第七章蛋白質(zhì)的分離純化

1、第七章第七章 蛋白質(zhì)的性質(zhì)和分離純化蛋白質(zhì)的性質(zhì)和分離純化Properties and Purification of Protein目的：目的： 1.1.研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)； 2.2.研究蛋白質(zhì)的生物功能；研究蛋白質(zhì)的生物功能； 3.3.蛋白質(zhì)應(yīng)用。蛋白質(zhì)應(yīng)用。方法方法: : 利用各種性質(zhì)差別。利用各種性質(zhì)差別。第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)v蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)v蛋白質(zhì)等電點蛋白質(zhì)等電點v蛋白質(zhì)在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，蛋白質(zhì)在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點在偏堿溶液中帶

2、負(fù)電荷，在等電點pHpH時時為兩性離子。蛋白質(zhì)溶液處于等電點時，為兩性離子。蛋白質(zhì)溶液處于等電點時，溶解度最??；粘度、滲透壓、膨脹性及溶解度最??；粘度、滲透壓、膨脹性及導(dǎo)電能力也降為最低值。導(dǎo)電能力也降為最低值。蛋白質(zhì)在等電點的溶解度最小蛋白質(zhì)在等電點的溶解度最小疏水區(qū)域疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)v等離子點：在沒有其他鹽類干擾時，蛋等離子點：在沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)白質(zhì)質(zhì)子供體基團解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的子受體基團結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH,pH,為為蛋白質(zhì)特征常數(shù)。蛋白質(zhì)特征常數(shù)。v蛋白質(zhì)相對分子量在蛋

3、白質(zhì)相對分子量在600060001 000 0001 000 000之之間。測定分子量的主要方法有化學(xué)組成法、間。測定分子量的主要方法有化學(xué)組成法、滲透壓法、超離心法（沉降分析法）、凝滲透壓法、超離心法（沉降分析法）、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。二、蛋白質(zhì)分子量及其確定方法二、蛋白質(zhì)分子量及其確定方法v化學(xué)組成法化學(xué)組成法: : 最低最低M=M=元素元素( (分子分子) )分子量分子量/ / 元素元素( (分子分子) )百分含量百分含量 v滲透壓法滲透壓法: Mr=cRT: Mr=cRT/ / v超離心法超離心法: Mr: Mr=RTs/(1-)D =RT

4、s/(1-)D v凝膠過濾凝膠過濾: : logMrlogMr =K=K1 1- - K K2 2V Ve evSDSSDSPAGEPAGE法法: logMr: logMr=-b=-bR R v氨基酸序列分析計算氨基酸序列分析計算 元素原子量元素原子量(分子分子量分子分子量 )v最低相對分子量最低相對分子量= 元素元素(分子分子)百分含量百分含量肌紅蛋白含鐵量為肌紅蛋白含鐵量為0.335%，其最低分子量可，其最低分子量可按下式算出：按下式算出： Fe原子量原子量(55.8 )v最低相對分子量最低相對分子量= Fe元素百分含量元素百分含量 (0.335%) =16700化學(xué)組成測定最低相對分子量

5、化學(xué)組成測定最低相對分子量v真實分子量是最低相對分子質(zhì)量的真實分子量是最低相對分子質(zhì)量的n n倍，倍，這里這里n n是每個蛋白質(zhì)分子中鐵原子的數(shù)目。是每個蛋白質(zhì)分子中鐵原子的數(shù)目。因為肌紅蛋白中，因為肌紅蛋白中，n nl l，所以其真實，所以其真實M Mr r就就是是1670016700。又如血紅蛋白含鐵也是。又如血紅蛋白含鐵也是0.335%0.335%，即最低即最低M Mr r亦為亦為1670016700，但根據(jù)其他方法測得，但根據(jù)其他方法測得的的M Mr r是是6800068000?？梢娒恳环肿友t蛋白含有?？梢娒恳环肿友t蛋白含有四個鐵原子，即四個鐵原子，即n n4 4，因此其真實，因此

