍干苗，則先加原裝量510倍量稀釋液作放大稀釋）進(jìn)行稀釋，在一定條件下培養(yǎng)，所得細(xì)菌菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為其活菌數(shù)。按下列方法測定。1、表面培養(yǎng)測定法 每個(gè)樣品取1.0ml，用各制品適宜的稀釋液做10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度換1支吸管。具體方法是：準(zhǔn)確吸取菌液1.0ml，放入盛有稀釋液9.0ml的第1支試管中（不接觸液面），另取1支吸管將第1管液體混合均勻后，吸取1.0ml放入第2管中，依次稀釋至最后一管，根據(jù)對樣品含菌數(shù)的估計(jì)，選擇適宜稀釋度，吸取最終稀釋度的菌液接種適宜的培養(yǎng)基平板3個(gè)，每個(gè)平板0.1ml，使菌液散開，置37晾干后，翻轉(zhuǎn)平板，培養(yǎng)2448小時(shí)（亦可適當(dāng)延長）。2、混合培養(yǎng)測定法 稀釋法同上，取最終稀釋度的菌液接種平板3個(gè)，每