基因工程操作程序

1、基因工程的基本操作程序甘肅漳縣一中 理化生組 鄧燕 復(fù)習(xí)引入 新課學(xué)習(xí) 課堂小結(jié) 鞏固練習(xí)結(jié)束語2.DNA重組技術(shù)的基本工具有那些，各自的作用和特點(diǎn)是什么？復(fù)習(xí)：（1）限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀” 能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并能將每一條鏈上特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵切開。 （2）DNA連接酶“分子縫合針” 將雙鏈DNA片段“縫合”起來，催化磷酸二酯鍵形成。（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車” 能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞。1.什么是基因工程？ 基因工程是按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需

2、要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。 返回首頁請觀看基因工程的基本操作步驟示意，想一想每個步驟所用到的工具和要達(dá)到的目的。新課學(xué)習(xí)：基因工程的基本操作程基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟：序主要包括四個步驟：一一、目的基因的獲取、目的基因的獲?。欢?、基因表達(dá)載體的構(gòu)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建；建；三、將目的基因?qū)胧苋⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞；體細(xì)胞；四、目的基因的檢測與四、目的基因的檢測與鑒定。鑒定。返回首頁為什么要有“目的基因的獲取”這一步？ 有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。 一目的基因的獲取一目的基因的獲取1 目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。2目的基因的獲取方法

3、：目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲取）從基因文庫中獲取 基因文庫： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。 構(gòu)建基因文庫的目的： 為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。小資料：基因組文庫：含有一種生物的所有基因。部分基因文庫：（如cDNA文庫）含部分基因，可由mRNA反轉(zhuǎn)錄而來。PCR：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：DNA雙鏈復(fù)制原料：模板DNA；RNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后

4、RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增退回步驟(3)人工合成：人工合成：適用于核苷酸序列已知的較小基因二基因表達(dá)載體的構(gòu)建二基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。為什么要有“表達(dá)載體的構(gòu)建”這一步？ 單獨(dú)的DNA片段目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。構(gòu)建表達(dá)載體的目的是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。 2基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn):即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。啟動子：位于基因首端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄基因。終止子

5、：位于基因尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因。復(fù)制原點(diǎn)+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因 目的基因：即圖中所示插入基因3方法： 選擇一定的限制酶分別切割分子運(yùn)輸車和目的基因，是兩者有相同的黏性末端，再用DNA連接酶把兩者連接。4條件：適宜的限制酶、DNA連接酶、ATP（目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因）退回步驟為什么要有“目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”這一步？ 含有目的基因的表達(dá)載體只有進(jìn)入受體細(xì)胞，并且維持穩(wěn)定和表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。 三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞

6、內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。 導(dǎo)入植物細(xì)胞：原理:利用農(nóng)桿菌（胞內(nèi)寄生菌）對植物的感染而把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。過程：目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞穩(wěn)定維持和表達(dá)（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：（3）花粉管通道法（2）基因槍法 又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。 就是在植物授粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA(含目的基因），使目的基因借助花粉管進(jìn)入受體細(xì)胞。導(dǎo)入動物細(xì)胞：顯微注射法：目的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育新性狀動物導(dǎo)入微生物細(xì)胞：Ca2+處理細(xì)胞感

7、受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子退回步驟四目的基因的檢測和鑒定為什么要有“目的基因的檢測與鑒定”這一步？ 這是因?yàn)槟康幕蚴欠裾嬲迦胧荏w細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢測、鑒定才能得知。 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶。還可以進(jìn)行個體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交；抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的。 檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技

8、術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。檢測是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。返回首頁退回步驟小結(jié)：小結(jié)：目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的監(jiān)測與鑒定1.從自然界中已有的物種中分離出來: 從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增2.用人工的方法合成要點(diǎn)：用一定限制酶將目的基因與質(zhì)粒切出相同黏性末端受體細(xì)胞種類：動植物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌等導(dǎo)入方法： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca處理細(xì)胞法等2.檢測方法：分子檢測法和都是DNA分子雜交技術(shù)，抗

9、原抗體雜交法形態(tài)檢測法可根據(jù)目標(biāo)性狀的有無來判斷目的基因是否表達(dá)1.檢測對象：檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)返回首頁課堂練習(xí)：1、下列屬于獲取目的基因的方法的是（ ）利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A BCD一、選擇題：D2.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95下使模板DNA變性、解鏈55下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）72下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過程的敘

10、述中不正確的是（ ）A變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對原則完成C延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸DPCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高C4. 不屬于目的基因與運(yùn)載體結(jié)合過程的是( )A用一定的限制酶切割質(zhì)粒，露出黏性末端B用同種限制酶切割目的基因，露出黏性末端C將切下的目的基因插入到質(zhì)粒的切口處D將重組DNA引入到受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增D3下列哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( )A啟動子 B終止密碼C標(biāo)記基因 D目的基因B5基因工程中常用的受體細(xì)胞不包括 ( )A人體細(xì)胞 B動物

11、細(xì)胞 C植物細(xì)胞 D微生物細(xì)胞A6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 ( )A基因槍法 B顯微注射法 C農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法B7.分辨基因工程是否成功是通過 ( )A提取目的基因 B基因表達(dá)載體的構(gòu)建C目的基因?qū)耸荏w細(xì)胞 D目的基因的檢測與鑒定8要檢測目的基因是否成功的插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指 ( ) A用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段DB二、非選擇題： 將動物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動物獲得免力。右圖是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖和表。 請根據(jù)以上圖表回答下列問題。（1）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是 。（2）PCR過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計的兩對引物序列，圖2為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？ 。（3）圖1步驟所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？ 。（4）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟轉(zhuǎn)基因所用的細(xì)菌B通常為 。（5）對符合