6、其真實M Mr r16700167004 = 668004 = 66800。v有時蛋白質(zhì)分子中某一氨基酸的含量特別少，有時蛋白質(zhì)分子中某一氨基酸的含量特別少，應(yīng)用同樣的原理，由這一氨基酸含量的分析應(yīng)用同樣的原理，由這一氨基酸含量的分析結(jié)果，也可以計算蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)結(jié)果，也可以計算蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)量。量。v例如牛血清清蛋白含色氨酸例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，計算所，計算所得的最低相對分子質(zhì)量是得的最低相對分子質(zhì)量是35200。用其他方。用其他方法測得的法測得的Mr是是69000，所以每分子牛血清清，所以每分子牛血清清蛋白含有兩個色氨酸殘基。蛋白含有兩個色氨酸殘基。滲透壓法滲

7、透壓法v滲透壓是溶液的依數(shù)性滲透壓是溶液的依數(shù)性質(zhì)之一質(zhì)之一, ,是單位體積內(nèi)溶是單位體積內(nèi)溶質(zhì)質(zhì)點數(shù)的函數(shù)質(zhì)質(zhì)點數(shù)的函數(shù), ,與溶質(zhì)與溶質(zhì)的性質(zhì)和形狀無關(guān)。的性質(zhì)和形狀無關(guān)。v唐南平衡影響滲透壓測定。唐南平衡影響滲透壓測定。v盡量采用接近等電點的緩沖液作膜內(nèi)外盡量采用接近等電點的緩沖液作膜內(nèi)外的溶劑，并增加緩沖液中無機鹽的濃度。的溶劑，并增加緩沖液中無機鹽的濃度。沉降速度法沉降速度法FcFbFfv蛋白質(zhì)在離心場中沉降時蛋白質(zhì)在離心場中沉降時: :vF Fc c( (離心力離心力) ) = m mp p2（離心加速度）離心加速度）vF Fb b( (浮力浮力) ) = V Vp p2 = m

8、mp p2vF Ff f( (摩擦力摩擦力) ) = f f= f(d f(d/dt/dt) )v通過測定沉降界面的移動速度測定通過測定沉降界面的移動速度測定Mr. dx/dtMr. dx/dt為為常數(shù)常數(shù)v F Fc c- F- Fb b = F Ff fv (d (d/dt/dt) m) mp p（1-1-） 2 f f=v沉降系數(shù)：單位離心力場的沉降速度叫沉降系數(shù)，沉降系數(shù)：單位離心力場的沉降速度叫沉降系數(shù)，用用s s表示。表示。 s=(dx/dt)/s=(dx/dt)/2 2= m= mp p(1-)/f(1-)/f 沉降系數(shù)只與分子的大小和形狀有關(guān)，當(dāng)分子形沉降系數(shù)只與分子的大小和形

9、狀有關(guān)，當(dāng)分子形狀相似時，狀相似時，s s與分子量成正比。因此與分子量成正比。因此s s常用作生物常用作生物大分子的大小表示方法。大分子的大小表示方法。 v由于由于s s值較小，因此用值較小，因此用1 11010-13-13秒表示秒表示1 1個沉降系個沉降系數(shù)單位（數(shù)單位（ Svedberg unitSvedberg unit）。）。S S值與溫度和溶劑值與溫度和溶劑有關(guān)，所以，一個分子的沉降系數(shù)定義為攝氏有關(guān)，所以，一個分子的沉降系數(shù)定義為攝氏2020度，水溶液條件下的度，水溶液條件下的s s值為標(biāo)準(zhǔn)。值為標(biāo)準(zhǔn)。 1S=11S=11010-13-13（s s）v由于蛋白質(zhì)分子的沉降速度同時受

10、到分子的大小由于蛋白質(zhì)分子的沉降速度同時受到分子的大小和形狀的影響，大小與質(zhì)量有關(guān)、而形狀與其擴散和形狀的影響，大小與質(zhì)量有關(guān)、而形狀與其擴散系數(shù)有關(guān)：系數(shù)有關(guān)： m mp p = Mr= Mr/N /N f = RT/ND f = RT/ND （愛因斯坦（愛因斯坦- -薩德蘭德方程）薩德蘭德方程） s = ms = mp p(1-)/f(1-)/f Mr = RTsD（1 ）v是溶劑的密度（是溶劑的密度（g/cmg/cm3 3）；）；是蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)的偏微比容（即當(dāng)加入的偏微比容（即當(dāng)加入1g1g干物質(zhì)于無限大干物質(zhì)于無限大體積的溶劑中時溶液體積的增量）（蛋白體積的溶劑中時溶液體積的增量）（

