ELISA實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)培訓(xùn)

1、ELISA實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)培訓(xùn)2016.1.21. 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）基本原理及概念2. 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）定量檢測(cè)應(yīng)用3. ELISA實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備移液器基本使用主要內(nèi)容第一部分 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）基本原理及概念免疫技術(shù)酶促反應(yīng)抗原抗體酶底物酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)5什么是抗原？ 能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)并啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，且能與其免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)特異性結(jié)合，引起一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)?？乖禺愋钥贵w6抗原的特點(diǎn)免疫原性和抗原性 免疫原性免疫原性 指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答( (產(chǎn)生特異性產(chǎn)生特異

2、性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞) )的性質(zhì)。的性質(zhì)。 抗原抗原入侵入侵記憶細(xì)胞（對(duì)抗原有記憶功能）漿細(xì)胞特異性抗體效應(yīng)B細(xì)胞7 抗原性抗原性 指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物( (抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞) )發(fā)生發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合的性質(zhì)?？乖ブ虏∧芰? 抗原決定簇大多存在于抗原物質(zhì)的表面，有些存在于抗原物質(zhì)的內(nèi)部，須經(jīng)酶或其他方式處理后才暴露出來。一個(gè)天然抗原物質(zhì)可有多種和多個(gè)決定簇?？乖肿釉酱螅瑳Q定簇的數(shù)目越多?？乖瓫Q定簇：抗體識(shí)別相應(yīng)抗原并與之結(jié)合的位點(diǎn)抗原決定簇抗原決定簇具有兩個(gè)以及兩個(gè)以上抗原決定簇的抗原叫多價(jià)抗原9哪些物質(zhì)可以

3、稱之為抗原呢？大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌外毒素等都是抗原。 可以引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染金黃色葡萄球菌常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥10 病毒呈球形，衣殼由60個(gè)殼微粒組成，呈20面體立 體對(duì)稱，有HAV的特異性抗原(HAVAg)，每一殼微粒由4種不同的多肽（蛋白質(zhì)）即VP1、VP2、VP3和VP4所組成 甲肝病毒1973年Feinslone 首先用免疫電鏡技術(shù)在急性期患者的糞便中拍攝的甲型肝炎病毒 (Hapatitis A virus,HAV ) 11甲肝病毒表面的VP蛋白是具有免疫原性的蛋白，能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的抗體甲肝病毒12什么是抗體？ 抗體是在機(jī)

4、體對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答中，效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，能夠與相應(yīng)抗原特異結(jié)合、產(chǎn)生各種具有免疫效應(yīng)的球蛋白。免疫球蛋白 在甲型肝炎的感染過程中，機(jī)體都可產(chǎn)生抗HAV的lgM 和lgG抗體。前者在急性期和恢復(fù)期出現(xiàn)，后者在恢復(fù)后期出現(xiàn)，并可維持多年，IgG 抗體使得機(jī)體對(duì)同型病毒的再感染有免疫力。13什么是抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1. 特異性抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性，是指抗原分子表面的抗原決定簇與抗體的分子結(jié)合的特異性，這兩個(gè)分子的空間結(jié)構(gòu)是完全互補(bǔ)的。142.可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗

5、體3. 階段性第一階段第一階段特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見第二階段第二階段反應(yīng)可見階段：反應(yīng)慢，但會(huì)出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象我可找到你了15抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)4.比例性抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比例關(guān)系 只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)才出現(xiàn)可見反應(yīng)，形成的免疫復(fù)合物沉淀最多、最大。而當(dāng)抗原抗體比例超過此范圍時(shí)，反應(yīng)速度和沉淀物量都會(huì)迅速降低甚至不出現(xiàn)抗原抗體可見沉淀反應(yīng)。沉淀物形成量沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系沉淀反應(yīng)中沉淀量與抗原抗體的比例關(guān)系16你們都看不見我17放射性免疫標(biāo)記技術(shù)18放射性免疫標(biāo)記技術(shù) 用放射性核素等標(biāo)記物，標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行的抗原抗體檢測(cè)技術(shù)，既有

