凝膠遷移或電泳遷移率實驗EMSA

1、1)什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗？凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋

2、白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。2)作這樣的實驗需要什么試劑？凝膠遷移實驗需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用g-32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公

3、司的Riboprobe?/sup系統(tǒng)（a,b）（目錄號P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA5末端標(biāo)記系統(tǒng)（目錄號U2010）用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage?/sup分析。3)凝膠遷移實驗系統(tǒng)提供了什么試

4、劑？Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實驗的 一種正對照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)（目錄號E3050）包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液（5），和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)（目錄號E3300）含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點的同源序列

5、。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。參考凝膠遷移實驗技術(shù)手冊TB110獲取更多的資料。4)成功進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化哪些因素？凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點特點的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH, 聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）。總之，反應(yīng)總體積應(yīng)最?。?0ul）。為滿足一般要求

6、，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作為優(yōu)化實驗的起始。參考凝膠遷移實驗技術(shù)手冊TB110獲取更多的資料。5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，這些引物的序列來源是什么？有各類dsDNA探針，它們含各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源結(jié)合位點。下表列出了所能提供的探針，和這些引物序列的出處。

7、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子探針-探針名 目錄號 序列（上鏈） 序列的出處Sp1 E3231,E3232 5-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3 SV40啟動子（1）AP1 E3201 E3202 5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3 膠原酶基因TRE（2）AP2 E3211 E3212 5-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3人金屬硫堇II a(3)基因NF-kB E3291, E3292, 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3鼠Igk輕鏈基因（4）Oct1 E3241 E3242 5-TGT

8、 CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3 Ig重鏈基因（5）CREB E3281 E3282 5-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3大鼠生長激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3belta-1球蛋白啟動子只列出了上鏈的序列，探針是雙鏈，下鏈序列和上鏈序列配對。黑體字表明序列來源于指定的基因序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列用下線表明。一般而言，周圍的核苷酸是任意。6)在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合

9、探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp）,這樣結(jié)合位點可和其他因子的結(jié)合位點區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。7)用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。當(dāng)用HeLa細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時，每1個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成

10、特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個單獨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。1AP1：AP1（激活蛋白1）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它結(jié)合的同源序列為5-TGAGTCA-3。當(dāng)基因的啟動子區(qū)域存在AP1的結(jié)合位點時，這些基因可以被誘導(dǎo)，比如用佛波酯可誘導(dǎo)蛋白激酶C（2，7）。在細胞中，AP1形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白的同聚雙體，或者形成c-Jun或Jun相關(guān)蛋白和c-Fos或Fos相關(guān)抗原（Fras）的異源雙體。Fos蛋白自身不能形成同聚雙體，并不能單獨和AP1結(jié)合位點結(jié)合。c-Jun蛋白是一個40kDa的單體蛋白并

11、通過亮氨酸拉鏈形成同聚雙體。在HeLa細胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚雙體。在凝膠遷移實驗中，形成一個特異的復(fù)合物。當(dāng)作凝膠遷移實驗測定AP1的活力時，除了基本的溶液組分外，應(yīng)將0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到結(jié)合緩沖液中。如用純化的蛋白，則用1-2ug的蛋白來檢測遷移復(fù)合物。2AP2：AP2是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可分別作為TPA-和cAMP誘導(dǎo)因子（10）。它是一個52 kDa的蛋白，識別的同源序列為5-CCCCAGGC-3或5-GCCNNGGC-3（3）。這個因子對視黃酸特別敏感，可能在形態(tài)發(fā)生中起著重要作用。H

12、eLa細胞核抽提物和AP2同源DNA探針形成一個特定的復(fù)合物。用純化的蛋白作凝膠遷移實驗時，應(yīng)用20-50ng的蛋白。3CREB：CREB是一個37 kDa的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對cAMP應(yīng)答，識別5-T（G/T）ACGTCA-3DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)而形成同聚雙體，相關(guān)的基本結(jié)構(gòu)域和c-JunDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。當(dāng)用HeLa細胞核抽提物時，能和CREB同源序列形成一個復(fù)合物。4NF-kB：NF-kB最初被鑒定為在B細胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結(jié)合。但隨后在非B-細胞的細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，形成NF-kB和IkB的復(fù)合物。最初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物中分離的NF-kB是由p65

