聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)

1、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR) PCR具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍萬倍, 肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便幾小時便

2、可完成?？赏瓿伞CR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。項革命性創(chuàng)舉和里程碑。 Mullis 1993 年度諾貝爾化學(xué)獎。年度諾貝爾化學(xué)獎。 PCR技術(shù)是一種利用技術(shù)是一種利用DNA變性和復(fù)性原變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的理在體外進(jìn)行特定的DNA片段高效擴(kuò)增片段高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（的技術(shù)，可檢出微量靶序列（1個個copy）。在模板）。在模板DNA、引物和、引物和dNTP存存在的條件下依賴于在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合聚合酶的酶促合成反應(yīng)。成反應(yīng)。 僅需用極少量模板，在一對引物介導(dǎo)下，僅需用極少量模板，在一對引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時內(nèi)可擴(kuò)增

3、至在數(shù)小時內(nèi)可擴(kuò)增至100-200萬萬copy. PCR(Polymerase Chain Reaction)Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.PCR反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。 PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。的寡核苷酸引物。 模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至93左右一定時左右一定時間后，使模板間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解解

4、離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；備； 模板模板DNA與引物的退火：模板與引物的退火：模板DNA變性成單鏈后，溫變性成單鏈后，溫度降至度降至55左右，引物與模板左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)配對結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)配對結(jié)合； 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物結(jié)合物在引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互鏈互補(bǔ)鏈，而且這種新鏈又可成為

5、下次循環(huán)的模板。每完成一補(bǔ)鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需個循環(huán)需24min，23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。幾百萬倍。 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：10Buffer 10uldNTP mixture per 200umol/Lprimers per 10100pmoltemplete DNA 2ug DNA polymerase Mg2+ 1.5mmol/LdH2O 100ul PCR反應(yīng)五要素：參加反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+ 引物

6、：引物是引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度互補(bǔ)的程度 遺傳性疾病遺傳性疾病地中海貧血的基因診斷血友病苯丙酮尿癥肝炎性病腫瘤 個人識別、親子鑒定 1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA 指紋圖譜進(jìn)行個人識別和親子鑒定。 有時犯罪物證量很少，不足以用來進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、 基因定位分子標(biāo)記輔助育種了解不

7、同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化畜禽病診斷:豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒性腹瀉、免疫缺陷病毒等檢測性別鑒定：牛、綿羊Y染色體上特異 DNA片段構(gòu)建基因圖譜檢測基因整合與表達(dá)：轉(zhuǎn)基因魚殺蟲病原微生物的基因型鑒定植物病原微生物分類 形態(tài)學(xué)上相似性和潛在的血清學(xué)交互反應(yīng)，用常規(guī)方法難以區(qū)分，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）可準(zhǔn)確快速區(qū)分其他考古學(xué)植物分類學(xué)群體生態(tài)學(xué) 定量定量PCR是在是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量來的核酸定量技術(shù)。實時熒光定量PCR技技術(shù)是一種在術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)利用熒光信號積累實

8、時監(jiān)測整個利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板模板的定量而且具有靈敏度高、特異性和可靠的定量而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、性更強(qiáng)、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點 。 實時熒光定量實時熒光定量PCR常用的檢測模式：常用的檢測模式： （1）TaqMan探針探針 （2）SYBR Green 原理：利用原理：利用Taq 酶的酶的53外切核酸酶活性外切核酸酶

9、活性并在并在PCR過程中反應(yīng)體系加入一個熒光標(biāo)記過程中反應(yīng)體系加入一個熒光標(biāo)記探針。探針。 TaqMan探針探針5端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)，端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)，3端標(biāo)以熒光猝滅基團(tuán)。該探針在端標(biāo)以熒光猝滅基團(tuán)。該探針在PCR過程中過程中不能被延伸。當(dāng)探針保持完整時，不能被延伸。當(dāng)探針保持完整時，3端猝滅端猝滅基團(tuán)抑制基團(tuán)抑制5發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。 在在PCR的退火期，探針與引物所包含序列的退火期，探針與引物所包含序列內(nèi)的內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交。延伸期引模板發(fā)生特異性雜交。延伸期引物在物在Taq酶作用下沿酶作用下沿DNA模板延伸，當(dāng)?shù)竭_(dá)模板延伸，當(dāng)?shù)竭_(dá)探針處，探針處，Taq酶

10、發(fā)揮酶發(fā)揮53外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，繼而發(fā)生置換，切斷探針后，發(fā)射基團(tuán)遠(yuǎn)繼而發(fā)生置換，切斷探針后，發(fā)射基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，熒光信號得到釋放。離猝滅基團(tuán)，熒光信號得到釋放。 這時熒光探測系統(tǒng)便會檢測到光密度增這時熒光探測系統(tǒng)便會檢測到光密度增加。模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切加。模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴有一個熒光信號的釋放。斷，伴有一個熒光信號的釋放。 由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，且光密度同釋放的數(shù)量是一對一的關(guān)系，且光密度同釋放的熒光基團(tuán)的數(shù)目也成正比關(guān)系，因此該技熒光基團(tuán)的數(shù)目也成正比關(guān)系，因此該技術(shù)可對模板準(zhǔn)

11、確定量。由于擴(kuò)增產(chǎn)物短時術(shù)可對模板準(zhǔn)確定量。由于擴(kuò)增產(chǎn)物短時效率較高，故擴(kuò)增長度一般為效率較高，故擴(kuò)增長度一般為50150bp。 實時實時PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 (1) GC (1) GC堿基含量在堿基含量在40%-60%40%-60%。（2 2） 避免單核苷酸序列的連續(xù)重復(fù)，尤其是避免單核苷酸序列的連續(xù)重復(fù)，尤其是G G。（3 3）避免）避免55端為端為G G， 因為因為G G對熒光可能有抑制作用，對熒光可能有抑制作用，盡量使盡量使C C個數(shù)多于個數(shù)多于G G。（4 4）長度應(yīng)在）長度應(yīng)在15-2515-25個堿基左右，以保證結(jié)合的個堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。特異性。（5 5）探針的）探針的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出約值至少高出約1010另外，探針與引物不能形成二聚體，另外，探針與引物不能形成二聚體， 位置與上游引位置與上游引物盡量接近但不要重疊。物盡量接近但不要重疊。 SYBR Green I是一種只與雙鏈?zhǔn)且环N只與雙鏈DNA小溝結(jié)小溝結(jié)合的染料，當(dāng)它與合的染料，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時