不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蟥生長(zhǎng)和內(nèi)在品質(zhì)影響的研究お

1、不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)和內(nèi)在品質(zhì)影響的研究扮摘要采用生物量測(cè)定、3,5二硝基水楊酸比色法、對(duì)棕桐酸硝基苯酯（pNPP）比色法、福林酚法等方法研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)、消化酶活性、生化指標(biāo)和內(nèi)在品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：螞蛾的最終質(zhì)量，特定生長(zhǎng)率（SGR）,增重率（WGR）,淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶活力，SOD,CAT,ALP酶活性與密度呈反比，與換水頻率呈正比（P<005）;換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負(fù)相關(guān)，與溶氧量呈正相關(guān)；養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著。因此，每畝50萬(wàn)條為較適宜的養(yǎng)殖密度，每72h1次為較

2、適宜的換水頻率。關(guān)鍵詞螞蛾；養(yǎng)殖密度；換水頻率；生長(zhǎng)；消化酶；抗逆酶螞蛾WhitmaniapigraWhitman,又名寬體金線蛭，屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門黃蛭科動(dòng)物1,其干燥全體為中藥材水蛭，是中國(guó)藥典2015年版水蛭藥材收載主要來(lái)源，具有破血通經(jīng)，逐瘀消？Y的功效2o由于市場(chǎng)對(duì)水蛭藥材的巨大需求以及環(huán)境污染的日益加重，導(dǎo)致野生螞蛾資源瀕臨枯竭。目前雖然螞蛾室外人工養(yǎng)殖技術(shù)取得了初步成功，但仍存在許多諸如水溫、光照等不可控因素，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。近幾年來(lái)有關(guān)螞蛾適宜生長(zhǎng)的溫度、呼吸和消化等生理特性以及分子生物學(xué)都進(jìn)行了相關(guān)研究38，但鮮見養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)影響的相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬

3、研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)和內(nèi)在品質(zhì)的影響，以期為螞蛾室內(nèi)養(yǎng)殖提供參考和依據(jù)。1材料螞蛾由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所提供，經(jīng)郭巧生教授鑒定為螞蛾Wpigra;螺蛔（采自南京前湖，野生）經(jīng)郭巧生教授鑒定為梨形環(huán)棱螺BellamyapurificataHeude;曝氣24h的自來(lái)水。電子天平（山海精密儀器廠）、5810R離心機(jī)（eppendorf）、756CRT紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）、FA1104分析天平（上海精科天平廠）、勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、pH計(jì)（青島昱昌科技有限公司）、FW100小型高速粉碎機(jī)（天津華鑫儀器廠）、KQ250B超聲儀（昆山市超聲儀器公

4、司）、電熱恒溫豉風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、HHS型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、MR210A溶氧測(cè)量?jī)x（南京特安科貿(mào)有限公司）、YC07型水質(zhì)分析儀（青島昱昌科技有限公司）。DNS試齊心pNPP溶液、福林酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、連苯三酚、324mmol?L-1鋁酸鏤溶液、50mmol?L-1對(duì)硝基苯磷酸二鈉。2方法21實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，容器為容積2L的塑料瓶（瓶底面積133X10-2m2,實(shí)際養(yǎng)殖用水1L,水深12cm）,實(shí)驗(yàn)螞蛾體重為（095±016）go設(shè)5個(gè)養(yǎng)殖密度，分別為1（按照瓶底面積算，相當(dāng)于5萬(wàn)條/畝），5,10,15,20條/瓶，分另I標(biāo)

5、記為SD1,SD2,SD3,SD4,SD5組，每個(gè)處理重復(fù)10次，24h換水1次。設(shè)置5個(gè)換水頻率，分別為每隔12,24,48,72,96h換水1次，每次換水1L,每瓶10條螞蛾，每個(gè)處理重復(fù)10次，分別標(biāo)記為H1,H2,H3,H4,H5組。實(shí)驗(yàn)期間其他管理方法相同，投喂經(jīng)自來(lái)水暫養(yǎng)3d后的新鮮螺蛔，實(shí)驗(yàn)時(shí)間40d,期間保持室溫（25±1）Co22樣品的采集和保存實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)平行組隨機(jī)取10條螞蛾，將活螞蛾于冰盤內(nèi)解剖，取消化道，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，稱重，冰浴中勻漿，用生理鹽水稀釋成含原漿20%的溶液，冷凍離心10min（轉(zhuǎn)速為1萬(wàn)r?min-1）,取上清液為酶