13、(RelA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49（也可稱為p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75單體起反式激活作用。p50，p49（p52）單體具有DNA結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細胞質(zhì)中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。IkB和p65單體結(jié)合，阻制了細胞核中的定位和DNA的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合。Poly(dI:dC)能抑制這一反應(yīng)（14）。p

14、49和p50也能形成同源雙聚體，但在細胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB的凝膠遷移實驗時，在20ul的反應(yīng)體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物，而需用10ug的HeLa細胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍色素的加樣溶液只能加入到陰性對照反應(yīng)中，因這兩

15、種色素會加劇NF-kB復(fù)合物的解離。當(dāng)用HeLa細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來源時，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達p49，p50，p65的細胞中，可檢測到4個序列特異的凝膠遷移復(fù)合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65。下列試劑可加強NF-kB在體外的結(jié)合：mM的GTP，ATP，精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng的Co+3(NH3)6（12）。5OCT1：OCT1是OCT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家簇中的一員，顯然在哺乳細胞中存在比較廣泛（5）。POU結(jié)構(gòu)域

16、包括POU-box和Homeo結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用HeLa細胞核抽提物時，可檢測到一個與OCT1同源探針形成的序列同源凝膠遷移復(fù)合物。6SP1：SP1是一個O-糖基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它識別10個核苷酸長度的同源序列5-GGGGCGGGGC-3（1）。核心識別序列是5-GGGGCGGG-3。同核心序列相似的序列常存在于啟動子中。SV40的早期啟動子就是一個例子，它是第一個可以結(jié)合SP1的啟動子。根據(jù)糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的三個鋅指紋決定了序列的特異性。HeLa細胞核抽提物與SP1同源探針形成特異的凝膠遷移復(fù)合物。7TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是

17、基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與RNA聚合酶II啟動子的基本的轉(zhuǎn)錄（16）。TFIID與真核啟動子的TATA區(qū)域形成特異的DNA結(jié)合。TFIID由幾個蛋白組成，而其中的TATA區(qū)域結(jié)合蛋白（TBP），參與TATA序列的結(jié)合。TFIID的其他的蛋白組分被稱為TBP-相關(guān)因子（TAFs）。用TFIID探針寡核苷酸和HeLa細胞核抽提物，可得到一個微弱的凝膠遷移帶，但很難確定為是TFIID序列特異凝膠遷移復(fù)合物。純化的重組的TBP很難作凝膠遷移實驗，這部分是由于TBP存在很強的正電荷，導(dǎo)致TBP/DNA復(fù)合物很難進入凝膠。純化的TBP形成二聚體后不能結(jié)合DNA（17）。因此形成的二聚體可參與DNA結(jié)合。TF

18、IIB不單獨與DNA結(jié)合，但與TFIID結(jié)合后增強它與DNA的結(jié)合。TFIIB與預(yù)啟動復(fù)合物結(jié)合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF結(jié)合到轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)。故TFIIB在預(yù)啟動復(fù)合物的形成中有重要作用。當(dāng)用純化的TFIID作凝膠遷移實驗時，poly(dI-dC)不用加入結(jié)合反應(yīng)中。結(jié)合緩沖液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。對TFIID的凝膠結(jié)合實驗中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的復(fù)合物在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，凝膠組分是：0.5TBE, 6%聚丙烯酰胺凝膠(19:1丙烯酰胺:雙叉),4mMMgCl2,

19、0.02%NP-40, 電泳緩沖液組分是：0.5TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。當(dāng)研究含TFIID和TFIIB的復(fù)合物時，應(yīng)從結(jié)合緩沖液，凝膠，和電泳緩沖液中去除MgCl2。這些是一般的要求，用不同的細胞抽提物和TFIID、TFIIB形成復(fù)合物作凝膠遷移實驗時，應(yīng)對多種因素進行優(yōu)化以達到理想的條件。8)在一次凝膠遷移實驗中，用多少量的蛋白質(zhì)或抽提物，和標(biāo)記的DNA探針？對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化，一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-

