蛋白質(zhì)的生物合成2

1、11第二節(jié) 原核生物DNA復(fù)制 特點(diǎn) 只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) 雙向復(fù)制 復(fù)制速度快 引物和岡崎片段長 可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制22 大腸桿菌DNADNA聚合酶 三類 DNADNA聚合酶-多功能酶5-35-33DNADNA聚合酶的功能5 5 3 3 聚合作用聚合作用5 5 3 3 外切酶外切酶3 3 5 5 外切酶活性功能：功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)，制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)，切除引物。切除引物。4l DNApol 利用35外切活性切除錯(cuò)配的堿基，同時(shí)利用53聚合活性補(bǔ)回正確的核苷酸，這種功能稱為即時(shí)校讀(proof read)。l DNA

2、pol 的53外切酶作用可以與其聚合作用同時(shí)發(fā)生， 產(chǎn)生缺口平移(nick translation)、鏈的置換及模板轉(zhuǎn)轍現(xiàn)象。5堿基配對正確，DNApol 無活性3-5外切活性5-3聚合活性DNApol AGdCTPCG5353DNApolDNApol的即時(shí)校讀功能的即時(shí)校讀功能6323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常

3、用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 75 u ucgagccgagcu uag-ag-OH OH 3 5 u ucgagccgagcu uagagDNA poldNTP5 5 3 3 聚合作用聚合作用3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 catcggatcgcatcgtcacgtgctag catcggatcgcatcgtc

4、acgtgctag 3 853內(nèi)切酶內(nèi)切酶外切酶外切酶外切酶與內(nèi)切酶作用圖解5 5 3 3 外切酶活性的功能外切酶活性的功能 切除引物，切除突變片段切除引物，切除突變片段5395 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。 DNADNA聚合酶聚合酶的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1035 外切酶活性 校 讀

5、 錯(cuò)配堿基11模 板聚合酶活性位點(diǎn)引物3 5 外切酶位點(diǎn)12u DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然 能存活。能存活。 它參與它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 13功能：功能：原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶DNA-pol (250kD)10種亞基組成的種亞基組成的不對稱異源二聚體不對稱異源二聚體14可滑動(dòng)的 夾持器亞基催化亞基35外切酶亞基前導(dǎo)鏈 合成后隨鏈 合成 夾持器裝置催化亞基 亞基保持核心酶 的二聚體結(jié)構(gòu)15亞基具有53方向合成DNA的催化活性亞基具有35外切酶活性

6、，起校對功能， 可提高聚合酶復(fù)制DNA的保真性 亞基可能加強(qiáng)亞基的作用亞基猶如夾子，功能是識別引物、夾住DNA 分子向前滑動(dòng) 亞基起著促使核心酶二聚化的作用其余的亞基構(gòu)成 -復(fù)合物，主要功能是幫助 亞基夾住DNA（也稱夾子裝置器），并有 增強(qiáng)核心酶活性的作用16大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNADNA聚合酶比較聚合酶比較DNADNA聚合酶聚合酶分子量分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5 5 -3 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 3 -5 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 5 -3 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率主要功能主要功能活性（活性（nt/minnt/min） D

7、NADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶（復(fù)合物復(fù)合物）109109，000000400400+ + + +1 1校讀校讀, ,修復(fù)修復(fù)10001000120120，0000004040+ + +- -0 .050 .05400400，00000010-2010-20+ + + +5050復(fù)制復(fù)制100000100000特特 性性不清不清填補(bǔ)缺口填補(bǔ)缺口50501717 大腸桿菌基因組DNA 復(fù)制的基本過程 起始 起始部位的解鏈oriCDnaA蛋白結(jié)蛋白結(jié)合合9bp序列序列13bp重復(fù)序重復(fù)序列區(qū)解鏈列區(qū)解鏈單鏈結(jié)合單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合形成開放形成開放復(fù)合物復(fù)合物1818 局部形成引

