腫瘤學(xué)-細(xì)胞周期

1、Cell cycle control &Cancer腫瘤是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞的疾病。2001 Nobel PrizeLeland H. Hartwell 1970s“Checkpoint”Yeast genetics100 CDC genesStart geneTim Hunt 1980sCyclinsSea UrchinsPaul M. Nurse1970sCDKsyeast Leland Hartwell哈特韋爾的貢獻(xiàn)，一是發(fā)現(xiàn)了一系列控制細(xì)胞周期的重要基因；二是他為了解這些基因如何合作以控制細(xì)胞分裂提供了一個(gè)邏輯框架。哈特韋爾的細(xì)胞周期生物學(xué)研究使他贏(yíng)得了多項(xiàng)美國(guó)和國(guó)際科學(xué)獎(jiǎng)。

2、 Paul Nurse20世紀(jì)70年代中期，納斯使用了不同于哈特韋爾的另一種酵母作為模型生物體，納斯在這種酵母中發(fā)現(xiàn)了一種在控制細(xì)胞分裂中具有關(guān)鍵功能的基因，這個(gè)基因能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的不同過(guò)程。1987年，納斯從人體細(xì)胞中分離出了相應(yīng)的基因，并命名為CDK1 （細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶）。納斯的研究表明，CDK的激活作用依賴(lài)于可逆的磷酸化作用。Tim Hunt亨特在20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)CYCLIN，在細(xì)胞周期中這些蛋白質(zhì)周期性的變化。這些CYCLIN附在CDK分子上，調(diào)節(jié)CDK活性。CYCLIN最初是在海膽中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)，亨特發(fā)現(xiàn)其他物種中也含有CYCLIN，并且對(duì)細(xì)胞發(fā)育也具有重要意義。

3、有關(guān)細(xì)胞周期的原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)（問(wèn)題，模型，現(xiàn)象，工具）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的所有方面都具有巨大的影響。細(xì)胞周期控制的缺陷會(huì)導(dǎo)致見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞中的某種染色體改變。這些發(fā)現(xiàn)能讓我們?cè)诮窈蠛荛L(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造治療癌癥的新方法。細(xì)胞周期概述細(xì)胞周期概述細(xì)胞周期的概念（concept of cell cycle）：指 從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開(kāi)始，到下一次細(xì)胞分裂 結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程。分為：物質(zhì)積累期（間期或靜止期）和細(xì)胞分裂期。 Interphase: G1: gap (G0: quiescent state during which cell cycle does not proceed) S: replication o

4、f DNA and assembly of chromosomal proteins on daughter DNA molecules G2: gap M phase: mitosis (nuclear division) cytokinesis (cytoplasmic division)細(xì)胞增殖是生命的基本特征 初生嬰兒1012個(gè)細(xì)胞，成人1014個(gè)，約200種類(lèi)型。 成人體內(nèi)每秒鐘有數(shù)百萬(wàn)新細(xì)胞產(chǎn)生，以補(bǔ)償衰老和死亡的細(xì)胞。 一個(gè)大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過(guò)地球的重量。 根據(jù)增殖狀況，可將高等動(dòng)物的細(xì)胞分為三類(lèi)： 連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層、部分骨髓細(xì)胞

5、。 休眠細(xì)胞，暫不分裂，但適當(dāng)刺激下可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，稱(chēng)G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞，干細(xì)胞等。 不分裂細(xì)胞，不再分裂，又稱(chēng)終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等。 細(xì)胞周期長(zhǎng)短細(xì)胞周期長(zhǎng)短Q 同種細(xì)胞間周期時(shí)間長(zhǎng)短相似或相同；不同種類(lèi)細(xì)胞間，周期長(zhǎng)短差別很大。Q S+G2+M 的時(shí)間變化較小，細(xì)胞周期時(shí)間長(zhǎng)短差別在G1期，M期最短,約0.54.5小時(shí)。Q 部分細(xì)胞的細(xì)胞周期沒(méi)有G1、G2期。細(xì)胞周期阻滯的幾種結(jié)局細(xì)胞周期阻滯的幾種結(jié)局Mechanisms involved in cell cycle control: Checkpoint regulation Differential