11、蛋白質(zhì)溶于水的偏微比容約為質(zhì)溶于水的偏微比容約為0.74 cm0.74 cm3 3/g/g）；）；R R是氣體常數(shù)（是氣體常數(shù)（8.314 J/(Kmol8.314 J/(Kmol) )）；）；T T是是絕對溫度（絕對溫度（K K）；）；s s為沉降系數(shù)；為沉降系數(shù)；D D是擴散是擴散系數(shù)。系數(shù)。v凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)。不論是天然凝膠還是人工合成的凝膠，不論是天然凝膠還是人工合成的凝膠，它們的內(nèi)部都具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)它們的內(nèi)部都具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析的機理是分子篩效應(yīng)構(gòu)。凝膠層析的機理是分子篩效應(yīng)( (又稱又稱分子篩層析分子篩層

12、析) )，如同過篩那樣，它可以把，如同過篩那樣，它可以把物質(zhì)按分子大小不同進行分離，但這種物質(zhì)按分子大小不同進行分離，但這種“過篩過篩”與普通的過篩不一樣。與普通的過篩不一樣。 凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量分子篩層析的工作原理分子篩層析的工作原理v在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進人凝膠顆粒內(nèi)部的多孔而小分子可以進人凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以致最后流出柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)外，從而使樣品中分

13、子大小不同的物質(zhì)得到分離。得到分離。 A.A.小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過。間迅速通過。B.(1)B.(1)蛋白質(zhì)混合物上柱；蛋白質(zhì)混合物上柱； (2)(2)洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)，大分子則被排阻在顆粒之外，大小分子開始分開；分子則被排阻在顆粒之外，大小分子開始分開； (3)(3)小分子被滯留，大分子向下移動，大小分小分子被滯留，大分子向下移動，大小分子完全分開；子完全分開； (4)(4)大分子行程較短，

14、已洗脫出層析柱，小分大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。子尚在行進中。 V Vt t-V-Vo o 或或V Vi i+V+Vm mV Vt tV Vo ovV Vo o：外水體積，可用不被凝膠滯留的大分子物：外水體積，可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液質(zhì)的溶液( (最好有顏色以便于觀察，如血紅蛋最好有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約白，印度黑墨水，分子量約200200萬的藍(lán)色葡聚萬的藍(lán)色葡聚糖一糖一20002000等等) )通過實驗測量求出。通過實驗測量求出。vV Vi i：內(nèi)水體積，可：內(nèi)水體積，可由由gWgWR R求得求得(g(g為干凝膠重，為干凝膠重，W W

15、R R為凝膠的為凝膠的“吸水量吸水量”，以，以mLmLg g表示表示) )。vV Vm m ：凝膠基質(zhì)體積。：凝膠基質(zhì)體積。vV Vt t：總體積。：總體積。 V Vt t = V = Vm m + V + Vo o + V + Vi ivV Ve e：為洗脫體積。：為洗脫體積。分配系數(shù)分配系數(shù)K Kd dv可以把凝膠層析看成是液可以把凝膠層析看成是液- -液分配層析。液分配層析。固定相是凝膠珠內(nèi)部水相（固定相是凝膠珠內(nèi)部水相（V Vi i），流動相），流動相是凝膠外部水相（是凝膠外部水相（V Vo o）。）。K Kd d為樣品在兩相為樣品在兩相間的分配系數(shù)，也可以說間的分配系數(shù)，也可以說K

16、Kd d是分子量不同是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)，只的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)，只與被分離物分子的大小和凝膠顆粒孔隙的與被分離物分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的粗細(xì)長短無關(guān)，大小分布有關(guān)，而與柱的粗細(xì)長短無關(guān)，也就是說它對特定物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物也就是說它對特定物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理條件無關(guān)。理條件無關(guān)。v K Kd d=(V=(Ve e-V-Vo o)/V)/Vi i vK Kd d可以有下列幾種情況：可以有下列幾種情況：v(1)(1)當(dāng)當(dāng)K Kd d=O=O時，則時，則V Ve e=V=Vo o，即對于根本不能進入凝，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子

