蛋白質(zhì)研究技術(shù)

1、一一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)分子顆粒大小1100nm之間,屬膠體顆粒范圍蛋白質(zhì)的膠體原因： 表面形成水化層表面形成水化層表面同種電荷的斥力表面同種電荷的斥力蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀(一) 蛋白質(zhì)的沉淀概念:應(yīng)用: :(1) 蛋白質(zhì)分離純化 (2) 解毒 (3) 臨床檢驗(yàn) 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1 1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）；、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）； 2 2、酸堿（等電點(diǎn)沉淀）；、酸堿（等電

2、點(diǎn)沉淀）； 3 3、有機(jī)溶劑沉淀；、有機(jī)溶劑沉淀； 4 4、重金屬鹽類沉淀；、重金屬鹽類沉淀；5 5、生物堿試劑沉淀、生物堿試劑沉淀6 6、加熱變性沉淀、加熱變性沉淀(1) 鹽析法( salting out) 常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 使蛋白質(zhì)沉淀的方法概念：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉 淀稱為鹽析特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性 作用原理: 鹽離子與水親和力極強(qiáng)，奪去蛋白質(zhì)的 水化層，減少分子間靜電斥力(2) 有機(jī)溶劑沉淀法 注意事項(xiàng): 必須在低溫下操作 盡量縮短處理的時(shí)間 及時(shí)將蛋白質(zhì)中殘存的有機(jī)溶劑除去 缺點(diǎn)：常會(huì)使蛋白質(zhì)變性常會(huì)使蛋白質(zhì)變性 原理: 使

3、蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電 常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分 子聚集而沉淀 常用有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮 (3) 重金屬鹽沉淀法 若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI，沉淀更易發(fā)生 缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活 原理: 重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+ 等帶有正電荷，能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù) 電的基團(tuán)結(jié)合，生成不溶性的重金屬蛋 白鹽而沉淀(4) 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 缺點(diǎn)：常引起蛋白質(zhì)變性原理: 生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某 些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和 硝酸等)，與帶正電的蛋白質(zhì) 結(jié)合生成不溶 性的鹽而沉淀 注意事項(xiàng): 反應(yīng)溶液的pHpI，確保

4、蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子 形式存在等電點(diǎn)沉淀：pH=pI時(shí)引起蛋白質(zhì)的沉淀(二) 蛋白質(zhì)的凝固概念：變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的 現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的凝固，凝固作用本質(zhì)上是 蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K超濾：利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通 過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在 膜上，稱為超過濾透析：將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流 動(dòng)的適當(dāng)?shù)木彌_液（如純水）中，小分子 雜質(zhì)（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出， 而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化（三）透析和超濾透析工作圖半透膜原理磁力攪拌器透析袋超濾工作圖(四)

5、 電 泳 概念：帶電顆粒在電場(chǎng)中向著所帶電荷相反方向 移動(dòng)的現(xiàn)象原理：不同的蛋白質(zhì)的因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電量的 不同而有不同的泳動(dòng)速度，從而達(dá)到分析 和分離蛋白質(zhì)的目的應(yīng)用：電泳技術(shù)是生化常用分析技術(shù)之一 (四) 電 泳 分類：自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn) 行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域 - - 紙電泳：紙電泳：用濾紙作為支持物用濾紙作為支持物 - - 凝膠電泳：凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物

6、支持物圓盤電泳：圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳平板電泳：平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳在鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳+ +圓盤電泳圓盤電泳平板電泳平板電泳(四) 電 泳 電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：SDS-PAGE, Native-PAGE蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定： Isoelectric Focusing 蛋白質(zhì)組學(xué)研究：雙向電泳 樣品處理樣品處理染色染色電泳電泳蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定（ SDS-PAGE ）(四) 電 泳 (四) 電 泳 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定等電聚焦等電聚焦第二相電泳第二相電泳染色染色 主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)雙向電泳(2D-PAGE)(四) 電

7、泳 ( (五五) ) 層層 析析原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為存在差 別，從而導(dǎo)致移動(dòng)速度的不同 離子交換色譜 (ion exchange chromatography) 疏水作用色譜 (hydrophobic chromatography) 凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography) 親和色譜 (affinity chromatography) 金屬螯和色譜 (metal chelating chromatography) 離子交換色離子交換色譜譜原理：根據(jù)離子交換樹脂對(duì)各種離子的親和力不同 而達(dá)到分離的目的，大分子因與樹脂親和力 不同，以不同牢度被吸

8、附于離子交換劑，通 過改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子從樹脂上 先后被洗脫 分為：陰離子交換基：DEAE（二乙胺乙基） QAE（季銨乙基） 陽(yáng)離子交換基： CM（羧甲基） P（磷酸基） SP（磺丙基）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇2468101214等電點(diǎn)等電點(diǎn)-體系體系pH蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷+蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷 根據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇適宜的pH值和緩沖體系0實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇P P+ +P P0 0P P- -P P2-2-P P3-3-P P3-3-P P2-2-P P- -P P+ +P P0 0P P3-3-P P2-2-P P- -P P+ +P P0 0 根