6、液，置于4C冰箱中保存，并在24h內(nèi)測(cè)定完成。每個(gè)平行組隨機(jī)選取15條螞蛾，在50C條件下干燥24h,粉碎后過(guò)40目篩，置于試劑瓶中干燥避光保存，用于測(cè)定內(nèi)在品質(zhì)。23生長(zhǎng)性能的測(cè)定分別在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)稱量各瓶中螞蛾的體重，計(jì)算由平均質(zhì)量，由公式計(jì)算特定生長(zhǎng)率（SGR）和增重率（WGR）。SGR=（lnWt-lnW0）/tx100%;WGR=（Wt-W0）/W0X100%,式中W0為實(shí)驗(yàn)開始時(shí)螞蛾的平均質(zhì)量（g）,Wt為結(jié)束時(shí)螞蛾的平均質(zhì)量（g）,t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)（d）。24消化酶活性的測(cè)定方法蛋白酶活性測(cè)定采用福林酚法9在37C,pH分別為32,92時(shí)，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1以g酪氨酸定義為1

7、個(gè)蛋白酶活力單位（U）;淀粉酶的活力測(cè)定采用3,5二硝基水楊酸比色法9在37C時(shí)，單位體積酶量，每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖的產(chǎn)量為1個(gè)酶活力單位（U）;脂肪酶活力測(cè)定采用對(duì)棕桐酸硝基苯酯（pNPP）比色法10在37C,pH82時(shí)，每分鐘催化釋放1以mol對(duì)硝基酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）o25超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性測(cè)定方法SOD活性測(cè)定采用鄭碧玉等11的方法，25c下，1mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定為1個(gè)活力單位（U）oCAT活性采用比色法測(cè)定12,每分鐘分解1以mol的過(guò)氧化氫即為1個(gè)酶活力單位（U）oALP活性測(cè)定參考？a琳

8、等13的方法，30C條件下，每分鐘產(chǎn)生1以mol的對(duì)硝基酚，為1個(gè)酶活力單位（U）o組織勻漿液的蛋白含量以考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。酶的比活力=酶活力/蛋白含量26螞蛾內(nèi)在品質(zhì)的測(cè)定方法參考中國(guó)藥典22015年版一部測(cè)定水蛭藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH、抗凝血酶活性。27水體質(zhì)量的測(cè)定每個(gè)處理組換水時(shí)測(cè)定水體質(zhì)量。使用溶氧儀測(cè)定水中溶氧量；使用水質(zhì)分析儀測(cè)定水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫的含量。28數(shù)據(jù)分析采用MicrosoftExcel2013和SPSS190（OnewayANOVA,多重比較采用Duncan's法）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3結(jié)果與分析31不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)性能

9、的影響SD1特定生長(zhǎng)率和增重率顯著大于其他4組（P<005）,SD2的特定生長(zhǎng)率與SD3沒(méi)有差異，與SD4和SD5相比有顯著性差異（P<005）。換水頻率與最終體重、特定生長(zhǎng)率和增重率成反比，其中H5顯著小于H1和H2（P<005）,其他各組之間沒(méi)有顯著性差異，見表1。32不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾消化酶活性的影響消化酶活性與密度基本成負(fù)相關(guān)。其中淀粉酶：SD1最高，與其他4組均有顯著性差異（P<005）,SD3,SD4和SD5之間沒(méi)有顯著性差異，但均與SD2有顯著性差異（P<005）;脂肪酶：除SD1和SD2,SD4和SD5之間無(wú)顯著差異外，各組別之間均顯著差