6、抗原抗體反應(yīng)的特異性，又有標(biāo)記物的靈敏度。通過放射強(qiáng)度的改變，測(cè)定未標(biāo)記抗原或抗體的含量。（放射性標(biāo)記物對(duì)抗原抗體反應(yīng)起到了放大的作用）缺點(diǎn)：放射性物質(zhì)對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生危害 1959年由Yalow和Berson開創(chuàng)了放射免疫技術(shù)(radioimmunoassay，RIA）。這項(xiàng)技術(shù)開辟了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)史上的一個(gè)新紀(jì)元。它使得那些原先認(rèn)為是無法測(cè)定的極微量而又具有重要生物學(xué)意義的物質(zhì)得以精確定量。酶具有可與抗原、抗體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)高活性一個(gè)酶蛋白分子每分鐘可以催化103-104個(gè)底物分子轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物 用酶標(biāo)記抗體（或抗原）建立免疫測(cè)定法，可以使免疫結(jié)果得以放大，保證了測(cè)定方法的靈敏度。20Nakene和

7、Pierce共同研究發(fā)現(xiàn)的酶標(biāo)抗原或抗體的方法，他們共同發(fā)表了酶標(biāo)抗體：制備和抗原定位中的應(yīng)用，首先提出了免疫酶技術(shù)的基本原理酶標(biāo)記抗原或抗體酶標(biāo)抗原或抗體的原理及方法戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鈉法 目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。采用辣根過氧化物酶的原因分子量?。哼@使得它很容易結(jié)合到抗體分子上，且結(jié)合量大大增加，有助于信號(hào)的產(chǎn)生。辣根過氧化物酶的底物比較寬泛，且比堿性磷酸酶敏感。酶標(biāo)抗體或抗原的原理 辣根過氧化物酶中與酶活性無關(guān)的糖蛋白組分，在過碘酸鈉作用下，其中的多糖羥基被氧化成活潑的醛基，后者

8、即可與抗體蛋白中的氨基形成的Schiffs堿而交聯(lián)，再經(jīng)硼氫化鈉還原終止反應(yīng)，即得到穩(wěn)定的酶標(biāo)結(jié)合物辣根過氧化物酶糖蛋白過碘酸鈉抗體蛋白氨基氨基羥基醛基Schiffs堿 酶標(biāo)抗體或抗原技術(shù)基本要求是將酶分子與抗體或抗原分子共價(jià)結(jié)合 此種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應(yīng)活性，也不影響酶的生物化學(xué)活性22在實(shí)驗(yàn)中，為了分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物，洗板的過程是必不可少的，所以，將抗原（抗體）固定在固相載體上就是必須的了將抗原（抗體）固定在什么固相載體上？呀！我沒結(jié)合上固相載體23塑料制品 抗體或蛋白質(zhì)抗原可以通過非共價(jià)鍵或物理吸附機(jī)制結(jié)合到固相載體表面。迄今用的聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板仍是最常

9、用的固相載體Wide 和Jerker Porath研究并公開發(fā)表了抗原或抗體和固相載體結(jié)合的技術(shù)不足測(cè)定過程中固相抗體（抗原）脫吸附率較高且不均一，從而影響測(cè)定的靈敏度和精確性由于制作時(shí)配料及生產(chǎn)工藝的差別，各種聚苯乙烯ELISA板的質(zhì)量差異大，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果優(yōu)點(diǎn)材料經(jīng)濟(jì)方法簡(jiǎn)便操作及測(cè)定易于自動(dòng)化24Rosalyn Sussman Yalow 和Solomon Berson建立了放射性免疫技術(shù)，可以定量檢測(cè)體液中的生物活性物質(zhì)1960年Stratis Avrameas 和G. B. Pierce發(fā)現(xiàn)了酶和抗體結(jié)合技術(shù)Wide 和Jerker Porath研究并公開發(fā)表了抗原或抗體和固相載體結(jié)

10、合的技術(shù)1961-1965年1971年Engral和Perlmann綜合了前人技術(shù)，第一次提出酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，并發(fā)表酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IgG含量一文，使免疫酶技術(shù)成為一種實(shí)用的檢測(cè)液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法 捕獲法捕獲法01 間接法間接法02 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法03雙抗體夾心法雙抗體夾心法04ELISA的分類ELISA方法的適用范圍間接法捕獲法主要用于血清中某種抗體亞型成分，如：IgM的測(cè)定。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。競(jìng)爭(zhēng)法可用于小分子的抗原和半抗原的定量測(cè)定，以及抗體測(cè)定。小分子激素、藥物等的測(cè)定多用此法雙抗體夾心法最常用于抗原檢測(cè)，且為

