基因工程的原理和技術(shù)

1、利用基因工程原理讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素利用基因工程原理讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素又需要哪些基本操作步驟呢？又需要哪些基本操作步驟呢？第二節(jié)第二節(jié) 基因工程的原理和技術(shù)基因工程的原理和技術(shù)基因工程（將人胰島素基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌基因工程（將人胰島素基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌）胰島素基因胰島素基因人體細(xì)胞人體細(xì)胞大腸桿菌大腸桿菌隨細(xì)菌的增殖，胰島素隨細(xì)菌的增殖，胰島素基因也同時(shí)復(fù)制基因也同時(shí)復(fù)制胰胰島島素素獲取胰島獲取胰島素基因的素基因的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物胰島素胰島素質(zhì)粒質(zhì)粒大腸桿菌大腸桿菌剪切剪切拼接拼接導(dǎo)入導(dǎo)入表達(dá)表達(dá)基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）1 1、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞、

2、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞2 2、目的基因的表達(dá)、目的基因的表達(dá)問(wèn)題：獲取目的基因的方法有哪些？思考思考1 1：如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完全如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完全未知，比如未知，比如: :如果我們對(duì)抗蟲(chóng)基因的堿基序列如果我們對(duì)抗蟲(chóng)基因的堿基序列完全不知道，怎樣從完全不知道，怎樣從蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌體內(nèi)獲體內(nèi)獲取目的基因（抗蟲(chóng)基因）？取目的基因（抗蟲(chóng)基因）？ 如何操作？如何操作？ 大片段大片段DNA打成許多小片段打成許多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因載入運(yùn)載體載入運(yùn)載體細(xì)菌細(xì)菌重組重組DNA分子分子重組重組DNA分子分子例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲(chóng)蛋白的基因

3、例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲(chóng)蛋白的基因如果運(yùn)氣不如果運(yùn)氣不好，在打成好，在打成小片段時(shí)，小片段時(shí)，有可能把抗有可能把抗蟲(chóng)基因打蟲(chóng)基因打斷斷基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)如何從基如何從基因文庫(kù)中因文庫(kù)中獲取目的獲取目的基因基因? ?大片段大片段DNA打成許多小片段打成許多小片段小片段小片段DNA目的基因目的基因載入運(yùn)載體載入運(yùn)載體細(xì)菌細(xì)菌重組重組DNA分子分子重組重組DNA分子分子基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)對(duì)基因組文庫(kù)對(duì)基因組文庫(kù)的所有細(xì)菌進(jìn)的所有細(xì)菌進(jìn)行逐一篩查行逐一篩查找出有抗蟲(chóng)蛋找出有抗蟲(chóng)蛋白的菌落白的菌落該菌落所攜帶該菌落所攜帶的基因片段就的基因片段就含有目的基因含有目的基因例如：從蘇云金芽孢桿菌中

4、提取抗蟲(chóng)蛋白的基因例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲(chóng)蛋白的基因容易嗎？容易嗎？構(gòu)建基因組文庫(kù)，獲取目的基因構(gòu)建基因組文庫(kù)，獲取目的基因一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)1.1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取單鏈單鏈RNA（mRNA)mRNA)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雜交雙鏈雙鏈核酸酶核酸酶H單鏈單鏈DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA逆（反）轉(zhuǎn)錄法合成目的基因：逆（反）

5、轉(zhuǎn)錄法合成目的基因： cDNA cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建RNA鏈鏈DNA鏈鏈水解水解RNA一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)mRNAmRNA逆逆( (反）轉(zhuǎn)錄反）轉(zhuǎn)錄目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)1.1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取提取提取思考：思考：基因文庫(kù)如