8、發(fā)體 DnaC、B、G和起始點(diǎn)DNA形成復(fù)合物，其蛋白質(zhì)部分在鏈上移動(dòng)到合適位置，根據(jù)堿基配對的原則，開始催化RNA引物的合成1919 復(fù)制的延伸 半不連續(xù)-前導(dǎo)鏈的連續(xù)合成，隨從鏈合成一段段岡崎片段2020 復(fù)制的終止oriC終止序列復(fù)制叉終止區(qū)復(fù)制叉終止區(qū)終止序列纏繞的環(huán)狀纏繞的環(huán)狀DNA分子分子拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶II獨(dú)立的環(huán)狀DNA分子2121 原核生物基因組DNA復(fù)制的典型模式 型復(fù)制-復(fù)制從oriC開始以順時(shí)針和逆時(shí)針兩個(gè)方向進(jìn)行 主要的復(fù)制方式2222 原核生物DNA復(fù)制的調(diào)節(jié) 復(fù)制起始頻率的調(diào)節(jié) 主要調(diào)節(jié)復(fù)制的起始頻率 DnaA的濃度對復(fù)制的起始具有正調(diào)控 作用 復(fù)制頻率與細(xì)胞

9、分裂周期相適應(yīng)的機(jī)制 控制復(fù)制起始點(diǎn)的甲基化修飾23親代單鏈A甲基化DNA與細(xì)胞膜結(jié)合，DNA的甲基化受到抑制Ori C中的GATCDamSeq A子代DNA中的A被甲基化Dam2424第三節(jié) 真核生物DNA復(fù)制1.真核生物染色體DNA 復(fù)制的共同特點(diǎn) 復(fù)制時(shí)要解開和重新合成核小體結(jié)構(gòu)A.復(fù)制速度慢于原核生物克服核小體結(jié)構(gòu) 的空間阻礙B.組蛋白合成與DNA復(fù)制同步進(jìn)行，使DNA邊復(fù)制，邊組裝成核小體25252.多起點(diǎn)復(fù)制3.RNA引物片段及岡崎片段長度小于原核生物4.真核生物染色體復(fù)制完成后在再進(jìn)行下一次的復(fù)制2626 真核生物染色體DNA 復(fù)制過程 復(fù)制的聚合酶和輔助因子 五種、分別起著不同

10、的作用27填補(bǔ)引物填補(bǔ)引物空隙，切空隙，切除修復(fù)，除修復(fù)，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復(fù)復(fù)制制低保低保真度真度的復(fù)的復(fù)制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填補(bǔ)引物填補(bǔ)引物空隙，切空隙，切除修復(fù)，除修復(fù)，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復(fù)復(fù)制制低保低保真度真度的復(fù)的復(fù)制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功

11、能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶2828 復(fù)制的起始和終止 起始 復(fù)制起始點(diǎn)-自主復(fù)制序列，能被起始復(fù)合物識別酵母復(fù)制起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)酵母復(fù)制起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)B3B2B1A 復(fù)制起始識別序列復(fù)制起始識別序列ARS結(jié)合因子結(jié)合因子1結(jié)結(jié)合位點(diǎn)合位點(diǎn)解鏈區(qū)段解鏈區(qū)段起始識別復(fù)合物起始識別復(fù)合物ARS結(jié)合結(jié)結(jié)合結(jié)合因子合因子129DNA聚合酶與負(fù)責(zé)的延伸 DNA聚合酶：RNA引物的合成，新的DNA鏈合成。 DNA聚合酶：取代DNA聚合酶，是DNA

12、復(fù)制延長的主要酶，這個(gè)過程稱為聚合酶的切換。 PNCA:增值細(xì)胞核抗原，可以與DNA聚合酶結(jié)合，增強(qiáng)其延伸能力。3030 端粒結(jié)構(gòu)和端粒酶在真核生物基因組復(fù)制過程中的作用 端粒-真核，由DNA和蛋白質(zhì)組成生物染色體的末段結(jié)構(gòu) 端粒酶-逆轉(zhuǎn)錄酶，蛋白質(zhì)和RNA組成，其RNA序列是復(fù)制端粒重復(fù)序列的模板，具有種屬特異性5 3 3 3 3 5 5 5 31313232 端粒結(jié)構(gòu)是保持真核染色體DNA在復(fù)制過程中DNA的長度,保證染色體的穩(wěn)定性. 端粒DNA的長度變短可以導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，細(xì)胞衰老； 端粒酶活性過高，端粒DNA不停的延長，細(xì)胞不停分裂，有可能產(chǎn)生癌癥。3333 線粒體DNA的復(fù)制 D環(huán)