11、多價(jià)抗原檢測(cè)。但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心此法是檢測(cè)抗體最常用的方法用途廣泛1敏感度高2特異性強(qiáng)3可定性和定量4ELISA方法的特點(diǎn)28雙抗體夾心法原理：利用連接于固相載體上的 和 可分別于樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合，形成 免疫復(fù)合物。 由于反應(yīng)系統(tǒng) 和 相對(duì)于待檢測(cè)抗原是過量的，因此復(fù)合物形成的量和待檢抗原的含量成正比。測(cè)定復(fù)合物酶中加入的底物后生成的有色物質(zhì)（OD值），即可確定待測(cè)抗原的含量。（成正比）抗體 酶標(biāo)抗體過量過量固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體固相抗體酶標(biāo)抗體的量29將抗體包被在固相載體上將抗體固定在固相載體上

12、抗體作為一種蛋白質(zhì)可以與聚苯乙烯制成的固相載體以非共價(jià)鍵和物理吸附的機(jī)制相結(jié)合洗去未結(jié)合的抗原洗去未與抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體TMB底物終止液終止液2mol/LH2SO4酶和底物作用后生成的物質(zhì)在終止劑作用下呈現(xiàn)黃色，黃色的深淺和抗原含量成正比雙抗體夾心法操作甲肝疫苗抗原檢測(cè)的方法雙抗體夾心法 采用ELISA雙抗體夾心法定量/定性檢驗(yàn)甲肝抗原。 將特異性甲肝抗體（包被物）包被到酶標(biāo)板上形成固相抗體； 加入?yún)⒈绕泛凸┰嚻?，與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物 隨后加入酶標(biāo)抗體，參比品和供試品中的甲肝抗原與酶標(biāo)抗體發(fā)生特異性結(jié)合 當(dāng)加入酶底物時(shí)，出現(xiàn)呈色反應(yīng)，酶標(biāo)儀在適當(dāng)波長(zhǎng)測(cè)定參比品以及供試品的OD值 應(yīng)用量

13、反應(yīng)平行線法計(jì)算抗原含量。甲肝疫苗抗原檢測(cè)方法原理第二部分 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）定量檢測(cè)應(yīng)用目錄 國際法規(guī)對(duì)生物分析方法驗(yàn)證的要求 雙抗夾心ELISA檢驗(yàn)方法實(shí)例和驗(yàn)證介紹 ELISA分析模型的選擇Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration (FDA) Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Vete

14、rinary Medicine (CVM) May 2001FDA對(duì)生物分析方法驗(yàn)證的要求Typical method development and establishment for a bioanalytical method include determination of (1)selectivity, (2) accuracy, precision, recovery, (3) calibration curve, and (4) stability of analyte in spiked samples生物學(xué)分析方法的驗(yàn)證項(xiàng)目包括：（1）專屬性；（2）準(zhǔn)確度、精密度、回收率；（

15、3）標(biāo)準(zhǔn)曲線；（4）穩(wěn)定性34精密度的概念The precision of an analytical method describes the closeness of individual measures of an analyte when the procedure is applied repeatedly to multiple aliquots of a single homogeneous volume of biological matrix.精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）或變異系數(shù)（或

16、稱相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）來表示。 偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）或變異系數(shù)越小，說明測(cè)定結(jié)果越集中，精密度越好。精密度的驗(yàn)證結(jié)果表明了這個(gè)檢驗(yàn)系統(tǒng)檢驗(yàn)供試品結(jié)果的波動(dòng)幅度。Precision should be measured using a minimum of five determinations per concentration. A minimum of three concentrations in the range of expected concentrations is recommended. The precision determined at each concentratio

17、n level should not exceed 15% of the coefficient of variation (CV) except for the LLOQ, where it should not exceed 20% of the CV which measures precision with time, and may involve different analysts, equipment, reagents, and laboratories.生物分析方法精密度評(píng)價(jià)的規(guī)定：對(duì)生物分析方法進(jìn)行精密度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，檢測(cè)范圍內(nèi)最少設(shè)置3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度最少進(jìn)行5次重復(fù)