6、 cyclin gene expression Protein degradation (ubiquitin pathway) CDK activities regulated by phosphorylation binding of cyclins1. MPF(M phase promoting factor) , Cyclin ,CDK 1.1 MPF found1.2 MPF componentsCyclin (B)CDK (cyclin dependent kinase ) 1970s Rao等發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱(chēng)為早熟凝集染色體（PCC）。 G

7、1期PCC為單線(xiàn)狀，因DNA未復(fù)制。 S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制。 G2期PCC為雙線(xiàn)染色體，說(shuō)明DNA復(fù)制已完成。 不同類(lèi)的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說(shuō)明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子( MPF)。1.1 MPF foundG1 phase fuse with M phases phase fuse with M phaseG2 phase fuse with M phase Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分別以芽殖酵母和裂殖酵母為材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因( cdc)。如： 裂殖酵母cdc2

8、、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無(wú)法分裂； wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂； cdc2和cdc28都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行，weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)cdc2的活性。budding yeast Fission yeast Cdc 25 & Wee1 mutant T. Hunt 1980s發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過(guò)程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為cyclin A和B，其mRNA能誘導(dǎo)蛙卵成熟。CDKsCyclinsCKIsCAKWee1/CDC25Degradation 1.2 1.2 細(xì)胞周期素細(xì)胞周期素(

9、cyclin )(cyclin )特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱(chēng)為周期蛋白框，介導(dǎo)與CDK結(jié)合。作用：激活和引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，分為4類(lèi)：G1型、G1/S型、S型、M型。A2Destroy box Cyclin boxB1PEST, G1 cyclin renewal C Different Cyclin expressed in different cell cycle phaseBind with Different CDK,regulate CDK kinase activity G1期，在生長(zhǎng)因子的刺激下，cyclin D表達(dá)

10、，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A、CDK1和DHFR的基因。 G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，激活DNA復(fù)制。 G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1引起染色體凝縮、核膜解體等。Experimental Demonstration that Cyclin D is Required for Passage Through the Restriction Point in the Mammalian Cell Overexpression （Gene Amplifica

11、tion） 乳腺癌、胃癌、食道癌 Chromosome reverse 甲狀旁腺腺癌 Chromosome rearrangement B淋巴細(xì)胞白血病 Gene mutation (T286) Cyclin D1.3 CDK： Cyclin depend kinase cdc2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)。 cdc2又稱(chēng)CDK1，可將特定蛋白磷酸化，如： 將核纖肽磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失； 將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。 在動(dòng)物中已知7種CDK。均含PSTAIRE保守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。1.4 CDK inhibitory prot

12、eins (CKI) 對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為： Ink4: 抑制cdk4cyclin D1, cdk6cyclin D1。 Kip：抑制大多數(shù)CDK。其中P21cip1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。CDKs Over-expression of CDK4 and CDK6CKI Lower expression or mutation (p16, Kip/cip) P21cipl Cyclins / CDKs PCNA Cell Cycle velocity inhibition of DNA replication2 CHECKPOINT 組成：感受器

13、、信號(hào)傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器。 主要檢驗(yàn)點(diǎn)： G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？在酵母中稱(chēng)start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱(chēng)R點(diǎn)(restriction point)。 S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？ G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？ 中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)：紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)。Four checkpoints2.1 The G1 /S CheckpointEnvironmentalGrowth factors- (from other cells), e g PDGFDensity dependent inhibitionInternalDNA dama

14、ge G1 cyclin D(D1,D2,D3),E,A G1 CDK,CDK2,4,6 cyclin D+CDK4,6 cyclin E,A+CDK2 cyclin D(D1,D2,D3) is key factor for G1/S cyclin E is key factor for startup s-phase G1 phase cyclin degradation by Ubiquitin through PEST Rb基因的異常主要表現(xiàn)為等位基因缺失和基因突變。除了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和骨肉瘤外，在許多種腫瘤中也檢測(cè)到Rb基因的突變，包括肺癌（40%）, 膀胱癌（30%），前列腺癌（2