20、20ug蛋白形成特異的復(fù)合物。所加入反應(yīng)的探針的量是50，000-200，000cpm32P-標(biāo)記的探針（高特異活性），反應(yīng)體積為1-5ul。這相當(dāng)于10-50fmoles的DNA探針。探針應(yīng)保存在-20oC以防止降解，在合成或標(biāo)記后1-2個星期內(nèi)必需使用。無論探針或是結(jié)合蛋白應(yīng)避免多次凍融。9)能用體外翻譯法制備目的蛋白質(zhì)嗎？Promega沒對所有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作這類測試。一般，用麥胚抽提物作哺乳細胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白的體外翻譯，兔網(wǎng)織紅細胞溶裂解液可能含有內(nèi)源哺乳細胞轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白。但TNT？/sup兔網(wǎng)織細胞溶解液系統(tǒng)（a,b,c,d）與TranscendTM 生物素標(biāo)記

21、的tRNA(目錄號E3201)一同使用，翻譯了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目錄號E3201）產(chǎn)生的遷移效果和重組的AP1相同（18）。TNT？/supT7偶聯(lián)的麥胚抽提物（b,c,d,e）在體外翻譯了c-Rel。這一蛋白特異地使免疫球蛋白k輕鏈增強子探針產(chǎn)生遷移。在c-Rel結(jié)合反應(yīng)中加入體外翻譯的MAD-3（IkB家簇中一員）可干擾其相互作用。10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結(jié)構(gòu)，可抑制蛋白對標(biāo)記探針的非特異結(jié)合，避免假復(fù)合物。 在凝膠遷移反應(yīng)中加入poly(dI:d

22、C)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的非特異結(jié)合。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的非放射性的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實驗。一般，非放射性的特異DNA是非標(biāo)記的DNA探針，非特異的競爭DNA ，長度組成和DNA探針相同，序列不同。用非放射性的特異DNA能競爭掉，而用非特異的競爭DNA不能競爭掉的

23、復(fù)合物，表明目的蛋白和同位素標(biāo)記探針的特異結(jié)合。非特異結(jié)合能用特異DNA和非特異的競爭DNA競爭掉。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作優(yōu)化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特異或非特異）的競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是同位素標(biāo)記的探針的10-1000倍（w/w）。其他類型的競爭DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝膠遷移反應(yīng)，它們會帶有目的蛋白的結(jié)合位點。11)用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%（30：

24、1丙烯酰胺：雙叉），在特定條件下可用高或低的濃度。PH, 聚丙烯酰胺的濃度, 丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺的比會影響復(fù)合物在凝膠中的遷移。大多數(shù)蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時所用的TBE和TAE必需是新配制的，無沉淀。低的離子強度和丙烯酰胺基質(zhì)的箱子效果有助于復(fù)合物的穩(wěn)定。也可將TGE緩沖液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物?？稍?oC進行結(jié)合和電泳實驗以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。加樣樣品液中的色素會導(dǎo)致不穩(wěn)定復(fù)合物的解離，應(yīng)用不含考馬斯蘭和二甲苯藍的加樣樣品液。當(dāng)帶型不

25、緊密出現(xiàn)拖尾時，表明復(fù)合物存在解離。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾。如復(fù)合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑。目前可用高強度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復(fù)合物（Metaphor?/sup/agarose）。12)如何在一個特定的復(fù)合物中確定一個蛋白質(zhì)的存在？部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復(fù)合物。多個復(fù)合物的存在表明蛋白降解，應(yīng)在制備抽提液的溶液中和結(jié)合反應(yīng)中加入蛋白酶抑制劑。確定復(fù)合物中蛋白

26、的特征可能會困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進行超遷移實驗，抗體和蛋白/探針復(fù)合物中的蛋白結(jié)合，使復(fù)合物的遷移延遲，形成超遷移。增量的抗體加入到結(jié)合反應(yīng)中?？贵w可加入到蛋白和探針反應(yīng)后，也可將抽提物與抗體結(jié)合后，再加入探針。取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復(fù)合物地形成，后者阻止復(fù)合物的形成導(dǎo)致原復(fù)合物的強度的減少。在大多數(shù)實驗中，應(yīng)對抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1：1，然后應(yīng)需要增加抗體的量。當(dāng)有純化的蛋白時，可用它們和實驗的帶型遷移復(fù)合物比較。除超遷移實驗外，復(fù)合物中蛋白的特征也可用UV交聯(lián)和標(biāo)記轉(zhuǎn)移來分析。在均質(zhì)標(biāo)記的探針和細胞核抽提物保溫后，