6、同國(guó)家圖書(shū)館，而基因文庫(kù)如同國(guó)家圖書(shū)館，而cDNAcDNA文庫(kù)則像某文庫(kù)則像某單位的圖書(shū)館，二者除了大小不同之外，還有哪些單位的圖書(shū)館，二者除了大小不同之外，還有哪些區(qū)別？區(qū)別？ 文庫(kù)類型文庫(kù)類型cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中啟動(dòng)子基因中終止子基因中終止子基因多少基因多少小小大大無(wú)無(wú) 有有無(wú)無(wú) 有有部分基因部分基因全部基因全部基因思考：思考： 如果想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的如果想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)不同階段表達(dá)的基因有什么不同，需要構(gòu)建哪一種基因文庫(kù)？的基因有什么不同，需要構(gòu)建哪一種基因文庫(kù)？問(wèn)題：獲取目的基因的方法有哪些？思考思

7、考1 1：如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？全未知，怎樣辦？如何操作？思考思考2 2：如果我們已知目的基因的堿基序列，如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？可以怎樣操作？ 一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)目的基

8、因的核苷目的基因的核苷酸序列是已知酸序列是已知 化學(xué)合成法化學(xué)合成法目的基因目的基因1.1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取2.2.化學(xué)合成法化學(xué)合成法提取提取形成重組形成重組DNA分子分子形成重組形成重組DNA分子分子問(wèn)題：獲取目的基因的方法有哪些？思考思考1 1：如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？全未知，怎樣辦？如何操作？思考思考2 2：如果我們已知目的基因的堿基序列，如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？可以怎樣操作？思考思考3 3： 如果我們已知蛋白質(zhì)的氨基酸序如果我們已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，又可以怎樣操作？列，又可以怎樣操作

9、？ 化化學(xué)學(xué)合合成成法法一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)目的基因的核苷酸序目的基因的核苷酸序列是已知列是已知 化學(xué)合成法化學(xué)合成法目的基因目的基因1.1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取2.2.化學(xué)合成法化學(xué)合

10、成法提取提取或可推測(cè)的或可推測(cè)的問(wèn)題：獲取目的基因的方法有哪些？思考思考1 1：如果我們對(duì)目的基因的堿基序列如果我們對(duì)目的基因的堿基序列完全未知，怎樣辦？如何操作？完全未知，怎樣辦？如何操作？思考思考2 2：如果我們已知目的基因的堿基序如果我們已知目的基因的堿基序列，可以怎樣操作？列，可以怎樣操作？思考思考3 3： 如果我們已知蛋白質(zhì)的氨基酸序如果我們已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，又可以怎樣操作？列，又可以怎樣操作？思考思考4 4：如果我們知道目的基因兩端的部如果我們知道目的基因兩端的部分堿基序列，還可以怎樣操作？分堿基序列，還可以怎樣操作？雙鏈雙鏈DNA1.變性變性升溫升溫至至95單鏈單鏈DNA2

11、.復(fù)性復(fù)性降溫降溫至至60引物與母引物與母鏈結(jié)合鏈結(jié)合3.延伸延伸升溫升溫至至72DNA聚合酶聚合酶解旋解旋PCRPCR技術(shù)與原理技術(shù)與原理Taq DNA聚合酶聚合酶有耐高溫的特點(diǎn)有耐高溫的特點(diǎn)思考：思考：PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，需要什么前提和技術(shù)擴(kuò)增目的基因，需要什么前提和條件？過(guò)程如何？原理是什么？條件？過(guò)程如何？原理是什么？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR(PCR技術(shù)技術(shù)) )擴(kuò)增擴(kuò)增原理：原理：目的：目的：前提：前提：條件：條件：DNA復(fù)制復(fù)制獲得大量的目的基因獲得大量的目的基因有一段已知目的基因（兩端）有一段已知目的基因（兩端）的核苷酸序列的核苷酸序列,以便根據(jù)這一以便根據(jù)

12、這一序列合成序列合成引物引物。模板模板DNA（目的基因）（目的基因）耐高溫耐高溫DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶) )四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸兩種兩種DNADNA引物引物一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因生物生物材料材料DNADNA提取提取限制酶限制酶DNADNA片段片段形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建構(gòu)建基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄目的基因目的基因(cDNA)(cDNA)形成重組形成重組DNA分子分子導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌受體菌群體群體構(gòu)建

