植物原生質(zhì)體融合技術(shù)

1、第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)Plant Protoplast Fusion What 基本原理基本原理 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用 How 技術(shù)方法技術(shù)方法微微 絲絲葉綠體葉綠體線粒體線粒體質(zhì)質(zhì) 膜膜液液 泡泡細胞核細胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微微 管管細胞壁細胞壁高爾基體高爾基體細胞壁由三種主要成分構(gòu)成細胞壁由三種主要成分構(gòu)成纖維素纖維素25-50%、半纖維素半纖維素53%和果膠和果膠5% What 基本原理基本原理 去除植物細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體去除植物細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細胞誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細胞 篩選，培養(yǎng)，促進雜種細胞分裂，

2、分化篩選，培養(yǎng)，促進雜種細胞分裂，分化 從細胞團，愈傷組織到最后成株從細胞團，愈傷組織到最后成株 Why 技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用植物原生質(zhì)體融合的意義：克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細胞創(chuàng)造條件 How 技術(shù)方法技術(shù)方法第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)Plant Protoplast Fusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合一、植物原生質(zhì)體的制備一、植物原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義 原生質(zhì)體材料來源原生質(zhì)體材料來

3、源 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體的純化原生質(zhì)體的純化1 1、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義、原生質(zhì)體的概念及培養(yǎng)的意義 概念：概念： 除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質(zhì)體 意義：意義：（1）植物原生質(zhì)體，具有再生完整植株的力。（2）為細胞融合研究提供了可能。有可能產(chǎn)生異源雜交新品種。（3）由于除去了細胞壁，降低了細胞的DNA酶活性，從而有助于外源DNA的進入。為再生成具有新性狀的植物體提供有利條件。（4）是開展遺傳理論研究的材料。植物原生質(zhì)體在理論研究和細植物原生質(zhì)體在理論研究和細胞工程中的地位胞工程中的地位融合產(chǎn)生體細胞雜種融合產(chǎn)生體細胞雜種分離各種細胞器分離各種細胞器引入各種細胞器

4、引入各種細胞器導(dǎo)入外源基因?qū)胪庠椿蛘T發(fā)突變體誘發(fā)突變體純化后的葉肉原生質(zhì)體純化后的葉肉原生質(zhì)體2 2、原生質(zhì)體材料來源、原生質(zhì)體材料來源 植物葉片植物葉片取材容易取材容易比較容易用酶解法分離比較容易用酶解法分離 植物根尖組織植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后取得可由各種植物的種子萌發(fā)后取得 植物花粉植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體 愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞細胞壁容易解離細胞壁容易解離3 3、原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的分離A、原生質(zhì)體的分離方法原生質(zhì)體的分離方法 機械分離法機械分離法先將細胞放在高滲溶液中預(yù)處理，待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原體質(zhì)體收縮成球形

5、式，再用機械法磨碎細胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質(zhì)體。優(yōu)點：優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。缺點：缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少。 酶解分離法酶解分離法常用的細胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等優(yōu)點：優(yōu)點：可以獲得大量的原生質(zhì)體，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。缺點缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。影響所獲原生質(zhì)體的活力。B、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素1）不同種類植物或不同組織和細胞，其細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)有差異有差異2）滲透壓穩(wěn)定劑：滲透壓穩(wěn)

6、定劑：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類（KCl,MgSO4.7H2O)等3）質(zhì)膜穩(wěn)定劑：質(zhì)膜穩(wěn)定劑：如葡聚糖硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀等增加對質(zhì)膜的穩(wěn)定性4）酶液的酶液的pH值：值：一般在5.4-6.05）溫度因子溫度因子6）植物材料的生理狀態(tài)：植物材料的生理狀態(tài)：如株齡、發(fā)育狀態(tài)、栽培條件等對取材影響很大C、分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑、分離原生質(zhì)體所用的酶液和穩(wěn)定劑 煙草葉肉細胞：煙草葉肉細胞：0.5% Macerozyme R-10果膠酶+2% Onozuka R-10纖維素酶，0.7M 甘露醇。 煙草懸浮細胞：煙草懸浮細胞： 2% Driselase纖維素酶+2% Cellusa