13、復(fù)制方式 模板雙鏈的復(fù)制起點(diǎn)激活有先后，復(fù)制的結(jié)束時(shí)間不同34343535 真核生物DNA復(fù)制的調(diào)控 細(xì)胞周期過程中的調(diào)控 在S 期進(jìn)行染色體的雙向復(fù)制36DNA合成期哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期3737 真核生物DNA復(fù)制的調(diào)控 細(xì)胞周期過程中的調(diào)控 細(xì)胞周期蛋白D 激活S期的CDK 激活復(fù)制許可因子（其此時(shí)可以從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，然后失活）3838 染色體水平調(diào)控 復(fù)制子水平的調(diào)控 與復(fù)制起始復(fù)合物的形成和RNA引物的合成等的一些蛋白質(zhì)和酶來共同參與復(fù)制起始位的調(diào)控39第四節(jié) 某些病毒基因組的復(fù)制 模板- RNA或DNA 酶- 聚合酶（ RNA或DNA）、蛋白因子 復(fù)制場所- 大部

14、分RNA病毒（逆轉(zhuǎn)錄以外）在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行 大部分DNA病毒在細(xì)胞核中 需要宿主提供復(fù)制的蛋白分子 起始的引物多樣性40復(fù)制起始復(fù)合體 引發(fā)復(fù)制 （不需引物） 避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG SSB + ATP DNA 末端解鏈 TP pTP-Ser + dCTP pTP-Ser-dCMP 3 OH 過程 NF NF DBP 首先結(jié)合到復(fù)制起點(diǎn)，然后PTP前段蛋白與聚合酶形成復(fù)合物與DNA結(jié)合，催化DNA的末端解鏈。41腺病毒 DNA 復(fù)制起始G424343 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的復(fù)制 反(逆)轉(zhuǎn)錄酶-以RNA 為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷合成cDNA 原料: dNTP

15、 模板: 正鏈RNA病毒 引物: 宿主細(xì)胞tRNA44逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶多功能酶，有三種酶活性：，有三種酶活性：1. 1. 逆轉(zhuǎn)錄活性：逆轉(zhuǎn)錄活性：即以即以RNARNA為模板合成為模板合成DNADNA2. RNase2. RNase活性：活性：水解水解RNARNA:DNA:DNA中的中的RNARNA3. DNA pol3. DNA pol活性：活性：以以DNADNA為模板合成為模板合成DNADNA特點(diǎn)：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高特點(diǎn)：無外切酶活性，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤率高2 21010-4-4。455353TTTTpoly A tail35CCC353GGG5整合整合入細(xì)胞基因組入細(xì)胞基因組逆轉(zhuǎn)

16、錄活性逆轉(zhuǎn)錄活性RNaseRNase活性活性RNA:DNARNA:DNA雜合鏈雜合鏈RNARNA模板模板單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNADNA polDNA pol活性活性原病毒tRNA提供3端羥基，與長末端序列（LTR）中的引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。46DNADNA聚合酶的功能5 5 3 3 聚合作用聚合作用5 5 3 3 外切酶外切酶3 3 5 5 外切酶活性功能：功能：對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)對復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)，制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)，切除引物。切除引物。47l DNApol 利用35外切活性切除錯(cuò)配的堿基，同時(shí)利用53聚合活性補(bǔ)回正確的核

17、苷酸，這種功能稱為即時(shí)校讀(proof read)。l DNApol 的53外切酶作用可以與其聚合作用同時(shí)發(fā)生， 產(chǎn)生缺口平移(nick translation)、鏈的置換及模板轉(zhuǎn)轍現(xiàn)象。4853內(nèi)切酶內(nèi)切酶外切酶外切酶外切酶與內(nèi)切酶作用圖解5 5 3 3 外切酶活性的功能外切酶活性的功能 切除引物，切除突變片段切除引物，切除突變片段53495 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的

18、DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。 DNADNA聚合酶聚合酶的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 5050第三節(jié) 真核生物DNA復(fù)制1.真核生物染色體DNA 復(fù)制的共同特點(diǎn) 復(fù)制時(shí)要解開和重新合成核小體結(jié)構(gòu)A.復(fù)制速度慢于原核生物克服核小體結(jié)構(gòu) 的空間阻礙B.組蛋白合成與DNA復(fù)制同步進(jìn)行，使DNA邊復(fù)制，邊組裝成核小體51填補(bǔ)引物填補(bǔ)引物空隙，切空隙，切除修復(fù)，除修復(fù)，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復(fù)復(fù)制制低保低保真度真度的復(fù)的復(fù)制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填補(bǔ)引物