基因工程基本原理及操作程序

1、基基 因因 工工 程程選修選修3 專題一專題一基因工程的概念基因工程的概念蘇云金桿菌蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白基因毒蛋白毒蛋白殺死害蟲殺死害蟲棉花細胞棉花細胞抗蟲棉的培育抗蟲棉的培育基因工程的概念基因工程的概念DNADNA片段的連接工具（片段的連接工具（“分子縫合針分子縫合針”） DNADNA連接酶連接酶基因轉(zhuǎn)移工具（基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運輸車分子運輸車”） 運載體運載體一、一、DNADNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具準確切割準確切割DNADNA的工具（的工具（“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”） 限制酶限制酶 特點：一種限制酶只能識別特點：一種限制酶只能識別DNA的一種核苷酸的一種核苷酸序列，

2、并在特定的位點切割序列，并在特定的位點切割DNA.1、限制酶、限制酶限制限制酶酶限制酶切割的是么？限制酶切割的是么？DNADNA分子分子 切割切割DNADNA分子兩個脫分子兩個脫氧核苷酸之間的氧核苷酸之間的磷酸磷酸二酯鍵二酯鍵。切割切割DNADNA分子后形成什么？分子后形成什么？ 將雙鏈將雙鏈DNADNA分子片段分子片段“縫合縫合”起來，恢復兩起來，恢復兩個脫氧核苷酸之間的個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接的是什么？連接酶連接的是什么？2、DNA連接酶連接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A

3、A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G剪刀：用同種限制剪刀：用同種限制酶切割酶切割DNA連接酶的種類連接酶的種類T T4 4DNADNA連接酶：連接酶： 連接連接黏性末端黏性末端和和平末平末端端DNADNA連接酶：連接酶：黏性末端黏性末端3 3、運載體、運載體標記基因，便于標記基因，便于進行檢測。進行檢測。 質(zhì)粒存在于質(zhì)粒存在于許多細菌和酵母許多細菌和酵母菌等生物中菌等生物中, ,是擬是擬核或細胞核外能核或細胞核外能夠自主復制的很夠自主復制的很小的環(huán)狀小的環(huán)狀DNADNA分子分子. .特點特點： 1. 1.結(jié)構(gòu)簡單，能夠在

4、宿主細胞中結(jié)構(gòu)簡單，能夠在宿主細胞中復制復制并穩(wěn)定地保存并穩(wěn)定地保存。 2.2.具具多種限制酶的單一切點多種限制酶的單一切點，以便與外源基因連接。，以便與外源基因連接。 3.3.具有某些具有某些標記基因標記基因，便于進行，便于進行篩選篩選。 4.4.對宿主細胞沒有傷害。對宿主細胞沒有傷害。作用作用：將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞常用運載體常用運載體：質(zhì)粒質(zhì)粒 動植物病毒動植物病毒 噬菌體噬菌體基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構(gòu)建、基因表達載體的構(gòu)建3 3、將表達載體導入受體細胞、將表達載體導入受體細胞

5、4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1 1、目的基因主要是、目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因2 2、獲取目的基因的常用方法、獲取目的基因的常用方法? ?從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取利用利用PCRPCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增人工合成人工合成基因文庫基因文庫 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，導片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。生物的不同基因，稱為基因文庫。基因組文庫基因組文庫部分基因文庫（如部分基因文庫（如

6、:cDNA:cDNA文庫）文庫）基因組文庫基因組文庫 通過對受體菌通過對受體菌群體的培養(yǎng)而儲群體的培養(yǎng)而儲存一種生物的全存一種生物的全部基因。部基因。cDNAcDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建提取生物某發(fā)育時期提取生物某發(fā)育時期mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈的雙鏈的cDNAcDNA ( (只含該生物的部分基因只含該生物的部分基因) )與載體連接導入受體菌群儲存起來與載體連接導入受體菌群儲存起來基因組文庫和部分基因組文庫基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫文庫)比較比較真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)RNARNA聚合酶聚合酶

7、的結(jié)合位點的結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì) 不能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)不能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)啟動子啟動子終止子終止子內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 基因組文庫和基因組文庫和 cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因人工合成法：人工合成法： 基因較小，核苷酸序列已知，可以利用基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNADNA合合成儀人工合成。成儀人工合成。目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達

8、和發(fā)揮作用。達和發(fā)揮作用。質(zhì)質(zhì) 粒粒 目的基因目的基因 啟動子啟動子 終止子終止子二、基因二、基因表達載體表達載體的構(gòu)建的構(gòu)建 啟動子：啟動子：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，最，最終獲得蛋白質(zhì)終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，能終止片斷，能終止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標記基因標記基因：為了鑒別受體細胞為了鑒別受體細胞中是否導入了目的基因，從而將中是否

9、導入了目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來有目的基因的細胞篩選出來用一定的用一定的_切割切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出露出_。用用_切斷目切斷目的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_將切下的目的基因片段將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的插入質(zhì)粒的_處，再加處，再加入適量入適量_，形成，形成了一個重組了一個重組DNADNA分子（重組分子（重組質(zhì)粒）。質(zhì)粒）。限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶 用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之露出用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，再

10、加入相同的粘性末端，再加入DNA連接酶。連接酶。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化 方法方法將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛毎参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麆游锛毎麑⒛康幕驅(qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。Ca 處理細胞處理細胞 2+農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點：易感染農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單

11、子葉，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。植物沒有感染能力。原理：原理：TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T TDNADNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的細胞染色體的DNADNA上。上。基因槍法：基因槍法： 單子葉植物單子葉植物花粉管通道法：花粉管通道法： 抗蟲棉抗蟲棉 目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 轉(zhuǎn)基因受精卵轉(zhuǎn)基因受精卵 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物顯微注射法顯微注射法顯微注射法顯微注射法 用用CaCa2+2+處理細胞處理細胞 感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受感受

12、態(tài)細胞吸收態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子將目的基因?qū)胛⑸锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎竽c桿菌大腸桿菌四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定分子水分子水平檢測平檢測個體水個體水平鑒定平鑒定檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否上是否 插入了目的基因插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法方法 DNADNA分子雜交分子雜交方法方法 抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交抗蟲鑒定、抗病鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定等方法方法 DNADNA分子雜交分子雜交 基因探針基因探針：是一小段單鏈的：是一小段單鏈的DNADNA或或RNARNA，帶有，帶有放射性同位素標記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)放射性同位素標記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)生堿基互補配對。生堿基互補配對。 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNAmRNA方法方法DNA與與mRNA雜交雜交檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)方法方法抗原抗原抗體雜交抗體雜交檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因 DNA與與DNA雜交雜交 檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金桿菌中檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金