實(shí)用HPLC方法的建立

1、3 選 擇 儀 器 類(lèi) 型 ， 確 定 檢 測(cè) 器 及 其 參 數(shù)2 是 否 需 要 樣 品 預(yù) 處 理 ， 是 否 有 特 殊 的 步 驟1 了 解 樣 品 的 有 關(guān) 情 況 ， 明 確 分 析 目 的7 a 回 收 純 化 物 質(zhì)8 方 法 論 證 進(jìn) 入 常 規(guī) 實(shí) 驗(yàn) 室7 b 定 量 校 正7 c 定 性 方 法6 檢 查 出 現(xiàn) 的 各 種 現(xiàn) 象 和 問(wèn) 題 ( 包 括 儀 器 、 樣 品 穩(wěn) 定 性 等 ） 選 擇 解 決 辦 法 和 特 殊 步 驟5 優(yōu) 化 分 離 條 件 ， 選 擇 最 佳 檢 測(cè) 器 參 數(shù) 、 色 譜 柱 、 流 動(dòng) 相 比 例 等4 選 擇 液 相

2、 色 譜 分 離 類(lèi) 型 ， 色 譜 柱 ， 流 動(dòng) 相 ， 其 他 相 關(guān) 條 件 （ 如 波 長(zhǎng) 等 ） ， 進(jìn) 行 預(yù) 實(shí) 驗(yàn) ， 估 計(jì) 最 佳 條 件n色譜柱的修復(fù)和再生 -化學(xué)變化 IInExample: 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate: 1 mL / min; Temp: 80 A: 0.1% TFA in water B: 0.1% TFA in acetonitrile 100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return

3、to 100% A in 5 min. Repeat 3 times。n6M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積。n有機(jī)聚合物等填料可使用高pH 水溶液 /有機(jī)溶液，如： n0.01M NaOH 50% 異丙醇 /水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時(shí)間 (15-30 min)。4.1 4.1 等度分析等度分析色譜柱：C18，4mm30mm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min.樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Parab

4、en)60/4050/5040/6062:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）124356789 10 1110分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)平衡時(shí)間6分鐘平衡時(shí)間7分鐘平衡時(shí)間8分鐘平衡時(shí)間9分鐘平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說(shuō)明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。50ml超純水的有機(jī)物污染狀態(tài)“三蒸水”有大量的有機(jī)污染物不適合梯度分析典型的“實(shí)驗(yàn)室水”有大量的有機(jī)污

5、染物不適合高靈敏度梯度分析n開(kāi)發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100% 水-乙腈)，分離不理想。整個(gè)色譜峰組保留時(shí)間太長(zhǎng)，分離度也不好為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說(shuō)明有雜質(zhì)存在，很可能是流動(dòng)相水中的。 從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測(cè)靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說(shuō)明流動(dòng)相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有影響。 空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對(duì)第8個(gè)色譜峰有干擾，會(huì)使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。 根據(jù)“梯度曲線(xiàn)下的面積越大，

6、洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線(xiàn)使3-9號(hào)峰提前(曲線(xiàn)5，50-100%B)，但是小峰仍沒(méi)有分出來(lái)。 根據(jù)“梯度曲線(xiàn)下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線(xiàn)使3-9號(hào)峰提前，改用50-95%B見(jiàn)到好的現(xiàn)象。最后用50-90%B，曲線(xiàn)4，得到好的結(jié)果。nHPLC HPLC 條件條件- - 試驗(yàn)試驗(yàn) 2 2Column: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mm1. 尿嘧啶2. 3-丁基吡啶3. 苯酚4. 4-苯基丁酸5. N,N-二乙基間甲苯酰胺 (DEET)6. 1,4二羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯Column: Adsorbosphere C18, 5m, 15

7、0 x 4.6mmColumn: Alltima C18, 5m, 150 x 4.6mmColumn: Adsorbosphere C18, 5m, 150 x 4.6mm1. 尿嘧啶2. 苯酚3. 4-苯基丁胺4. N,N-二乙基間甲苯酰胺5. 3-丁基吡啶6. 1,4二羥基蒽醌7. 丙基苯8. 丁基苯可能產(chǎn)生的原因及處理辦法1 流動(dòng)池臟，用極性試劑清洗。當(dāng)有填料進(jìn)入，拆開(kāi)流通池。2 檢測(cè)器燈有問(wèn)題，如能量偏低，更換氘燈。3 周期性的波動(dòng)，則起源于泵的脈沖，檢修泵或更換墊片等。4 溫度對(duì)檢測(cè)器的影響，控制溫度。5 氣泡經(jīng)過(guò)檢測(cè)器，用大流量沖洗。6 流動(dòng)相本底高，如水的純度不夠，換超純水?；蛟噭┘兌炔?夠， 換色譜純的試劑。7 注意數(shù)據(jù)采樣和連接問(wèn)題。Time (min.)1 柱中的流動(dòng)相沒(méi)有平衡，延長(zhǎng)平衡時(shí)間，尤其在流動(dòng)相中添加了有 紫外吸收的添加劑。2 在梯度洗脫中，基線(xiàn)上漂是正常的，在空白梯度中