13、構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)目的基因的核苷酸序目的基因的核苷酸序列是已知列是已知 化學(xué)合成法化學(xué)合成法3.3.利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的基因目的基因1.1.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取2.2.化學(xué)合成法化學(xué)合成法提取提取獲取大量目的基因獲取大量目的基因或可推測(cè)的或可推測(cè)的第一個(gè)循環(huán)第一個(gè)循環(huán)第二第二個(gè)循個(gè)循環(huán)環(huán)第第三三個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán)最快第幾輪能得到目的基因？最快第幾輪能得到目的基因？體內(nèi)體內(nèi)DNADNA復(fù)制復(fù)制體外體外PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增模板模板解解旋旋引物引物酶酶DNADNA分子分子目的基因目的基因解旋酶解旋酶高溫（加熱至高溫（加熱至9595）RNARNA引物引物DNADNA

14、引物引物解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 人工基因合成法人工基因合成法DNADNA合成儀合成儀PCRPCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因問(wèn)題：?jiǎn)栴}：怎樣將目的基因與質(zhì)粒進(jìn)行重組？怎樣將目的基因與質(zhì)粒進(jìn)行重組？質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA連接酶連接酶重組重組DNA同一種限制酶切割同一種限制酶切割質(zhì)粒質(zhì)粒外源基因外源基因重組重組DNA分子分子（重組質(zhì)粒）（重組質(zhì)粒）DNA連接酶連接酶問(wèn)題問(wèn)題2：形成的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，除了能形成的重組質(zhì)粒導(dǎo)

15、入受體細(xì)胞后，除了能夠穩(wěn)定存在外，并且可以遺傳給下一代。同時(shí)，使夠穩(wěn)定存在外，并且可以遺傳給下一代。同時(shí)，使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用，需要對(duì)重目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用，需要對(duì)重組質(zhì)粒作怎樣的修飾？組質(zhì)粒作怎樣的修飾？據(jù)圖回答：據(jù)圖回答：一個(gè)表達(dá)載體的組成，除了目的基一個(gè)表達(dá)載體的組成，除了目的基因外，還必須有哪些基本元件？因外，還必須有哪些基本元件？( (二二) )形成重組形成重組DNADNA分子（構(gòu)建基因分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體表達(dá)載體) )基因表基因表達(dá)載體達(dá)載體的組成的組成啟動(dòng)子啟動(dòng)子目的基因目的基因終止子終止子復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記基因標(biāo)記基因一一. .基因工程的基本操

16、作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因通常用通常用同一種同一種限制酶切割目的基因和載體限制酶切割目的基因和載體( (質(zhì)粒質(zhì)粒) )，形成相同，形成相同的粘性末端，再用的粘性末端，再用DNADNA連接酶將二者連接連接酶將二者連接, ,形成重組形成重組DNADNA分子分子（基因表達(dá)載體）。（基因表達(dá)載體）。( (三三) )將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞( (二二) )形成重組形成重組DNADNA分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體) )一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基

17、因獲得目的基因重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒大腸桿菌的擬核大腸桿菌的擬核目的基因目的基因氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因（標(biāo)記基因）（標(biāo)記基因）將細(xì)菌用將細(xì)菌用CaCl2處理，使處理，使細(xì)胞處于感受態(tài)，可促細(xì)胞處于感受態(tài)，可促進(jìn)細(xì)胞吸收進(jìn)細(xì)胞吸收DNA分子分子如果是導(dǎo)入微生物（如細(xì)菌）如果是導(dǎo)入微生物（如細(xì)菌） 感受態(tài)感受態(tài)：細(xì)胞處于容易吸收外源性細(xì)胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)。的狀態(tài)。 處于感受態(tài)的細(xì)胞稱為處于感受態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞.042如果是導(dǎo)入微生物（如細(xì)菌）如果是導(dǎo)入微生物（如細(xì)菌）( (三三) )目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1. 1. 轉(zhuǎn)基因微生物轉(zhuǎn)基因微生物重

