神經(jīng)通路示蹤技術(shù)尼式染色

1、神經(jīng)組織的固定l（一）固定(fixation)l為了更好的保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，必須對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行固定。固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性。更重要的是最大限度的保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖乐箍乖瓘浬ⅰ（二）固定劑(fixative)l醛類(lèi)固定劑l雙功能交聯(lián)劑，使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點(diǎn)是對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。常用的醛類(lèi)固定劑有10%鈣-福爾馬林液，10%中性緩沖福爾馬林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸緩沖液，戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，Bouin

2、s液等l其它固定劑：l酒精（alcohol） ：l使蛋白質(zhì)脫水而致不可逆性的凝固變性。對(duì)組織有固定、硬化兼脫水的作用l醋酸（acetic acid）：l對(duì)核蛋白有明顯的沉淀作用，不能單獨(dú)使用，常與酒精聯(lián)合使用l苦味酸（picric acid）：l沉淀蛋白并溶解粘蛋白，使組織柔軟。l鉻酸（chromic acid） ：l強(qiáng)氧化劑，能沉淀所有蛋白。重鉻酸鉀是氧化劑，對(duì)蛋白和脂類(lèi)有固定作用，尤其是脂類(lèi)。對(duì)核蛋白有溶解作用。l氯化汞（mercury chloride） ：l沉淀各種蛋白。但必須脫汞l鋨酸（osmium tetroxide） ：l強(qiáng)氧化劑。蛋白的固定作用較好，不發(fā)生沉淀，組織幾乎不收縮。

3、但滲透力弱。l丙酮（acetone）l（三）固定方法l1.浸入法l將組織浸泡在固定液內(nèi)。l2.灌注法l此法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。常用的切片方法常用的切片方法l常用的有石蠟切片法、冰凍切片法、恒冷箱切片法、振動(dòng)切片法.l 石蠟切片石蠟切片(paraffin sectioning) l本法是將已固定的組織塊常規(guī)脫水處理后，放入熔化的石蠟中浸蠟，將組織包埋在石蠟中制成蠟塊，再用石蠟切片機(jī)切片(一般片厚5-10m)，然后將切片貼于載玻片上。本法適用于一般染色方法。l 冰凍切片冰凍切片(freezing sectioning) l本法是將已固定或未經(jīng)固定的組織塊經(jīng)保護(hù)處理后，用液態(tài)二氧化碳或半導(dǎo)體致冷裝置

4、迅速致冷凍結(jié)變硬，然后在冰凍切片機(jī)上切片。本法可不必經(jīng)脫水包埋處理，甚至可不經(jīng)固定處理，故對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的脂類(lèi)成分及酶的活性影響較少，而且方法簡(jiǎn)單，制片速度快，缺點(diǎn)是難以切出10m以下的薄切片。l 恒冷箱切片法恒冷箱切片法(cryostat sectioning)l本法是在冰凍切片技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的切片技術(shù)，其特點(diǎn)是將己固定或未經(jīng)固定的組織塊冷凍處理后，在低溫恒冷箱中進(jìn)行切片，由于切片機(jī)裝在恒冷箱內(nèi)，整個(gè)切片過(guò)程在低溫環(huán)境下進(jìn)行，故能更好地保存組織內(nèi)各種活性物質(zhì)，并可切出較薄切片，此法特別適用于細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)研究。l 振動(dòng)切片法振動(dòng)切片法(vibration sectioning) l