9、據(jù)蛋白的性質(zhì)選擇合適的洗脫條件疏水作用色疏水作用色譜譜原理：根據(jù)蛋白質(zhì)與吸附劑之間的弱疏水性 作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的分步洗脫 各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑 常用的疏水性配基： 苯基、短鏈烷基C3C8）、 烷氨基、聚乙二醇和聚醚 疏水吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長(zhǎng)度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難 疏水作用色譜的洗脫一般采用降低緩沖液中的鹽濃度來 洗脫蛋白 也可以采用加入少量的有機(jī)溶劑來洗脫，如反相色譜疏水作用色疏水作用色譜譜Fraction凝膠過濾色凝膠過濾色譜譜概念： 當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的

10、層析柱時(shí)，根據(jù) 它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)，又可稱作排 阻色譜或者分子篩色譜原理： 凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物 流過層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠 孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被 洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入 凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較 慢，最后被洗脫出來常用凝膠：交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 、聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂糖凝膠（ Sepharose）凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的洗脫凝膠過濾色譜的應(yīng)凝膠過濾色譜的應(yīng)用用生物大分子的分離純化分子量的測(cè)定分級(jí)分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測(cè)定細(xì)胞及顆粒的分離親和色親和色譜

11、譜 原理：利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異 結(jié)合的化合物（稱配體）連接到固相載體 上，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱 時(shí)，可以與載體上的配體特異的結(jié)合而留在 柱上，其他物質(zhì)則不能結(jié)合，然后用適當(dāng)方 法使生物大分子從配體上洗脫下來，從而達(dá) 到分離提純的目的 特點(diǎn)：純化效率高，提純度可達(dá)幾千倍配體配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物合物交聯(lián)試劑交聯(lián)試劑載體載體配體配體載體與配體載體與配體交聯(lián)體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)游離配游離配體體洗脫結(jié)合耦聯(lián)作用機(jī)理親和色譜的洗脫親和色譜的應(yīng)用親和色譜的應(yīng)用 抗原和抗體 激素和受體蛋白 凝集素和多糖(糖蛋白) 酶與輔酶(或產(chǎn)物、抑制劑) 核酸與

12、互補(bǔ)鏈（或核酸多聚酶、結(jié)合蛋白） 細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）金屬螯合色譜金屬螯合色譜 原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配 基與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固 定相上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有 的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生 特異螯合作用而進(jìn)行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特點(diǎn)： 體系復(fù)雜: 含量低、組分多、干擾大 水溶液體系： 接近生理狀態(tài)，盡量避免 使用有機(jī)溶劑 低溫操作： 防止蛋白變性和失活 必要的添加劑： 蛋白酶抑制劑、還原劑 專業(yè)的儀器設(shè)備：制備型 蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)分

13、離、純化和鑒定 蛋白質(zhì)分離提純的原則： 純度、活性和產(chǎn)量 蛋白質(zhì)分離提純的一般步驟： 破碎細(xì)胞 蛋白提取 粗細(xì)分級(jí) 鑒定 分離純化技術(shù) 綜合運(yùn)用各種方法和技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化方蛋白質(zhì)分離純化方法法 按蛋白質(zhì)性質(zhì)分類 溶解度： 沉淀(鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)) 分子大小、形狀：離心、超濾、透析、 凝膠過濾層析 分子大小、電荷：電泳、離子交換層析 分子間作用力： 親和層析、金屬鰲合層析、 疏水作用層析蛋白質(zhì)分離純化方蛋白質(zhì)分離純化方法法 按純化方法分類 沉淀：鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn) 電泳：凝膠電泳、等電聚焦 離心：常規(guī)、密度梯度 過濾：超濾、透析 層析：離子交換、凝膠過濾、親和層析、 疏水作用蛋白分離

14、純化的目的蛋白分離純化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻譯后修飾（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的裝配 (Interactions and assembly) 三維結(jié)構(gòu) (3-dimensional structure) 生物功能分析 (Analysis of biological function) 藥物開發(fā) (Drug development) 從有機(jī)體中獲得純的蛋白要盡可能的用較少 的步驟，盡可能少的丟失活力分離純化策略分離純化策略 細(xì)胞與組織(材料來源有限，但是蛋白是天然的 狀態(tài)) 折疊均一, 可溶（主要指非膜蛋白） 可通過差速離心分離

15、細(xì)胞組份 純化可用色譜方法（chromatography）從哪兒開始從哪兒開始 ？ cDNA克?。槟壳暗鞍讈碓吹闹饕椒ǎ堑鞍滓仔纬砂w（inclusion body） 重組蛋白基因在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、 哺 乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中表達(dá) 也用差速離心及色譜方法純化 在重組的蛋白中可以添加Tags以便于純化從哪兒開始從哪兒開始 ？破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞上上清清沉淀沉淀( (丟棄丟棄) )離心離心細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解物細(xì)胞裂解物, ,蛋白蛋白 核酸及小分子核酸及小分子多步純化多步純化(包括鹽析包括鹽析、過濾過濾、層析等層析等)不需要的分子不需要的分子純蛋白純蛋白從組織細(xì)胞中進(jìn)行蛋白分離流程圖