10、異（P<005）。酸性蛋白酶：SD1,SD2,SD3組顯著高于SD4和SD5組（P<005）,其他各組之間無(wú)顯著性差異。堿性蛋白酶：SD1顯著大于其他各組（P<005）,其中SD2,SD3與SD4,SD5相比有顯著性差異（P<005）,見表2。消化酶活性與換水頻率基本成正相關(guān)。其中淀粉酶：H1顯著高于其他4組（P<005）,其中H4,H5淀粉酶活性顯著小于H2,H3（P<005）;H1的脂肪酶活性和堿性蛋白酶活性顯著高于其他各組（P<005）;H5酸性蛋白酶活性顯著小于H1,H2（P<005）。33不同養(yǎng)殖密度對(duì)螞蛾抗逆酶活性的影響抗逆酶活性與密

11、度基本成負(fù)相關(guān)。SD4,SD5的SOD活性，顯著小于其他各組（P<005）oSD2,SD3的CAT活性顯著小于SD1（P<005）,顯著大于SD4,SD5（P<005）。SD1,SD2的ALP活性顯著高于其他各組（P<005），見表3?？鼓婷富钚耘c換水頻率基本成正相關(guān)。H4,H5組SOD活性顯著小于其他各組（P<005）;H1,H2組CAT顯著高于其他各組（P<005）;H1組ALP活性顯著高于其他各組（P<005）。34不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)水蛭內(nèi)在品質(zhì)的影響?zhàn)B殖密度和換水頻率對(duì)水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著，見表4。35

12、不同換水頻率對(duì)水體質(zhì)量的影響換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負(fù)相關(guān)，與溶氧量呈正相關(guān)，各組之間呈顯著性差異（P<005）,見表5。4討論41不同養(yǎng)殖密度對(duì)螞蛾生長(zhǎng)和消化酶活性的影響?zhàn)B殖密度是影響水生生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素1415,研究發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖密度增大，群體內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)加劇，對(duì)個(gè)體攝食產(chǎn)生負(fù)面影響16。本研究結(jié)果顯示，螞蛾特定生長(zhǎng)率與養(yǎng)殖密度成反比、與換水頻率成正比，與孫學(xué)亮等17關(guān)于半滑舌羈、張?zhí)鞎r(shí)等18對(duì)中國(guó)對(duì)蝦和肖鳴鶴等19關(guān)于克氏原螫蝦的研究結(jié)果相似。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖密度的增加，螞蛾種群間的個(gè)體差異度增大，Brett20認(rèn)為這是由于種群內(nèi)個(gè)體爭(zhēng)奪有限的食物資源，使小

13、個(gè)體不能夠獲得充足的食物，從而導(dǎo)致個(gè)體間的生長(zhǎng)差異，此外高密度組螞蛾由于組內(nèi)個(gè)體之間競(jìng)爭(zhēng)增大可能導(dǎo)致能量消耗增加，進(jìn)而生長(zhǎng)率下降。Fendersen21等研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖會(huì)引起生物行為和生理變化，從而對(duì)養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)產(chǎn)生有害的影響。消化酶活性是衡量消化能力的重要指標(biāo)22,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示密度與螞蛾消化酶活性成反比，與肖鶴鳴等19的報(bào)道相似，因此可能高密度組螞蛾組間個(gè)體競(jìng)爭(zhēng)加劇導(dǎo)致消化酶活性降低從而使攝食量減少或消化不良，進(jìn)而影響了生長(zhǎng)。42不同換水頻率對(duì)螞蛾生長(zhǎng)、消化酶活性、水體質(zhì)量的影響換水頻率的增加能有效的增加水體中的氧含量，水體中溶解氧含量豐富會(huì)使氧化分解作用活躍，加速水中污染物的降解2