17、物質(zhì)膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)( (全排阻全排阻) )，洗脫體積等于空，洗脫體積等于空隙容積隙容積( (組分組分I)I)。v(2)(2)當(dāng)當(dāng)K Kd d=1=1時，時，V Ve e=V=Vo o+V+Vi i，即小分子可完全滲入凝，即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為外水體積與內(nèi)水體積之膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為外水體積與內(nèi)水體積之和和( (組分組分)。 (3)(3)當(dāng)當(dāng)0K0Kd d111，表示凝膠對組分有吸附作用，此時，表示凝膠對組分有吸附作用，此時V Ve eVVo o+V+Vi i，例如一些芳香族化合物的洗脫容積，例如一些芳香族化合物的洗脫容積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值，這些化合物的遠(yuǎn)超出理論計

18、算的最大值，這些化合物的K Kd d11，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在SephadexSephadex G- G-2525中的中的K Kd d值分別為值分別為1.21.2，1.41.4和和2.22.2。v已知已知 K Kd d= =（V Ve e-V-Vo o）/V/Vi i，將，將V Vt t-V-Vo o代替代替V Vi i， 則則K Kavav= =（V Ve e-V-Vo o）/ /（V Vt t-V-Vo o） 即即 V Ve e= V= Vo o+ K+ Kavav（V Vt t-V-Vo o）v實際上，將原來以水作為固定相實際上，將原來以水作為固定相(

19、V(Vi i) )改為水與改為水與凝膠顆粒凝膠顆粒(V(Vt t-V-Vo o) )作為固定相，而洗脫劑作為固定相，而洗脫劑(V(Ve e-V-Vo o) )作為流動相。作為流動相。K Kavav與與K Kd d對交聯(lián)度小的凝膠差別較對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。v在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當(dāng)流動相流過當(dāng)流動相流過V Vt t體積后，所有的組分都應(yīng)該被體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，這一點為凝膠層析法的特點。洗出來，這一點為凝膠層析法的特點。有效分配系數(shù)有效分配系數(shù)K KavavlogM

20、rlogMr =K=K1 1- - K K2 2V Ve eSDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGESDS-PAGE）測定分子量測定分子量 vSDSSDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，可破壞蛋白質(zhì)氫鍵和疏水作用使蛋白質(zhì)變性。可破壞蛋白質(zhì)氫鍵和疏水作用使蛋白質(zhì)變性。vSDSSDS帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合（帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合（1.41.4克克SDS/1SDS/1克蛋白質(zhì)）后，克蛋白質(zhì)）后，SDSSDS的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)

21、分子原有的電荷就變得無足輕重了，所以在電場上移動的速度完全變得無足輕重了，所以在電場上移動的速度完全取決于蛋白質(zhì)分子的大小。取決于蛋白質(zhì)分子的大小。v在在SDSSDS和巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)和亞基的肽鏈和巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)和亞基的肽鏈完全伸展成長棒狀（完全伸展成長棒狀（1.8nm1.8nm），其分子量與肽鏈的），其分子量與肽鏈的長度成比例。長度成比例。 logMlogM = a-b = a-bR三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)v具有膠體的一切特性（布郎運動、丁達具有膠體的一切特性（布郎運動、丁達爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能力）力）v親水膠體穩(wěn)

22、定性親水膠體穩(wěn)定性 ：（：（1 1）直徑）直徑1-100nm1-100nm；（2 2）水化層（）水化層（3 3）雙電層）雙電層v溶膠（蛋白質(zhì)顆粒分散在水中）、凝膠溶膠（蛋白質(zhì)顆粒分散在水中）、凝膠（水分散在蛋白質(zhì)顆粒中）（水分散在蛋白質(zhì)顆粒中） 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)v蛋白質(zhì)溶液是一種膠體溶液；蛋白質(zhì)溶液是一種膠體溶液；v特定的空間構(gòu)象，分子量一定特定的空間構(gòu)象，分子量一定 分子篩分子篩層析；層析；v在大部分在大部分pHpH條件下，蛋白質(zhì)分子同時存在兩條件下，蛋白質(zhì)分子同時存在兩種電荷種電荷 等電點沉淀，鹽溶，鹽析，電等電點沉淀，鹽溶，鹽析，電泳，離子交換層析等；泳，離子交換層析等；