18、試驗(yàn)?？疾煲蛩兀簳r(shí)間、人員、設(shè)備、試劑和實(shí)驗(yàn)室導(dǎo)致結(jié)果的因素驗(yàn)證結(jié)果：在相同濃度下，試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)CV應(yīng)小于15%（最低檢出限的要求是CV小于20%）。FDA對(duì)生物分析方法驗(yàn)證的要求 Once the analytical method has been validated for routine use, its accuracy and precision should be monitored regularly to ensure that the method continues to perform satisfactorily. To achieve this objectiv

19、e, a number of QC samples prepared separately should be analyzed with processed test samples at interval based on the total number of samples. The results of the QC samples provide the basis of accepting or rejecting the run. At least four of every six QC samples should be within 15% of their respec

20、tive nominal value. Two of the six QC samples may be outside the 15% of their respective nominal value, but not both at the same concentration.Application of validated method to routine drug analysis已驗(yàn)證方法在常規(guī)檢驗(yàn)中的應(yīng)用-FDA當(dāng)生物分析方法建立并開始用于常規(guī)檢定后，需要定期監(jiān)控該生物分析方法的精密度和準(zhǔn)確性，以確保分析方法的運(yùn)行是可靠的。采取的方法是，在檢驗(yàn)過程中，定期設(shè)置質(zhì)控品；根據(jù)質(zhì)控

21、品的結(jié)果來判定實(shí)驗(yàn)是否成立。要求：要求：至少4/6的質(zhì)控品的測(cè)定結(jié)果在真實(shí)結(jié)果的15%范圍內(nèi)；2/6的質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果超出真實(shí)結(jié)果真實(shí)結(jié)果的15%間接證明：生物分析方法的波動(dòng)還是很大的質(zhì)控品甲型肝炎滅活疫苗內(nèi)控參比品（內(nèi)參）內(nèi)參設(shè)置頻次每塊酶標(biāo)板設(shè)置1個(gè)內(nèi)參內(nèi)參成立要求體外效力檢驗(yàn)值在1.04-1.28之間，試驗(yàn)成立內(nèi)參均值1.16，其 15%范圍 為0.99-1.33內(nèi)參實(shí)際應(yīng)用情況2013年6-7月間，內(nèi)參共檢驗(yàn)124次，其中10次不符合要求，合格率92%（4/6）北京科興甲肝體外相對(duì)效力檢驗(yàn)FDA所列的生物分析方法之一舉例說明表明：表明：甲肝體外內(nèi)參設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格于FDA法規(guī)要求目前的甲肝體

22、外效力檢驗(yàn)系統(tǒng)是穩(wěn)定、可靠目錄 國際法規(guī)對(duì)生物分析方法驗(yàn)證的要求 雙抗夾心ELISA檢驗(yàn)方法實(shí)例和驗(yàn)證介紹 ELISA分析模型的選擇雙抗夾心ELISA抗原定量檢測(cè)應(yīng)用舉例廠家檢驗(yàn)項(xiàng)目最低檢出限北京科興質(zhì)控部目前使用HBV核心抗原1ng/mlHCV核心抗原1ng/mlHIV p241ng/ml前列腺特異性抗原肺結(jié)核抗原幽門螺旋桿菌抗原卵清蛋白0.312ng/mlVero宿主細(xì)胞蛋白2ng/ml非限制性核酸內(nèi)切酶0.2ng/ml不同ELISA試劑盒驗(yàn)證的變異系數(shù)SampleMean concentrationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)15.070.234

23、.6024.090.317.5533.280.267.8942.180.062.8351.590.0684.5960.780.0283.54 Intra-assay板內(nèi)SampleMean concentrationng/mLS t a n d a r d deviationCV(%)18.830.738.2324.550.296.3533.040.217.0240.820.056.57 Inter-assay板間卵清蛋白的ELISA定量試劑盒幽門螺旋桿菌抗原不同ELISA試劑盒驗(yàn)證的變異系數(shù)POOlIntra assay CVInter assay CVLow6.9%4.4%Medium5.5%3.7%High3.5%3.6%Vero 宿主細(xì)胞蛋白不同的定量