7、se纖維素酶+ 0.5% Macerozyme果膠酶；海水。 胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的細胞：胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的細胞：2% Onozuka纖維素酶+0.5% Driselase纖維素酶+0.5% Rhoxyme半纖維素酶1% Pectinase果膠酶；0.35M甘露醇+ 0.35M 山梨醇 甘藍等的根細胞：甘藍等的根細胞：4% Maicelase纖維素酶+2% Rhozyme半纖維素酶+0.3% Macerozyme果膠酶； 0.7M 甘露醇。 番茄無菌苗的子葉和葉肉細胞：番茄無菌苗的子葉和葉肉細胞：1.5% Cellulysin 纖維素酶+0.3% Macerozyme果膠酶；102.6g/L 蔗糖。

8、水稻種子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細胞：水稻種子的愈傷組織的懸浮培養(yǎng)細胞：2% Onozuka Rs 纖維素酶+1% Driselase 纖維素酶+2% Macerozyme R-10果膠酶+1% Pectolyase果膠酶 ；0.3M 葡萄糖4 4、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體的純化 去除破碎的原生質(zhì)體、末去壁的細胞、細胞器及其他碎片等雜質(zhì)A、過濾法、過濾法B、漂浮法、漂浮法C、離心法、離心法與分離試劑相與分離試劑相同同與分離試劑相同與分離試劑相同F(xiàn)DA法的原理法的原理vFDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細胞膜自由出入細胞膜。v在在活活細胞中，細胞中，F(xiàn)

9、DA被酯酶被酯酶裂解裂解，釋放出有，釋放出有極極性的熒光素性的熒光素。v熒光素熒光素不能自由穿越不能自由穿越質(zhì)膜，在活細胞中積累。質(zhì)膜，在活細胞中積累。v熒光素在熒光素在死細胞中不能積累死細胞中不能積累。v在在UV照射下照射下，活細胞中的熒光素發(fā)出，活細胞中的熒光素發(fā)出綠色熒綠色熒光光。FDA熒光素熒光素活細胞活細胞死細胞死細胞請思考請思考活細胞活細胞死細胞死細胞FDA先用丙酮配成先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為的母液，終濃度為0.01%原生質(zhì)體分離純化流程圖原生質(zhì)體分離純化流程圖第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)Plant Protoplast Fusion 植物

10、原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合二、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)二、植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)1 1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法2 2、原生質(zhì)體培養(yǎng)程序、原生質(zhì)體培養(yǎng)程序3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法 原生質(zhì)體按照一定細胞起始密度，均勻分布于薄層固體培養(yǎng)基中 此法優(yōu)點有利于對單個原生質(zhì)體的胞壁再生和對細胞團形成的全過程進行定點觀察 淺層液體培養(yǎng)法：淺層液體培養(yǎng)法：在培養(yǎng)皿或三角瓶中注入34ml原生質(zhì)體培養(yǎng)液，然后將純凈的原生質(zhì)體，按一定的細胞密度注入并進行培養(yǎng) 雙層培養(yǎng)法

11、雙層培養(yǎng)法在固體培養(yǎng)基上，加入適宜原生質(zhì)體胞壁再生和細胞分裂的液體培養(yǎng)基1 1、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法、原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法2 2、原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序、原生質(zhì)體的培養(yǎng)程序細胞壁再生：細胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細胞壁開始合成，細胞由球形變成橢圓形。細胞分裂形成細胞團：細胞分裂形成細胞團： 一般在培養(yǎng)2-3天后細胞質(zhì)增加，細胞器增殖，DNA、蛋白質(zhì)等合成增加，細胞分裂，形成小的細胞團，發(fā)育成愈傷組織或胚狀體。器官形成植株再生：器官形成植株再生： 從愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生 胚狀體發(fā)育3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵、原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的技術(shù)關(guān)鍵 原生質(zhì)體的活力原生質(zhì)體的活力 影響因素：制備原生