23、v一般而言，蛋白質(zhì)分子上同時存在疏水和親一般而言，蛋白質(zhì)分子上同時存在疏水和親水區(qū)域水區(qū)域 有機溶劑沉淀，疏水層析有機溶劑沉淀，疏水層析。四、蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的沉淀 消除穩(wěn)定蛋白質(zhì)的因素，就會導(dǎo)致蛋白消除穩(wěn)定蛋白質(zhì)的因素，就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。通常進行蛋白質(zhì)沉淀的方法有以質(zhì)沉淀。通常進行蛋白質(zhì)沉淀的方法有以下幾種：下幾種： 1. 1. 鹽析法鹽析法 2. 2. 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 3. 3. 重金屬鹽沉淀法重金屬鹽沉淀法 4. 4. 生物堿試劑和某些酸沉淀法生物堿試劑和某些酸沉淀法 5. 5. 熱變性沉淀法熱變性沉淀法 前兩種方法可以使蛋白質(zhì)不變性，后前兩種方法可以使蛋白質(zhì)不變性

24、，后3 3種種方法通常會使蛋白質(zhì)變性。方法通常會使蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度離子強度第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化及含量測定蛋白質(zhì)分離純化及含量測定蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo):v增加制品的純度或比活性（單位蛋白質(zhì)增加制品的純度或比活性（單位蛋白質(zhì)重量中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量或生物活性）重量中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量或生物活性）蛋白質(zhì)分離純化的基本原則蛋白質(zhì)分離純化的基本原則:v選擇好的材料選擇好的材料v了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性了解目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性v探索有效的抽提法和濃縮法探索有效的抽提法和濃縮法v建立一套層析

25、的組合建立一套層析的組合v以較好的方法貯存以較好的方法貯存一、一、初初( (粗粗) )提提 v組織、細(xì)胞破碎組織、細(xì)胞破碎v緩沖液提取。緩沖液提取。二、粗分級分離二、粗分級分離 （粗純化）（粗純化）v鹽析鹽析 v有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀 v等電點沉淀等電點沉淀v超濾濃縮等超濾濃縮等三、細(xì)分級分離三、細(xì)分級分離 （精純化）（精純化）v分子篩層析分子篩層析v親和層析親和層析v疏水疏水/ /反相層析反相層析 v離子交換層析離子交換層析v吸附層析吸附層析v電泳等電泳等四、結(jié)晶四、結(jié)晶蛋白質(zhì)分離純化的步驟及具體方法蛋白質(zhì)分離純化的步驟及具體方法v蛋白質(zhì)分子的大小蛋白質(zhì)分子的大小v蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度

26、v蛋白質(zhì)電荷狀況蛋白質(zhì)電荷狀況v蛋白質(zhì)吸附性質(zhì)蛋白質(zhì)吸附性質(zhì)v蛋白質(zhì)生物學(xué)親和性蛋白質(zhì)生物學(xué)親和性依據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)的分離純化方法依據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)的分離純化方法一、依據(jù)分子大小不同的純化方法一、依據(jù)分子大小不同的純化方法1 1、透析和超濾、透析和超濾 透析：分離無機鹽、透析：分離無機鹽、單糖等小分子。單糖等小分子。 超濾：分離無機鹽、超濾：分離無機鹽、單糖等小分子。單糖等小分子。 透析示意圖透析示意圖2 2、密度梯度離心、密度梯度離心蔗糖蔗糖 1.28g/cm1.28g/cm3 3聚蔗糖（聚蔗糖（FicollFicoll）4%8%12%16%20%3 3、凝膠過濾、凝膠過濾 也稱分子排阻層析、分子篩

27、層析，這也稱分子排阻層析、分子篩層析，這是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。蛋白質(zhì)的一種方法。 1 1、鹽析法、鹽析法v在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來，常用的中性鹽為使蛋白質(zhì)沉淀下來，常用的中性鹽為(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、NHNH4 4ClCl等。等。v中性鹽對球狀蛋白的溶解度有顯著的影響：中性鹽對球狀蛋白的溶解度有顯著的影響：鹽溶：低濃度的中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽溶：低濃度的中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析：高濃度的中性鹽，如飽和鹽析：高濃度的中性鹽，如

28、飽和(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4使使 蛋白質(zhì)溶解度下降，從溶液中沉淀析出。蛋白質(zhì)溶解度下降，從溶液中沉淀析出。二、依據(jù)溶解度差別的純化方法二、依據(jù)溶解度差別的純化方法蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析221iiZmIv分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出：白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出： 雞蛋清中球蛋白（雞蛋清中球蛋白（50%(NH50%(NH4 4) )2 2SOSO4 4飽和飽和度），清蛋白（飽和度），清蛋白（飽和(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4) )。v在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采