18、組重組DNADNA分子分子( (基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體) )CaClCaCl2 2處理處理感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞菌細(xì)胞( (工程菌工程菌) ) 目的基目的基因隨受因隨受體細(xì)胞體細(xì)胞的繁殖的繁殖而復(fù)制而復(fù)制增大細(xì)胞壁通透性增大細(xì)胞壁通透性( (二二) )形成重組形成重組DNADNA分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體) )一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因吸收吸收DNA分子分子重組重組 DNA進(jìn)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞入細(xì)菌細(xì)胞如果是導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞如果是導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射儀顯微注射儀受精卵受精卵思考：思考：培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)

19、，受培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞能否采用動(dòng)物體細(xì)胞能否采用動(dòng)物體體細(xì)胞細(xì)胞？試說(shuō)明理由。一？試說(shuō)明理由。一般可以采用動(dòng)物的什么般可以采用動(dòng)物的什么細(xì)胞？細(xì)胞？( (三三) )目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1. 1. 轉(zhuǎn)基因微生物轉(zhuǎn)基因微生物重組重組DNADNA分子分子( (基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體) )CaClCaCl2 2處理處理感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞菌細(xì)胞( (工程菌工程菌) ) 目的基目的基因隨受因隨受體細(xì)胞體細(xì)胞的繁殖的繁殖而復(fù)制而復(fù)制增大細(xì)胞壁透性增大細(xì)胞壁透性2. 2. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物重組重組DNADNA分子分子顯微注射顯微注射受精卵受精卵或早或早期胚胎細(xì)胞期胚胎細(xì)胞

20、( (整合到染色整合到染色體體DNADNA上上) )轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng) 物物動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植( (二二) )形成重組形成重組DNADNA分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體) )一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因吸收吸收DNA分子分子重組重組 DNA進(jìn)入細(xì)菌進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞細(xì)胞或病毒侵染或病毒侵染思考：思考：1、如果是導(dǎo)入植物細(xì)胞，最好以什么細(xì)、如果是導(dǎo)入植物細(xì)胞，最好以什么細(xì)胞為受體細(xì)胞？一般采用的運(yùn)載體又是胞為受體細(xì)胞？一般采用的運(yùn)載體又是什么？什么？2、比如：培育抗蟲(chóng)棉，怎樣操作才能成、

21、比如：培育抗蟲(chóng)棉，怎樣操作才能成功導(dǎo)入？功導(dǎo)入？農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌的農(nóng)桿菌的TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒T-DNAT-DNA：( (可轉(zhuǎn)移的可轉(zhuǎn)移的DNADNA） 可轉(zhuǎn)移可轉(zhuǎn)移（也可以將目的基因轉(zhuǎn)移）（也可以將目的基因轉(zhuǎn)移）至受體細(xì)至受體細(xì)胞中，并且整合到受體細(xì)胞染色體的胞中，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNADNA上。上。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法3. 3. 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物重組重組DNADNA分子分子農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌植物體細(xì)胞植物體細(xì)胞( (整合到細(xì)胞整合到細(xì)胞染色體染色體DNADNA上上) )侵染侵染植物組植物組織培養(yǎng)織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植物植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)利用

22、壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒力，將包裹在金屬顆粒（有鎢粉粒子和金粉粒（有鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在子，粒子的直徑一般在0.64um）表面的表達(dá)）表面的表達(dá)載體載體DNA打入受體細(xì)胞打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。合并表達(dá)的方法。 這是單子葉植物中常這是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本太高。但是成本太高?；驑尰驑尰ǚ酃芑ǚ酃苈鸭?xì)胞卵細(xì)胞花粉管通道法花粉管通道法受精后 花粉管通道法花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加粉管還未愈合前，剪去

23、柱頭，然后，滴加DNADNA（含目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞?；颍?，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。3. 3. 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物重組重組DNADNA分子分子農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌植物體細(xì)胞植物體細(xì)胞( (整合到細(xì)胞整合到細(xì)胞染色體染色體DNADNA上上) )侵染侵染植物組植物組織培養(yǎng)織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植物植物基因槍或基因槍或花粉管通道法花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法( (三三) )目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞( (二二) )形成重組形成重組DNADNA分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體分子（構(gòu)建基因表達(dá)載體) )一一. .基因工程的基本操作步驟基因工程的基本