12、質(zhì)體的方法，滲透壓穩(wěn)定劑種類、濃度，質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類、濃度，溫度和保溫時間 原生質(zhì)體密度原生質(zhì)體密度 起始密度一般為104-105 個/mL 細胞壁再生速度細胞壁再生速度 植物種類和取材的生理狀態(tài)；培養(yǎng)細胞所處的時期；酶解時所用質(zhì)膜穩(wěn)定劑種類 原生質(zhì)體培養(yǎng)的營養(yǎng)和環(huán)境原生質(zhì)體培養(yǎng)的營養(yǎng)和環(huán)境 培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)的環(huán)境：光照、溫度、濕度第第1616章章 植物原生質(zhì)體融合技術(shù)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)Plant Protoplast Fusion 植物原生質(zhì)體的制備植物原生質(zhì)體的制備 植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng) 植物原生質(zhì)體的融合植物原生質(zhì)體的融合回顧：動物細胞融合技術(shù)簡介回顧：動物細胞融合技

13、術(shù)簡介親本的來源親本的來源融合方法融合方法融合細胞的篩選融合細胞的篩選融合細胞的克隆融合細胞的克隆融合細胞的鑒定融合細胞的鑒定三、植物原生質(zhì)體的融合三、植物原生質(zhì)體的融合1 1、植物細胞融合的概念和意義、植物細胞融合的概念和意義2 2、植物細胞融合的程序、植物細胞融合的程序3 3、誘導(dǎo)細胞融合的方法及融合劑、誘導(dǎo)細胞融合的方法及融合劑4 4、細胞融合的影響因素、細胞融合的影響因素5 5、細胞雜種的選擇和鑒定、細胞雜種的選擇和鑒定1 1、植物細胞融合的概念和意義、植物細胞融合的概念和意義 細胞融合細胞融合(cell fusion)(cell fusion)概念：概念： 又稱細胞雜交(cell h

14、ybridizaion)：離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術(shù)。 細胞融合的意義：細胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子滲入細胞創(chuàng)造條件2 2、植物細胞融合的程序、植物細胞融合的程序 原生質(zhì)體分離的分離、純化原生質(zhì)體分離的分離、純化 融合方法選擇融合方法選擇 雜種細胞的篩選雜種細胞的篩選愈傷組織形成器官分化植株再生愈傷組織形成器官分化植株再生雜種植物的鑒定雜種植物的鑒定3 3、誘導(dǎo)、誘導(dǎo)原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合的方法及融合劑融合的方法及融合劑 鹽類融合法 高Ca2+和高pH值融合 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG與高C

15、a2+和高pH值結(jié)合融合法 電融合法回顧：誘導(dǎo)動物細胞融合的方法回顧：誘導(dǎo)動物細胞融合的方法1 1、病毒誘導(dǎo)細胞融合、病毒誘導(dǎo)細胞融合2 2、化學(xué)融合劑誘導(dǎo)細胞融合、化學(xué)融合劑誘導(dǎo)細胞融合3 3、電融合法、電融合法A. 鹽類融合法鹽類融合法 鹽類融合劑種類鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2氯化物類：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉 鹽類融合的優(yōu)缺點鹽類融合的優(yōu)缺點優(yōu)點：鹽類融合劑對原生質(zhì)體的活力破壞力小缺點：融合頻率低，對液泡化發(fā)達的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合B. 高高Ca2+和高和高pH值融合值融合