14、3o李健等24報(bào)道水體中氨氮、硫化氫等有害物質(zhì)的含量與溶解氧有密切關(guān)系，水中溶氧量減小使NH4+N和NO2-N等積累2527。吳垠等28發(fā)現(xiàn)水中溶氧量下降時(shí)虹魚尊幼魚生長(zhǎng)下降，姚雪梅等29報(bào)道NO2-濃度大小與海參的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示換水頻率與水中溶氧量呈顯著負(fù)相關(guān)，與氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈正相關(guān)，與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。雖然換水頻率和水體質(zhì)量的研究報(bào)道較多，但目前為止鮮見換水頻率和消化酶的相關(guān)性研究，本實(shí)驗(yàn)顯示換水頻率與螞蛾的SGR和消化酶呈正相關(guān)（P<005）,推測(cè)換水頻率在對(duì)水質(zhì)造成影響的同時(shí)，抑制了螞蛾消化酶活性，影響了螞蛾的進(jìn)食和消化，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)。43不同養(yǎng)殖密度和換

15、水頻率對(duì)螞蛾抗逆酶活性的影響免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是一種幫助魚類應(yīng)對(duì)損傷的自適應(yīng)和修復(fù)機(jī)制30,過(guò)高的養(yǎng)殖密度會(huì)成為一種脅迫，影響魚類的免疫系統(tǒng)和抗氧化能力31?；钚匝跬ㄟ^(guò)影響細(xì)胞膜功能和酶活性使細(xì)胞加速老化和凋亡，活性氧增加時(shí)會(huì)誘導(dǎo)魚類抗氧化酶分泌，包括SOD,CAT3132,ALP在動(dòng)物體內(nèi)普遍存在，參與磷酸基團(tuán)的代謝，也是溶酶體的組成部分，在免疫反應(yīng)中具有重要作用33。本研究表明SOD,CAT和ALP隨著養(yǎng)殖密度的增大和換水頻率的減少呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，這與曹陽(yáng)等34關(guān)于俄羅斯魚尋幼魚、彭士明等35關(guān)于銀魚目魚、吳宗凡等36關(guān)于鯽的報(bào)道相似，可能是螞蛾在慢性脅迫過(guò)程中，螞蛾免疫機(jī)制失調(diào)導(dǎo)致SOD,CA

16、T；ALP活力降低，如王文博等37報(bào)道短期擁擠脅迫會(huì)使鯽魚血液溶菌酶水平升高，長(zhǎng)期脅迫則由現(xiàn)下降，至于短期脅迫對(duì)螞蛾免疫機(jī)制的影響有待今后進(jìn)一步研究。44不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾內(nèi)在品質(zhì)的影響本研究的結(jié)果表明，養(yǎng)殖密度和換水頻率對(duì)螞蛾內(nèi)在品質(zhì)的影響都不顯著，其中水分、總灰分、酸不溶性灰分含量都低于2015年版中國(guó)藥典，說(shuō)明雜質(zhì)含量低?？鼓富钚跃哂?015年版藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明所得水蛭品質(zhì)優(yōu)良。綜上可知實(shí)驗(yàn)所得螞蛾內(nèi)在品質(zhì)都能滿足2015年版中國(guó)藥典示準(zhǔn)。5小結(jié)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示密度為SD1時(shí)螞蛾生長(zhǎng)性能最高，但最終產(chǎn)量（413kg/畝）小于SD3組（1384kg/畝）,換水頻率H4組對(duì)螞蛾生

17、長(zhǎng)的影響與其他4組沒(méi)有顯著性差異,如果大規(guī)模養(yǎng)殖，從經(jīng)濟(jì)效益和成本控制來(lái)說(shuō)，選擇SD3密度、H4換水頻率是最佳的組合。參考文獻(xiàn)1楊潼.中國(guó)動(dòng)物志？環(huán)節(jié)動(dòng)物門蛭綱M.北京：科學(xué)生版社，1996:136.2中國(guó)藥典.一部S.2015:83.3史紅專，郭巧生，陸樹松，等.不同月齡螞蛾內(nèi)在品質(zhì)及最佳采收期研究J.中國(guó)中藥雜志，2009,34（23）:3060.4史紅專，劉飛，郭巧生.溫度對(duì)螞蛾生長(zhǎng)及攝食規(guī)律影響的初步研究J.中國(guó)中藥雜志，2006,31(23):1944.5史紅專，劉飛，郭巧生.溫度和體重對(duì)螞蛾人工繁殖影響的研究J.中國(guó)中藥雜志，2006,31(24):2030.6史紅專，郭巧生，朱再

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