24、操作步驟（技術(shù)）（技術(shù)）( (一一) )獲得目的基因獲得目的基因( (四四) )目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定問(wèn)題問(wèn)題1 1：根據(jù)中心法則，目的基因怎樣根據(jù)中心法則，目的基因怎樣表達(dá)？成功表達(dá)的標(biāo)志是什么？表達(dá)？成功表達(dá)的標(biāo)志是什么？按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了蛋白質(zhì)檢測(cè)個(gè)體是否具有目的基因所對(duì)應(yīng)表現(xiàn)型檢測(cè)個(gè)體是否具有目的基因所對(duì)應(yīng)表現(xiàn)型如何檢測(cè)如何

25、檢測(cè) ？思考：通常為什么要選用含有兩個(gè)標(biāo)記基因的運(yùn)載體？思考：通常為什么要選用含有兩個(gè)標(biāo)記基因的運(yùn)載體？沒(méi)有質(zhì)粒沒(méi)有質(zhì)粒含目的基含目的基因的質(zhì)粒因的質(zhì)粒正常質(zhì)粒正常質(zhì)粒沒(méi)有質(zhì)粒沒(méi)有質(zhì)粒含目的基因的質(zhì)粒含目的基因的質(zhì)粒正常質(zhì)粒正常質(zhì)粒DNA分子雜交法檢測(cè)目的基因分子雜交法檢測(cè)目的基因DNADNA分子雜交法分子雜交法制作方法：制作方法： 化學(xué)合成或化學(xué)合成或PCRPCR法合成法合成特點(diǎn)：特點(diǎn)：1.1.被放射性同位素標(biāo)記被放射性同位素標(biāo)記2.2.目的基因片段目的基因片段3.3.單鏈單鏈DNADNA原理：原理： 堿基互補(bǔ)配對(duì)，檢測(cè)未知堿基互補(bǔ)配對(duì)，檢測(cè)未知DNADNA分子分子用途：用途： 目的基因檢測(cè)

26、目的基因檢測(cè),DNA,DNA指紋指紋, ,親緣關(guān)系測(cè)定親緣關(guān)系測(cè)定, ,基因診斷?；蛟\斷。DNADNA分子探針?lè)ǚ肿犹结樂(lè)z測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因同理：同理： 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)利用利用抗原抗原-

27、抗體抗體的特異性結(jié)合的特異性結(jié)合按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)問(wèn)題：?jiǎn)栴}：如何運(yùn)用抗原抗體特異性結(jié)合的原理檢測(cè)如何運(yùn)用抗原抗體特異性結(jié)合的原理檢測(cè)目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)？目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)？檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)利用利用抗原抗原-抗體抗體的特異性結(jié)合的特異性結(jié)合將目的基因表達(dá)出將目的基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)作為抗原的蛋白質(zhì)作為抗原制備抗體制備抗體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)是否已含有目的基因檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否已轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了

28、蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否已翻譯出了蛋白質(zhì)檢測(cè)個(gè)體是否具有目的基因所對(duì)應(yīng)表現(xiàn)型檢測(cè)個(gè)體是否具有目的基因所對(duì)應(yīng)表現(xiàn)型按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)按照基因表達(dá)順序逐步檢測(cè)，逐步過(guò)關(guān)問(wèn)題：?jiǎn)栴}：除了上述分子檢測(cè)外，你能否在個(gè)體生物學(xué)水平上進(jìn)行除了上述分子檢測(cè)外，你能否在個(gè)體生物學(xué)水平上進(jìn)行檢測(cè)？例如，如何檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉具有抗蟲(chóng)特性？檢測(cè)？例如，如何檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉具有抗蟲(chóng)特性？ 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物抗蟲(chóng)植物用棉花葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)，用棉花葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃

29、后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。得到表達(dá)。( (四四) )目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定1.1.目的基因是否導(dǎo)入：目的基因是否導(dǎo)入：(1)(1)標(biāo)記基因檢測(cè)法。標(biāo)記基因檢測(cè)法。(2)DNA(2)DNA分子雜交法分子雜交法( (DNADNA探針檢測(cè)法探針檢測(cè)法) )2.2.目的基因是否表達(dá)：目的基因是否表達(dá)：(3)(3)是否出現(xiàn)目的基因所控制的性狀是否出現(xiàn)目的基因所控制的性狀: :(2)(2)是否翻譯合成了蛋白質(zhì)：是否翻譯合成了蛋白質(zhì)： 抗原抗體雜交檢測(cè)法抗原抗體雜交檢測(cè)法核酸分子雜交法核酸分子雜交法（1 1）是否轉(zhuǎn)錄出了信使）是否轉(zhuǎn)錄出了信使RN

30、ARNA：觀察法觀察法基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因文庫(kù)基因文庫(kù)獲取目的基因獲取目的基因基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)化學(xué)合成法化學(xué)合成法PCRPCR擴(kuò)增法擴(kuò)增法運(yùn)載體（細(xì)菌質(zhì)粒）運(yùn)載體（細(xì)菌質(zhì)粒）酶切、連接，構(gòu)建酶切、連接，構(gòu)建重組重組DNADNA（基因表達(dá)載體）（基因表達(dá)載體）受體細(xì)胞受體細(xì)胞導(dǎo)入導(dǎo)入篩選篩選動(dòng)物受精卵動(dòng)物受精卵植物體細(xì)胞植物體細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)發(fā)酵工程發(fā)酵工程胚胎移植胚胎移植表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物目的基因的表達(dá)與鑒定目的基因的表達(dá)與鑒定總結(jié)：總結(jié)：二二. .基因工程的原理基因工程的原理1.

31、1.整體原理：整體原理：人工的基因重組人工的基因重組2.2.各步驟原理：各步驟原理：（1 1）基因能轉(zhuǎn)移：）基因能轉(zhuǎn)移：基因是獨(dú)立的遺傳單位基因是獨(dú)立的遺傳單位（2 2）不同生物的基因能拼接：）不同生物的基因能拼接：不同生物的不同生物的DNADNA有著相同的雙螺旋結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，有著相同的雙螺旋結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，限制酶和連接酶的作用。限制酶和連接酶的作用。（3 3）同一基因在不同生物的細(xì)胞中合成相同的蛋白質(zhì)：）同一基因在不同生物的細(xì)胞中合成相同的蛋白質(zhì)：復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程相同，密碼子具有通用性復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程相同，密碼子具有通用性3.3.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：定向改變生物的遺傳特性定

32、向改變生物的遺傳特性例例1 1 科學(xué)工作者分離得到了某真核生物的基因科學(xué)工作者分離得到了某真核生物的基因A A，將其解離成兩條，將其解離成兩條具有互補(bǔ)關(guān)系的單鏈，其中的一條與基因具有互補(bǔ)關(guān)系的單鏈，其中的一條與基因A A的信使的信使RNARNA進(jìn)行配對(duì)，雜進(jìn)行配對(duì)，雜交后可以觀察到如圖所示的結(jié)構(gòu)對(duì)此結(jié)果的合理解釋是（）交后可以觀察到如圖所示的結(jié)構(gòu)對(duì)此結(jié)果的合理解釋是（）A A1 1、3 3、5 5、7 7為為DNA/RNADNA/RNA的雜交體，的雜交體，2 2、4 4、6 6為單鏈為單鏈DNADNA部分部分B B1 1、3 3、5 5、7 7為為DNA/RNADNA/RNA的雜交體，的雜交體