27、用UV照射使復(fù)合物交聯(lián)，隨后用DNA酶降解未保護的探針。需用均質(zhì)標(biāo)記的探針，因DNA酶會從末端標(biāo)記的探針中除去標(biāo)記。和保護的幾個核苷酸交聯(lián)的蛋白在變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離，干燥，放射自顯影。結(jié)合蛋白的分子量可和標(biāo)準(zhǔn)分子參照物比較。也可用目的蛋白的抗體對復(fù)合物作Western印跡分析（20）。如一個蛋白和DNA探針的特定序列結(jié)合，可用含保守結(jié)合序列的競爭寡核苷酸，以及突變體來確定它的特征。也可用定點突變將保守序列結(jié)合位點改變來研究復(fù)合物的形成。參考資料1. Briggs M R et al 1986 Science 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7

28、413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlsow T G et al 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81, 26506. Montminy M R et al 1986 Proc Natl Acad Sci USA 83, 66827. Angel P et al 1987 Cell 49, 7298. Chiu R et al 1988 Cell 54, 5419. Rauscher F J et al 1988 Cell

29、52,47110. Imagawa M et al 1987 Cell 51, 25111. Berkowitz L A and Gilman M Z 1990 Proc Natl Acad Sci USA 87, 525812. Baeuerle P A 1991 Biochim Biophys Acta 1071, 6313. Duckett C S et al 1993 Mol Cell Biol 13, 131514. Urban M B et al 1991 EMBO J 10(7), 181715. Dynan W S and Tjian R 1983 Cell 35, 7916.

30、 Peterson M G et al 1990 Science 248, 165217. Coleman R A et al 1995 J Biol Chem 270, 1384218. Beckler G and Hurst R 1993 Promega Notes 43,2419. DiDonato, J A and Karin M 1993 Promega Notes 42, 1820. Demczuk S et al 1993 Proc Natl Acad Sci USA90,2574使用了Promega 公司凝膠遷移實驗產(chǎn)品的參考資料1Xu J and Clark RAF 1997

31、 J Cell Biol 136, 473 (SP1和NFkB保守序列寡核苷酸）2 Dbaibo G S et al 1997 J Exp Med 185, 481（NFkB保守序列寡核苷酸）3 Pan Z K et al 1996 J Clin Invest 98, 2042（NFkB保守序列寡核苷酸）4 Kochekova M et al 1997 J Clin Invest 99, 3000（SP1保守序列寡核苷酸）5 Avantaggiati M L et al 1997 Cell 89, 1175（AP1保守序列寡核苷酸）6 Schmedite, J F et al 1997 J B

32、iol Chem 272, 601（NFkB保守序列寡核苷酸）7 Lee B S et al 1997 J Biol Chem 272, 174 （AP2和SP1保守序列寡核苷酸和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）8 Ohlsson B G et al 1997 J Clin Invest 98, 78（AP1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）9 In KH et al 1997 J Clin Invest 99, 1130（SP1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子） 植物基因工程表達載體的改進和優(yōu)化策略 植物基因工程表達載體的改進和優(yōu)化策略將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達載體中并轉(zhuǎn)入受體植物，并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的。理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基

33、因在特定部位和特定時間內(nèi)高水平表達，產(chǎn)生人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發(fā)展歷史卻表明，外源基因在受體植物內(nèi)往往會出現(xiàn)表達效率低、表達產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無法投入實際應(yīng)用。另外，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題已在許多國家引起人們的關(guān)注，例如，轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴散，抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某些抗生素失去作用等等。以上問題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時期。針對這些問題，近幾年人們對植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行了多方面的探索和改進，植物表達載體的改進和優(yōu)化就是其中最重要的一項內(nèi)容，本文就已經(jīng)取得的進展進行綜述。1 啟動子的選用和改造外源基

34、因表達量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動子在決定基因表達方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動子和改進其活性是增強外源基因表達首先要考慮的問題。目前在植物表達載體中廣泛應(yīng)用的啟動子是組成型啟動子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動子和來自水稻的Actinl啟動子。在這些組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會表達。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，