16、蛋白質(zhì)粗分離 I I：從組織細(xì)胞 - 提 取 哪個(gè)物種合適？ 豐度及活力特點(diǎn) 大小，成本及物種的可獲得狀況 哪個(gè)組織合適 ? 對(duì)于特定的細(xì)胞哪個(gè)組織豐富 組織中哪種細(xì)胞中有這類蛋白 純化過程中的作為應(yīng)該與特定的方案相關(guān) 非常有益的信息 大小 組成影響組織提取的因影響組織提取的因素素 緩沖液（ Buffer ） 離子強(qiáng)度（ Inoic strength ） 金屬離子螯合劑（ Metal ion chelators） 還原劑（ Reducing agents ） 蛋白酶抑制劑（ Protease inhibitors ） 溫度（ Temperature ） 組織的破碎方式（ Tissue disr

17、uption ）組織破碎組織破碎(Tissue disruption) 除去不要的組織 攪碎 勻漿（homogenization） 研磨 (vessel for extraction)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎(Cell Disruption) 化學(xué)破碎: 堿、有機(jī)溶劑、去污劑 酶學(xué)手段: 溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶 (常適用于含細(xì)胞壁的細(xì)菌及植物細(xì)胞) 物理方法: 滲透壓震蕩、凍溶 機(jī)械方法: 超聲、勻漿、濕磨、壓力初步純初步純化化 - 熱變性熱變性 不同的蛋白有 不同的熱穩(wěn)定 性，且有些蛋 白可以在熱變 性以后再?gòu)?fù)性 鈣調(diào)蛋白是能 通過熱變性而 獲得純化的一 個(gè)很好例子天然結(jié)構(gòu)天然結(jié)構(gòu)(%)一般蛋白

18、一般蛋白0 () 100鈣調(diào)蛋白鈣調(diào)蛋白初步純初步純化化 - 沉淀沉淀 鹽析：減少蛋白質(zhì)表面的水化層 硫酸銨、尿素 等電點(diǎn)沉淀：降低蛋白質(zhì)分子的荷電狀態(tài) 改變體系pH值至pI附近 有機(jī)溶劑沉淀：減少蛋白表面水化層，增加疏水性 降低水的介電常數(shù)，降低蛋白溶解性 甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇蛋白質(zhì)粗分離蛋白質(zhì)粗分離 IIII：表達(dá)蛋表達(dá)蛋白白 重組基因的表達(dá) 可獲得大量的蛋白 可進(jìn)行突變 - structure/activity studies 可引入具有光譜特性的物質(zhì) 可引入穩(wěn)定同位素 15N 、 2H 、 13C (for NMR) 蛋白融合體 便于純化及免疫學(xué)研究菌體菌體細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎總蛋白

19、總蛋白純蛋白純蛋白性質(zhì)分析性質(zhì)分析培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)介質(zhì)細(xì)胞碎片細(xì)胞碎片非目的蛋白非目的蛋白離心、過濾物理、化學(xué)、酶學(xué)方法多步純化步驟重組蛋白分離純化蛋白質(zhì)的精細(xì)純化 基本策略： 綜合運(yùn)用各種層析技術(shù)，尤其是特異性比較高的方法，如親和層析，可以大大減少純化的步驟和工作量，提高產(chǎn)品的純度蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定定性分析： 分子量: 凝膠電泳、質(zhì)譜 (可同時(shí)鑒定分子量和純度) 活性: 根據(jù)蛋白質(zhì)的功能選用不同的活 性檢測(cè)方法SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量和純度 MALDI-TOF-MS測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量和純度 080001600024000320004000048000560000400800120

20、0160053232.7635380.8017697.728849.63m/Z蛋白質(zhì)的鑒定 定量分析： Folin-酚試劑法（Lowry法）： A500nm 靈敏度高、是常用的方法 考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）：A595nm 簡(jiǎn)單迅速、干擾少、靈敏度高(1g) 紫外檢測(cè)法：濃度(mg/mL)= 1.45A280nm-0.74A260nm 簡(jiǎn)單快速、不破壞樣品、準(zhǔn)確度低常用儀器作業(yè)題： 已知某蛋白的分子量約為17 kDa，等電點(diǎn)3.94.1，它能耐一定的高溫，在90 C加熱34 min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團(tuán)。該蛋白的

21、作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)從腦組織中提取和分離純化該蛋白的實(shí)驗(yàn)方案，要求寫出具體的步驟和理由，以及檢測(cè)方法。(1) 鹽析法( salting out) 常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 使蛋白質(zhì)沉淀的方法概念：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉 淀稱為鹽析特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性 作用原理: 鹽離子與水親和力極強(qiáng)，奪去蛋白質(zhì)的 水化層，減少分子間靜電斥力(二) 蛋白質(zhì)的凝固概念：變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的 現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的凝固，凝固作用本質(zhì)上是 蛋白質(zhì)變性后進(jìn)一步發(fā)展的不可逆結(jié)果如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K如加熱可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴荒茉偃芙獾哪龎K樣品處理樣品處理染色染色電泳電泳蛋白質(zhì)分子量的