29、用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等，其中以鈉和磷酸鈉等，其中以硫酸銨硫酸銨最為常用。最為常用。因為硫酸銨在水中的溶解度大而且因為硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系溫度系數(shù)小數(shù)小( (在在25 25 時，溶解度為時，溶解度為767g767gL L；00時，溶解度為時，溶解度為697g697gL)L)、不影響酶的活性不影響酶的活性，分離效果好分離效果好，而且，而且價廉易得價廉易得。然而用硫酸。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所

30、以有時也用其他中性鹽進行鹽析。也用其他中性鹽進行鹽析。 硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)主要與鹽濃度有關(guān)，硫酸銨濃硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)主要與鹽濃度有關(guān)，硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為度的表示方法是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實際的克數(shù)或克分子數(shù)，這百分飽和度，而不用實際的克數(shù)或克分子數(shù)，這是由于當(dāng)固體硫酸銨加到水溶液中去時，會出現(xiàn)是由于當(dāng)固體硫酸銨加到水溶液中去時，會出現(xiàn)相當(dāng)大的非線性體積變化。相當(dāng)大的非線性體積變化。 蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)溶液加入硫酸銨加入硫酸銨靜止沉淀靜止沉淀離心或過濾離心或過濾收集沉淀收集沉淀操作流程：操作流程：蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶

31、解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度離子強度v鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入，鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來溶液中的大部分自使水的活度降低，原來溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子間的相互作用，破白質(zhì)極性基團與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 2 2、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法與水互溶的有機溶劑與水互溶的有機溶劑( (如甲醇、乙醇和丙如甲醇、乙醇和丙酮等酮等) )能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。蛋白質(zhì)在

32、有機溶劑中的溶解度也隨溫低。蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度也隨溫度、度、pHpH和離子強度而變化。在一定溫度、和離子強度而變化。在一定溫度、pHpH和離子強度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的和離子強度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑濃度也可以分離蛋白質(zhì)。濃度也可以分離蛋白質(zhì)。v有機溶劑冷卻到有機溶劑冷卻到-40-40至至-60-60v在不斷地攪拌下逐滴加入有機溶劑以防在不斷地攪拌下逐滴加入有機溶劑以防局部濃度過高局部濃度過高v有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一使水溶液的介電常數(shù)降低。介電常數(shù)一使水溶液的介電

33、常數(shù)降低。介電常數(shù)的降低將增加兩個相反電荷之間的吸引的降低將增加兩個相反電荷之間的吸引力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團的離子力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進化程度減弱，水化程度降低，因此促進了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。有機溶劑了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與引起蛋白質(zhì)沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。v聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀 水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)沉淀。聚乙二醇的主

34、要作用可起蛋白質(zhì)沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脫去蛋白質(zhì)的水化層。蛋白質(zhì)在聚能是脫去蛋白質(zhì)的水化層。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度幾乎與溶液中的鹽濃乙二醇中的溶解度幾乎與溶液中的鹽濃度，度，pH甚至蛋白質(zhì)的絕對（水中）溶解甚至蛋白質(zhì)的絕對（水中）溶解度無關(guān)。這些表明聚乙二醇與蛋白質(zhì)親度無關(guān)。這些表明聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋水基團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。白質(zhì)與水相接近。3、等電點沉淀、等電點沉淀利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)

35、溶液的一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為等電點沉淀法。稱為等電點沉淀法。在溶液的在溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點時，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為等電點時，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀。集在一起而沉淀。 4 4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響 在一定的溫度范圍內(nèi)，約在一定的溫度范圍內(nèi)，約0 0一一4040之間，之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高大部分球狀蛋白質(zhì)的

36、溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從白從0 0到到2525之間，溶解度隨溫度上升之間，溶解度隨溫度上升而降低。在而降低。在4040一一5050以上，大部分蛋白以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，在中性質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，在中性pHpH介介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在操作一般都在00或更低的溫度下進行。或更低的溫度下進行。一、電泳一、電泳v帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋

37、白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時可以分開。率即異，在電泳時可以分開。1.1.自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進行自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進行電泳。電泳。2.2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。區(qū)域。三、依據(jù)電荷狀況分離蛋白質(zhì)三、依據(jù)電荷狀況分離蛋白質(zhì)（1 1）紙電泳、薄膜電泳：用濾紙、薄膜作支）紙電泳、薄膜電泳：用濾紙、薄膜作支持物。持物。（2 2）粉末電泳：淀粉、纖維素粉作支持物。）粉末電泳：淀粉、纖維素粉作支持物。（3

38、 3）凝膠電泳：用凝膠（聚丙烯酰胺、瓊脂）凝膠電泳：用凝膠（聚丙烯酰胺、瓊脂糖）作支持物。糖）作支持物。 a)a)圓盤電泳（圓盤電泳（disc)disc)：玻璃管中進行的凝膠：玻璃管中進行的凝膠電泳。電泳。 b)b)平板電泳（水平式、垂直式）：鋪有凝平板電泳（水平式、垂直式）：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。膠的玻板上進行的電泳。最早的電泳裝置最早的電泳裝置聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)原理原理 v聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，AcrAcr) )和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N N，N-N-甲叉雙甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺

39、(methylene-bisacrylamide(methylene-bisacrylamide，BisBis) )在加速劑四甲基乙二胺在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和催和催化劑過硫酸銨化劑過硫酸銨(AP)(AP)的作用下聚合形成的三的作用下聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(PAGE)。凝。凝膠的濃度和孔徑可調(diào)節(jié)。膠的濃度和孔徑可調(diào)節(jié)。v根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)， PAGEPAGE分為連續(xù)系統(tǒng)與分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：v連

40、續(xù)電泳體系中緩沖液連續(xù)電泳體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度相同，值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)；效應(yīng)；v不連續(xù)電泳體系中，由于緩沖液離子成分、不連續(xù)電泳體系中，由于緩沖液離子成分、pHpH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。v不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層濃

41、縮膠、成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層濃縮膠、下層分離膠。下層分離膠。PAGE原理原理v濃縮膠（濃縮膠（3 3），緩沖液為），緩沖液為pH6.7pH6.7的的Tris-Tris-HClHCl，其作用是使樣品進入分離膠前，被，其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。v分離膠（分離膠（7.07.07.57.5），緩沖液為），緩沖液為pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl，大部分蛋白質(zhì)在此，大部分蛋白質(zhì)在此pHpH條件下帶負(fù)電荷。此膠主要起分子篩作條件下帶負(fù)電荷。此膠主要起分子篩作用。用。v電極緩沖液為電極緩沖液為pH8.

42、3pH8.3甘氨酸甘氨酸Tris-HClTris-HCl。分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠樣品樣品聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳（聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳（disc）示意圖）示意圖 樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)(1)(1)凝膠孔徑的不連續(xù)性凝膠孔徑的不連續(xù)性 上述凝膠中，濃縮膠為上述凝膠中，濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成因而在兩層凝膠交界處，樣品遷

43、移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。很窄的區(qū)帶。(2)(2)緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 在兩層在兩層凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷( (簡稱簡稱Tris)Tris)及及HClHCl。TrisTris的作用是維持溶液的電中性及的作用是維持溶液的電中性及pHpH值，是緩沖值，是緩沖配對離子。配對離子。HClHCl在任何在任何pHpH溶液中均易解離出溶液中均易解離出ClCl- -，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。 v在電極緩沖液中，除有在電極緩沖液中，除有TrisTris外，還有甘氨酸外，還有甘氨酸

44、(glycine)(glycine)，其，其pIpI=6.O=6.O，在，在pH8.3pH8.3的電極緩沖液的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根中，易解離出甘氨酸根(NH(NH2 2CHCH2 2COOCOO- -) )，而在，而在pH6.7pH6.7的凝膠緩沖體系中，的凝膠緩沖體系中， GlyGly解離度僅有解離度僅有O.1O.11 1，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。v血清中大多數(shù)蛋白質(zhì)血清中大多數(shù)蛋白質(zhì)pIpI在在5.O5.O左右，在左右，在pH6.7pH6.7或或8.38.3時均帶負(fù)電荷向正極移動，遷移率介于快離時均帶負(fù)電荷向正極移動，遷移率介于快離子