35、同時又可減少對植物的不利影響，目前人們對特異表達啟動子的研究和應(yīng)用越來越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動子主要包括器官特異性啟動子和誘導(dǎo)特異性啟動子。例如，種子特異性啟動子、果實特異性啟動子、葉肉細胞特異性啟動子、根特異性啟動子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動子、光誘導(dǎo)特異性啟動子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動子等。這些特異性啟動子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達，由于該啟動子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過噴酒廉價、無公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達，顯然是一個十分有效的途徑

36、。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進行特異表達和誘導(dǎo)表達時，表達水平大多不夠理想。對現(xiàn)有啟動子進行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動子構(gòu)成了復(fù)合啟動子，GUS表達結(jié)果表示：改造后的啟動子活性比35S啟動子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進行組合，新型啟動子的表達活性提高了近10倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動子發(fā)揮了重要作用。2 增強翻譯效率為了增強外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時一般要對基因進行修飾，主要考

37、慮三方面內(nèi)容：2.1添加5-3-非翻譯序列許多實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5-3-非翻譯序列（UTR）對基因的正常表達是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點上游，有一個由68bp核苷酸組成的元件，這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點，能使Gus基因的翻譯活性提高數(shù)十倍。目前已有許多載體中外源基因的5-端添加了翻譯增強序列。Ingelbrecht等曾對多種基因的 3-端序列進行過研究，發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3-端序列能使NPTII基因的瞬間表達提高20倍以上。另外，不同基因的3-端序列增進基因表達的效率有所

38、不同，例如，rbcS3-端序列對基因表達的促進作用比查爾酮合酶基因的3-端序列高60倍。2.2 優(yōu)化起始密碼周邊序列雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動物起始密碼子周邊序列為CACCAUG，原核生物的則與二者差別較大。Kozak詳細研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點突變后對轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為ACCATGG時轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達載體的構(gòu)建中。例如，有一個細菌

39、的幾丁質(zhì)酶基因，原來的起始密碼周邊序列為UUUAUGG，當(dāng)被修飾為ACCAUGG，其在煙草中的表達水平提高了8倍。因此，利用非植物來源的基因構(gòu)建表達載體時，應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造。2.3對基因編碼區(qū)加以改造如果外源基因是來自于原核生物，由于表達機制的差異，這些基因在植物體內(nèi)往往表達水平很低，例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降。美國Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對殺蟲蛋白基因進行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加了GC含量，去除原序列

40、下影響mRNA穩(wěn)定的元件，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達量增加了30100倍，獲得了明顯的抗蟲效果。3 消除位置效應(yīng)當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后，它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平往往有很大差異。這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點不同造成的。這就是所謂的位置效應(yīng)。為了消除位置效應(yīng)，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，在目前的表達載體構(gòu)建策略中通常會考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點整合技術(shù)的應(yīng)用。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association region,MAR）是存在于真核細胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列。一般認為，MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉

41、的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個轉(zhuǎn)錄單元保持相對的獨立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MAR-gene-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達載體，用于遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）對Gus基因在煙草中表達的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達水平平均提高60倍。使用來源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。另一可行的途徑是采用定點整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，

42、當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時，外源基因可以通過同源重組定點整合于染色體的特定部位。實際操作時首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點整合已成為一項常規(guī)技術(shù)，在動物中外源基因的定點整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達載體可實現(xiàn)定點整合以外，細胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報道。4 構(gòu)建葉綠體表達載體 為了克服細胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴散而帶來的不安全性等問題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)-葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認識并受到重視。到目前為止，已在煙草、水

43、稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長點。由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測定，這就為外源基因通過同源重組機制定點整合進葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達載體基本上都屬于定點整合載體。構(gòu)建葉綠體表達載體基本上都屬于定點事例載體。構(gòu)建葉綠體表達載體時，一般都在外源基因表達盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過這兩個片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點。

44、在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個基因作為同源重組片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點插入在兩個相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認為這種載體

45、可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化。如果這種載體的通用性得到證實，那么這項工作無疑為構(gòu)建方便而實用的新型葉綠體表達載體提供了一個好的思路。由于葉綠體基因組的高拷貝性，定點整合進葉綠體基因組的外源基因往往會得到高效率表達，例如McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，Bt毒素蛋白的表達量高達葉子總蛋白的3%5%，而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達到0.001%0.6%。最近，Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，也發(fā)現(xiàn)毒蛋白在煙草葉子中的表達量很高，占可溶性蛋白的2%3%，比細胞核轉(zhuǎn)化高出2030倍，轉(zhuǎn)基因煙草不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)