16、Ca2+濃度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5具體做法具體做法( (以煙草為例以煙草為例) ) 取分離、純化好的兩種親本原生質(zhì)體以1:1的比例混合; 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; 再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10.5，成為融合液，同時在37下保溫0.5h; 用0.4mol/L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值； 兩種原生質(zhì)體的融合率達到10%。C. 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相對分子量200-20000之間 融合機制融合機

17、制：可能是由于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著結(jié)合 用相對分子質(zhì)量為1540的PEG處理40-50 min；再用培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核體D. PEG與高與高Ca2+和高和高pH值結(jié)合融合法值結(jié)合融合法 先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋） 然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG；（引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進了融合） 再用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高pH值PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程E. 電融合法電融合法 原理：原理： 改變原生質(zhì)體質(zhì)

18、膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 優(yōu)點：優(yōu)點： 對原生質(zhì)體的損害小，融合率高，重復(fù)性強；裝置精巧、方便簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程，誘導(dǎo)過程可控性強。電融合基本過程1. 將制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室，微電極型只有一個小室，平行電極型有4個小室，兩電極間隔3mm，整個裝置放在一個培養(yǎng)皿中2. 微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生質(zhì)體在幾秒到幾十秒鐘的時間內(nèi)會發(fā)生暫時性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個個泡囊，經(jīng)點連接到面連接

19、，最后形成融合體,整個過程約10-30分3. 平行多電極融合裝置法：經(jīng)過1兆赫如150V/cm交流電場發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場力的作用下，極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀。在適當時間和強度的直流電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜發(fā)生被擊穿，進一步形成融合體細胞電融合過程細胞電融合過程原生質(zhì)體的融合過程包括原生質(zhì)體的融合過程包括3 3個主要階段個主要階段：1)兩個或多個原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；兩個或多個原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2)2)局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合；3)3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。融合完成，形成球形的異核

20、體或同核體。4 4、細胞融合的影響因素、細胞融合的影響因素 PEGPEG誘導(dǎo)法：誘導(dǎo)法：PEG規(guī)格、純度，作用時間 電誘導(dǎo)法：電誘導(dǎo)法：原生質(zhì)體密度交流電壓 交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù) 5 5、雜種細胞的選擇和鑒定、雜種細胞的選擇和鑒定A、融合體的類型、融合體的類型B、雜種細胞選擇的方法、雜種細胞選擇的方法C、細胞雜種的鑒定、細胞雜種的鑒定A、融合體的類型、融合體的類型 自體融合：自體融合：發(fā)生在親本原生質(zhì)體自身 異體融合異體融合諧和的細胞雜種諧和的細胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細胞雜種部分諧和的細胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)

21、生少量染色體的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質(zhì)體細胞雜種異胞質(zhì)體細胞雜種：親本的染色體全部被排斥，但胞質(zhì)是雙親的嵌合細胞雜種嵌合細胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體，發(fā)生了膜融合和胞質(zhì)融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細胞壁，最終形成嵌合體植物B、雜種細胞選擇的方法、雜種細胞選擇的方法 互補選擇法互補選擇法( (遺傳或抗性遺傳或抗性) )： 選擇一個葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養(yǎng)基上，能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限定培養(yǎng)基上，則不能分裂形成大細胞團（愈傷組織） 可見標記法：可見標記法： 凹穴培養(yǎng)皿分離法：根據(jù)融合后異核體和親本原生質(zhì)體的形態(tài)特征之區(qū)別 微吸管分離法：用一種向吸管根據(jù)可見標記吸取異核體，進行“看護培養(yǎng)”，以獲得雜種植物 生長特性選擇法：生長特性選擇法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細胞。 物理特性選擇法：物理特性選擇法：利用親本原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種。 其他方法：其他方法：如采用顯微操作技術(shù)也能把單個異核體分離出來進行培養(yǎng)。異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）和和異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出分別發(fā)出綠色綠色和和紅色紅色 熒光染料法熒光染料法兩個親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光兩個親本原生質(zhì)體在融合