45、與慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子子與慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區(qū)帶。形成的界面處，被濃縮成為極窄的區(qū)帶。v當(dāng)進入當(dāng)進入pH8.9pH8.9的分離膠時，的分離膠時， GlyGly解離度增加，其解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；因此有效遷移率超過蛋白質(zhì)；因此ClCl- -及及NHNH2 2CHCH2 2COOCOO- -沿著離子界面繼續(xù)前進。蛋白質(zhì)分子由于相對沿著離子界面繼續(xù)前進。蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大，被留在后面，逐漸分成多個區(qū)帶。分子質(zhì)量大，被留在后面，逐漸分成多個區(qū)帶。 (3) (3)電位梯度的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性 電泳開始后，快離

46、子電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶?？s成狹窄的區(qū)帶。 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) v大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。這就是分子篩效應(yīng)。v蛋自質(zhì)進入蛋自質(zhì)進入pH8.9pH8.9的同一孔徑的分離膠后，分子的同一孔徑的分離膠后，分子小且為球狀的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動快，小且為球狀的蛋白質(zhì)分子所受

47、阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。分成各自的區(qū)帶。v這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。分子后流出。 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) v在在pH8.9pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。因此，各

48、種蛋白質(zhì)遷移快；反之，則慢。因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。泳。垂直板電泳的優(yōu)越性垂直板電泳的優(yōu)越性進行進行PAGEPAGE時，一般將溶膠灌在兩塊玻璃板之間，聚合后制時，一般將溶膠灌在兩塊玻璃板之間，聚合后制成垂直板，垂直板電泳的優(yōu)越性有：成垂直板，垂直板電泳的優(yōu)越性有：表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰；晰；在同一塊膠板上，可同時進行在同一塊膠板上，可同時進行1010個以上樣品的電泳，便個以上樣品的

49、電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影；泳及放射自顯影；膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備；可用于分析，還可用于制備；膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描；與掃描；可進行雙向電泳。可進行雙向電泳。垂直板電泳垂直板電泳v測定分子量測定分子量v純度鑒定純度鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)等電聚焦等電聚焦(IEF)v等電聚焦電泳：利用兩性

50、電解質(zhì)在凝膠中建立等電聚焦電泳：利用兩性電解質(zhì)在凝膠中建立pHpH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到其等電點時梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到其等電點時pH pH ，凈電荷為，凈電荷為零，在電場中不再移動。零，在電場中不再移動。等電點的測定等電點的測定 二、離子交換層析二、離子交換層析 離子交換層析是利用離子交換劑上的離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團可解離基團( (活性基團活性基團) )對各種離子親和力對各種離子親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。不同而達到分離目的的一種層析分離方法。v離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分物質(zhì)高分子物質(zhì)。

51、通過在不溶性高分物質(zhì)( (母母體體) )上引入若干可解離基團上引入若干可解離基團( (活性基團活性基團) )而而制成。制成。v離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進行分離純化。常用的陽離子交換劑為同進行分離純化。常用的陽離子交換劑為羧甲基纖維素（羧甲基纖維素（CM-CCM-C），陰離子交換劑為），陰離子交換劑為二乙基氨基乙基纖維素（二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-CDEAE-C）。）。 v按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交劑。由以分為陽離子交換劑和陰離子交劑。由于蛋白質(zhì)分子具有兩性性質(zhì)，所以可用

52、于蛋白質(zhì)分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑行陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑行酶的分離純化。酶的分離純化。v在溶液的在溶液的pHpH值大于蛋白質(zhì)的等電點時，值大于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換劑進行層析分離；而當(dāng)溶液劑進行層析分離；而當(dāng)溶液pHpH值小于蛋值小于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子帶正荷，白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子帶正荷，則要采用陽離子交換劑進行分離。則要采用陽離子交換劑進行分離。 v按母體物質(zhì)種類的不同，離子交換劑有按母體物質(zhì)種類的不同，離子交換劑有離子交換纖維素，離子交換凝膠（葡聚離子交換纖維素，離子交換凝膠（葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）等。糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）等。v引入不溶性母體的活性基團，可以是酸引入不溶性母體的活性基團，可以是酸性基團，如磺酸基性基團，如磺酸基(-SO(-SO3 3H)H)如磺乙基、磺如磺乙基、磺丙基、磷酸丙基、磷酸(-PO(-PO3 3H H2 2) )、羧基、羧基(-COOH)(-COOH)如羧如羧甲基甲基(-OCH(-OCH2 2COOH) COOH) 等。引入酸性基團的離等。引入酸性基團的離子交劑可以