46、生了高抗性的昆蟲。Staub等最近報道，將人的生長激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體，其表達量竟高達葉片總蛋白的7%，比細胞核轉(zhuǎn)化高出300倍。這些實驗充分說明，葉綠體表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，是實現(xiàn)外源基因高效表達的重要途徑之一。 定位信號的應(yīng)用上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，然而，高水平表達的外源蛋白能否在植物細胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問題。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘栃蛄校雇庠吹鞍桩a(chǎn)生后定向運輸?shù)郊毎麅?nèi)的特定部位，例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域為某些

47、外源蛋白提供了一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前，發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi)，外源蛋白總的積累量比對照提高了1020倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前，試圖使基因表達產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累，從而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源蛋白基因相連接，發(fā)現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號對于促進蛋白質(zhì)積累有積極作用，但同一種定位信號是否適用于所

48、有的蛋白還有待于進一步確定。 6 內(nèi)含子在增強基因表達方面的應(yīng)用內(nèi)含子增強基因表達的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的，玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個內(nèi)含子（intron 1）對外源基因表達有明顯增強作用，該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強作用。后來，Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個內(nèi)含子能使CAT表達水平提高10倍。水稻肌動蛋白基因的第三個內(nèi)含子也能使報道基因的表達水平提高26倍。至今對內(nèi)含子增強基因表達的機制不不清楚，但一般認為可能是內(nèi)含子的存在增強了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性。Tanaka等人的多項研究表明，內(nèi)

49、含子對基因表達的增強作用主要發(fā)生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。 由于內(nèi)含子對基因表達有增強作用，Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達載體時，特意將水稻的肌動蛋白基因的第一個內(nèi)含子保留在該基因啟動子的下游。同樣，Christensen等在構(gòu)建載體時將玉米Ubiquitin基因的第一個內(nèi)含子置于啟動子下游，以增強外源基因在單子葉植物中的表達。然而，有研究指出，特定內(nèi)含子對基因表達的促進作用取決于啟動子強度、細胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時會取決于內(nèi)含子在載體上的位置。例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于Gus基因的5端，在CaMV35S啟動子調(diào)控下，Gus基因的表達未見增強；當(dāng)把內(nèi)

50、含子置于Gus基因3端，在同樣的啟動子控制下，Gus基因的表達水平卻增加了大約3倍。由此可見，內(nèi)含子對基因表達的作用機制可能是很復(fù)雜的，如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達載體，目前還缺乏一個固定的模式，值得進一步探討。7 多基因策略迄今為止，多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物。但有時由于單基因表達強度不夠或作用機制單一，尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物。如果把兩個或兩個以上的能起協(xié)同作用的基因同時轉(zhuǎn)入植物，將會獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用。例如，根據(jù)抗蟲基因的抗蟲譜及作用機制的不同，可選擇兩個功能互補的基因進行載體構(gòu)建，并通過一

51、定方式將兩個抗蟲基因同時轉(zhuǎn)入一個植物中去。王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時轉(zhuǎn)入棉花，得到了含雙價抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株。Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時轉(zhuǎn)入煙草，其抗蟲性和防止害蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提高（專利）。在抗病方面，本實驗室藍海燕等構(gòu)建了包含-1，3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價植物表達載體，并將其導(dǎo)入油菜和棉花，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將23個抗真菌病基因和hpt基因連在一個載體上，兩個抗蟲基因與bar基因連在另一個載體上，用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中，結(jié)果表明，70%的R。代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（67個）

52、，且導(dǎo)入的多個外源基因趨向于整合在基因組的一個或兩個位點。一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化，尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細胞。而一些功能相關(guān)的基因，比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等，大多成基因簇的形式存在。如果將某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色體中自然存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點，那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細胞一種全新的代謝途徑，產(chǎn)生新的生物分子。不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來的位置效應(yīng)，減少基因沉默等不良現(xiàn)象的發(fā)生。最近，美國的Hamilton和中國的劉