15、0%）以及乳腺癌，宮頸癌和某些類(lèi)型的白血病。 2.2 S/G2/M DNA replication checkpoint If DNA did not complete replication, s-phase could not change into G2 This G2checkpoint senses unreplicated DNA, which generates a signal that leads to cell cycle arrest. CDC25 activity is low but Weel activity is high MPF inactivate G2 ch

16、eckpoint : G2 checkpoint prevents the initiation of mitosis until DNA replication is completed Only the inhibition of G2 progression relieved, allowing the cell to initiate mitosis and distribute the completely replicated chromosomes to daughter cells.2.3 M-phase regulation MPF activate M phase chec

17、kpointMPF & the G2 CheckpointMPF- pushes cell past G2 checkpointCdc2 Activates Cdc25 and Inhibits Wee1: Positive Feedback LoopA little Cdc2 goes a long wayThr 161Tyr14,15This means Cdc25 Must also be regulatedTyr 15Inhibitory:Added byWee1Removed by Cdc25Thr 160Activating:CDK adds afterCyclin bin

18、dingMPF induces multiple nuclear and cytoplasmic changes at the onset of M phase, both by activating other protein kinases and by phosphorylating proteins such as condensins and the nuclear lamins.So MPF gets us into mitosis, how do we get out? One can imagine many possibilities: Activate Wee kinase

19、 and turn off MPF Inactivate Cdc25 phosphatase Activate a phosphatase that undoes the work of CDK Synthesize an inhibitor of MPF, a CKI It turns out all these possibilities are wrong. The solution lies in the behavior of CYCLINCyclin Destruction Drives Mitotic ExitAPC and M-regulation APC: Anaphase

20、Promoting Complex M-phase to anaphase depend on rigid regulation APC1-8 APC regulate Cyclin B and other protein Ubiquitination Spindle assembly checkpoint control APC activityAnaphase Promoting Complex & the M CheckpointMad2Cdc20 2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予以色列科學(xué)家阿龍切哈諾沃、阿夫拉姆赫什科和美國(guó)科學(xué)家歐文羅斯，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解。其實(shí)他

21、們的成果就是發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)“死亡”的重要機(jī)理 。死亡之吻Protein degradation Need not energy, only need enzymeNeed energy, certain time ,certain position certain direction protein degradation 一種被稱(chēng)為泛素的多肽在需要能量的蛋白質(zhì)降解過(guò)程中扮演著重要角色。這種多肽由76個(gè)氨基酸組成，它最初是從小牛的胰臟中分離出來(lái)的。它就像標(biāo)簽一樣，被貼上標(biāo)簽的蛋白質(zhì)就會(huì)被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的“垃圾處理廠(chǎng)”，在那里被降解。 Ubiquitin:Proteins are usually

22、 tagged for selective destruction in proteolytic complexes called proteasomes by covalent attachment of ubiquitin, a small, compact, highly conserved protein. ubiquitin PDB 1TBE Fortuitous Discovery of Cyclin B UbiquitinationIP of 35S-Labeled Cyclin B:NormalExposureOverExposureCyclin BCyclin B-Ub La

23、dder 原來(lái)細(xì)胞中存在著E1、E2和E3三種酶，它們各有分工。E1負(fù)責(zé)激活泛素分子。泛素分子被激活后就被運(yùn)送到E2上，E2負(fù)責(zé)把泛素分子綁在需要降解的蛋白質(zhì)上。但E2并不認(rèn)識(shí)指定的蛋白質(zhì)，這就需要E3幫助。E3具有辨認(rèn)指定蛋白質(zhì)的功能。當(dāng)E2攜帶著泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白質(zhì)時(shí)，E2就把泛素分子綁在指定蛋白質(zhì)上。這一過(guò)程不斷重復(fù)，指定蛋白質(zhì)上就被綁了一批泛素分子。 High Energy Thioester Bond,can be transferred from E1 to E2, E3, or substrateUbiquitin is Transferred via Thioester BondsUbiquitination of Pro