33、，2 2、4 4、6 6為單鏈為單鏈RNARNA部分部分C C1 1、3 3、5 5、7 7為雙鏈為雙鏈DNADNA部分，部分，2 2、4 4、6 6為為DNA/RNADNA/RNA的雜交體的雜交體D D1 1、3 3、5 5、7 7為單鏈為單鏈RNARNA部分，部分，2 2、4 4、6 6為為DNA/RNADNA/RNA的雜交體的雜交體A例例2 2. .質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，質(zhì)粒上有標(biāo)記基因質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體，質(zhì)粒上有標(biāo)記基因（如圖所示），通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因（目的基因）（如圖所示），通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因（目的基因）是否轉(zhuǎn)移成功。外源基因插入的位置不同，

34、細(xì)菌在培養(yǎng)基上是否轉(zhuǎn)移成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況也不同。右圖表示外源基因插入位置（插入點(diǎn)有的生長(zhǎng)情況也不同。右圖表示外源基因插入位置（插入點(diǎn)有a a、b b、c c），請(qǐng)據(jù)下表細(xì)菌生長(zhǎng)情況，推測(cè)三種重組），請(qǐng)據(jù)下表細(xì)菌生長(zhǎng)情況，推測(cè)三種重組細(xì)菌與外源基因插入點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一組是細(xì)菌與外源基因插入點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一組是 重組重組細(xì)菌細(xì)菌含氨芐青霉含氨芐青霉素培養(yǎng)基素培養(yǎng)基含四環(huán)素的含四環(huán)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)基能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)A是是c、是是a 、是是 b B 是是c和和b、是是b、是是cC是是c和和b、是是c、是是b D

35、是是a、是是b、是是cbacAbca例例3.培育轉(zhuǎn)基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（培育轉(zhuǎn)基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作為）常作為標(biāo)記基因標(biāo)記基因,只有含卡那霉素抗性基因的細(xì)胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基只有含卡那霉素抗性基因的細(xì)胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下圖為獲得抗蟲(chóng)棉的技術(shù)流程上生長(zhǎng)。下圖為獲得抗蟲(chóng)棉的技術(shù)流程. 抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)基因含含kankan質(zhì)粒質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒土壤土壤農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌含重組質(zhì)粒含重組質(zhì)粒土壤農(nóng)桿菌土壤農(nóng)桿菌A A構(gòu)建構(gòu)建C C誘導(dǎo)誘導(dǎo)選擇選擇導(dǎo)入導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植株抗蟲(chóng)植株再生植株再生植株愈傷愈傷組織組織離體棉花離體棉花葉片組織葉片組織侵染侵染B

36、B培養(yǎng)培養(yǎng)選擇選擇分分化化D D檢測(cè)檢測(cè)（1）A過(guò)程需要的酶有過(guò)程需要的酶有 _ 。（2）B過(guò)程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為運(yùn)載體必須具過(guò)程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為運(yùn)載體必須具備備 的兩個(gè)條件是的兩個(gè)條件是_ 。（3）C過(guò)程的培養(yǎng)基除含有必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、瓊脂和激素過(guò)程的培養(yǎng)基除含有必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、瓊脂和激素外，還必須加入外，還必須加入_。限制性核酸內(nèi)切酶和限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶連接酶能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因卡那霉素卡那霉素4.如果利用如果利用DNA分子雜交原理對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)，分子雜交原理對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)，D過(guò)程應(yīng)該用過(guò)程應(yīng)該用_作為探針。作為探針。 5.科學(xué)家發(fā)現(xiàn)

37、轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符科學(xué)家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。將轉(zhuǎn)基因植株與將轉(zhuǎn)基因植株與_雜交，其后代雜交，其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為1：1。若該轉(zhuǎn)基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與若該轉(zhuǎn)基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為卡那霉素敏感型的數(shù)量比為_(kāi)。若將該轉(zhuǎn)基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離若將該轉(zhuǎn)基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株占占_%。標(biāo)記的目的基因標(biāo)記的目的基因非卡那霉素敏感型非卡那霉素敏感型3:1100 例例4 4. .科學(xué)家將外源目的基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組，科學(xué)家將外源目的基因與大腸桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行重組，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。下圖表示構(gòu)建