抗生素效價(jià)測(cè)定

1、項(xiàng)目2青霉素效價(jià)測(cè)定一、知識(shí)連接（一）抗生素效價(jià)表示方法 效價(jià)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度。效價(jià)一般指的是生物活性的大小或者高低，生物活性的大小和高低是和效價(jià)成正比的。實(shí)際應(yīng)用中，合理使用抗生素的劑量十分重要?？股貞?yīng)用時(shí)劑量小，因此除重量外，常用特定的效價(jià)單位（unit）表示，效價(jià)單位也稱抗菌活性單位。最初，由于抗生素?zé)o法制得純品，用其生物活性的大小來(lái)表示其劑量。 一個(gè)青霉素的效價(jià)單位（U）：能在50mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的發(fā)育的最小青霉素劑量。 一個(gè)鏈霉素效價(jià)單位（U）：能在1mL肉湯培養(yǎng)基中完全抑制大腸桿菌（ATCC9637）發(fā)育的最小

2、劑量。 重量單位（g）：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作為抗生素的基準(zhǔn)單位（大多數(shù)使用）。（二）抗生素效價(jià)測(cè)定抗生素微生物檢定法可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法（管碟法和打孔法）。各國(guó)藥典通常采用后兩種方法測(cè)定抗生素的效價(jià)。管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散滲透作用，在含有高度敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管內(nèi)放入標(biāo)準(zhǔn)品和檢品的溶液，經(jīng)1618小時(shí)恒溫培養(yǎng)，當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)，會(huì)形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到

3、或高于MIC（最低抑制濃度）時(shí)，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無(wú)菌生長(zhǎng)的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。抑菌圈的大小代表藥劑抗菌力的高低。在一定的藥劑濃度范圍內(nèi)，藥劑的濃度越高則抑菌圈的直徑越大。目前最常用的是游標(biāo)卡尺和直尺直接測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系，即通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。管碟法的基本操作和設(shè)計(jì)適用于各種抗生素，試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定；樣品用量少，靈敏度高；適合于大批樣品的測(cè)定。然而凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果；試驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)，得出結(jié)果慢；操作手工化，需熟練人員才

4、能得到較正確的結(jié)果；受擴(kuò)散因素的影響，如培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴(kuò)散速度及效價(jià)強(qiáng)度。盡管如此，由于它有上述的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而被世界各國(guó)所公認(rèn)，成為國(guó)際通用的方法被列入各國(guó)藥典法規(guī)內(nèi)。二、制訂方案根據(jù)情境導(dǎo)入中的問(wèn)題，制訂抗生素生物效價(jià)的測(cè)定方案表，如表5-2-1所示。表5-2-1 抗生素生物效價(jià)的測(cè)定方案 抗生素效價(jià)的測(cè)定方案任務(wù)信息描述任務(wù)描述獨(dú)立完成發(fā)酵終點(diǎn)抗生素生物效價(jià)的測(cè)定設(shè)備/工具/耗材發(fā)酵罐及附屬裝置、三角瓶、雙碟（或內(nèi)徑9cm的培養(yǎng)皿）、鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0.lmm）、鋼管放置器、毛細(xì)滴管

5、、滅菌刻度吸管、容量瓶、稱量瓶、天平、直尺或游標(biāo)卡尺、超凈工作臺(tái)等操作步驟1.預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件，調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定2.試驗(yàn)準(zhǔn)備：雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、刻度吸管的清洗滅菌；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、無(wú)菌室的紫外消毒等3.金黃色葡萄球菌菌懸液的制備：將37培養(yǎng)1618h的斜面菌種,用0.85%的生理鹽水洗下,離心沉淀(3000rpm×5min),傾去上清液,沉淀菌體再用生理鹽水離心洗滌12次。再將其稀釋至一定濃度(約109個(gè)/ml，或用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)650nm測(cè)透光率為20%左右即可)4.雙碟的制備：

6、在超凈工作臺(tái)上，取已經(jīng)融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml注入雙碟底層，作為培養(yǎng)基的底層，待培養(yǎng)基凝固后換干燥的陶瓷蓋，放置2030min，備用。取出試驗(yàn)用菌懸液，按預(yù)實(shí)驗(yàn)的菌量（高濃度所致的抑菌圈直徑1822mm），用滅菌的吸管吸取菌懸液加入已經(jīng)融化并保溫在水浴中（一般細(xì)菌4850，芽孢可至60）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。取菌層培養(yǎng)基5ml，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺(tái)上待凝固，用陶瓷蓋覆蓋，放置2030min，備用5.供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：從冰箱取出的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達(dá)到室溫后，稱量前，供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30 min方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸

7、濕性較強(qiáng)的抗生素在稱量前12小時(shí)更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于20 mg，取樣后立即將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水。稱樣量的計(jì)算：W=V*C/P式中：W：需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg）V：溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積量（mL）C：標(biāo)準(zhǔn)品或供試品高劑量的濃度（U/mL，g/mL）P：標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計(jì)效價(jià)（U/mg，g/mg）標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液的稀釋?xiě)?yīng)采用容量瓶，每步稀釋?zhuān)恿坎簧儆?ml，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開(kāi)始放溶

8、液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶（預(yù)計(jì)不夠時(shí)，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預(yù)定結(jié)果。稀釋時(shí)，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之比為2：1或4：1，但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)6.放置鋼管：用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致平穩(wěn)地放入培養(yǎng)基上，鋼管放妥后，應(yīng)使雙碟靜置510min,使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再開(kāi)始滴加抗生素溶液7.滴加抗生素溶液：每批供試品取510個(gè)雙碟，滴加溶液用毛細(xì)滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗23次。在雙碟的4個(gè)鋼管中以對(duì)角線滴加標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液

9、的高、低二種濃度的溶液，滴加順序?yàn)镾H-TH-SL-TL，也可用SL-TL-TH-SH。（S代表標(biāo)準(zhǔn)品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過(guò)長(zhǎng)，因溶液的擴(kuò)撒時(shí)間不同影響測(cè)定結(jié)果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤(pán)內(nèi)，雙碟疊放不可超過(guò)3個(gè)，避免受熱不均，影響抑菌圈大小8.雙碟的培養(yǎng)：將制好的雙碟以水平位置平穩(wěn)移入3537恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至所需時(shí)間。培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過(guò)三層為宜9.抑菌圈的測(cè)量：用直尺或游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，以毫米為單位，誤差不超過(guò)0.1mm10.結(jié)果與計(jì)算：根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)量的抑菌圈大小，計(jì)算抗生素供試品的效

10、價(jià)單位。（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）V=（UH+UL）-（SH+SL）式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑；（2）求出： =D·log（IV/W）式中：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比； D：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1； I：高低劑量之比的對(duì)數(shù)，即log2或log4。（3）求出Pr ：Pr = Ar×式中：Pr：供試品實(shí)際單位數(shù)；Ar：供試品標(biāo)示量或估計(jì)單位 教師對(duì)學(xué)生進(jìn)行分組，每組選出一個(gè)小組長(zhǎng)，小組長(zhǎng)根據(jù)小組成員任務(wù)分工不同，確定不同任務(wù)的

11、責(zé)任人。小組成員任務(wù)的劃分可以參考下面的小組任務(wù)分配表，如表5-2-2所示。表5-2-2 小組任務(wù)分配表小組任務(wù)個(gè)人職責(zé)（任務(wù)）小組成員1預(yù)試驗(yàn)確定最佳的試驗(yàn)條件，調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，做好記錄2試驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)工具的消毒滅菌3金黃色葡萄球菌菌懸液的制備注意菌體濃度4雙碟的制備每只雙碟加好培養(yǎng)基并凝固好備用5供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液6放置鋼管使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，在開(kāi)始滴加抗生素溶液7滴加抗生素溶液保證滴加速度和加量的均勻一致8雙碟的培養(yǎng)注意培養(yǎng)溫度、時(shí)間9抑菌圈的測(cè)量確保測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確真實(shí)10結(jié)果與計(jì)算結(jié)果計(jì)算正確三、實(shí)施依據(jù)制訂方案實(shí)施，并填寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄表，如表5-2-3所示。表5-2-3 實(shí)訓(xùn)結(jié)果項(xiàng)目表小組任務(wù)完成情況完成人員檢查人員及情況說(shuō)明1 預(yù)試驗(yàn)2試驗(yàn)準(zhǔn)備、3金黃色葡萄球菌菌懸液的制備4雙碟的制備5供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備6菌層的制備7滴加抗生素溶液8雙碟的培養(yǎng)9抑菌圈的測(cè)量10結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定四、作業(yè)1通過(guò)實(shí)訓(xùn)后完善本次任務(wù)的實(shí)訓(xùn)方案2抗生素