5、本法是用特殊的振動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，振動(dòng)切片機(jī)的特點(diǎn)是其刀片進(jìn)行橫向切割運(yùn)動(dòng)， 故可切割新鮮未經(jīng)冰凍，末經(jīng)固定的組織，切片厚度可達(dá)10m。常用于免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡及電生理學(xué)腦厚片技術(shù)。l5冷凍干燥切片(freezing drying sectioning)：將新鮮組織放入經(jīng)液氮預(yù)冷（-160）的異戊烷中驟冷后，入真空內(nèi)干燥，已干燥的組織塊進(jìn)行真空包埋后切片。其特點(diǎn)是細(xì)胞在驟冷的同時(shí)立即停止一切生物化學(xué)變化，可研究驟冷時(shí)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)變化狀況。l6超薄切片(ultrathin sectioning)：通過(guò)固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟。固定分預(yù)固定和后固定。包埋劑多為環(huán)氧樹(shù)脂。切片用醋酸鈾及

6、枸櫞酸鉛進(jìn)行電子染色，在電子顯微鏡下觀(guān)察。神經(jīng)組織的一般染色方法神經(jīng)組織的一般染色方法l 尼氏法（尼氏法（Nissl staining）l尼氏體（Nissl body）也被稱(chēng)作“嗜色小體”或“虎斑小體”，其主要成份是核糖核酸（RNA）和蛋白質(zhì)組成。在各種類(lèi)型神經(jīng)元中，尼氏體的形狀、大小與分布均不相同。由于含有RNA，故易為某些堿性苯胺染料所染色（如甲苯胺藍(lán)，焦油紫類(lèi)，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及培花青等）。本法除可顯示正常神經(jīng)元形態(tài)，特別是其內(nèi)含的尼氏體情況外，還可顯示當(dāng)神經(jīng)元受到損害，引致的尼氏體消失，即染色質(zhì)溶解（chromatolysis），可供病理或臨床診斷和實(shí)驗(yàn)研究參考。lNiss

7、l染色程序：染色程序：l切片入0.1%尼氏液中染色5至10分鐘l蒸餾水洗去染液l70%酒精分色 1分鐘l80%酒精 1-2分鐘l90%酒精 1-2分鐘l100%酒精 2分鐘l100%酒精 2分鐘l二甲苯 2分鐘l二甲苯 2分鐘l中性樹(shù)膠封片l 蘇木精伊紅染色法蘇木精伊紅染色法( hematoxyiln eosin，HE ) l本法是組織學(xué)最常用的染色方法，它可顯示組織內(nèi)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，HE染色在神經(jīng)生物學(xué)研究中亦常采用，蘇木精是陽(yáng)離子染料，可將細(xì)胞核內(nèi)的嗜堿性物染成藍(lán)紫色，伊紅是陰離子染料，可將細(xì)胞質(zhì)和膠原纖維等染成粉紅色。l步驟:l二甲苯脫蠟去石蠟5分鐘;l二甲苯脫蠟去石蠟5分鐘;l二甲苯脫蠟

8、去石蠟5分鐘l100%的酒精去二甲苯5分鐘;l100%的酒精去二甲苯5分鐘l90%的酒精水化2分鐘;l80%的酒精水化1分鐘;l70%的酒精水化1分鐘l用蒸餾水洗; (以上步驟統(tǒng)稱(chēng)為脫蠟至水)l05%的蘇木精染色，室溫510分鐘；l水洗；l1%的鹽酸酒精分色3060秒；l水洗；l流水促藍(lán)；l1%的伊紅室溫染色2-5分鐘；l水洗；l70%的酒精分色3060秒；l80%的酒精脫水1分鐘；l90%的酒精脫水1分鐘；l100%的酒精脫水2鐘；l100%的酒精脫水2鐘；l二甲苯透明5分鐘；l二甲苯透明5分鐘；l中性樹(shù)膠封片。l結(jié)果：l1 細(xì)胞質(zhì)染成紅色l2 細(xì)胞核染成藍(lán)色l Weigert 氏髓鞘染色法

9、氏髓鞘染色法l有髓神經(jīng)纖維的髓鞘主要組成成分是磷脂，如以鉻鹽或鐵釩媒染使之與蘇木精結(jié)合，再藉分色處理，就能著色清晰，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示其分布狀態(tài)。髓鞘染色除可用于顯示神經(jīng)纖維干、束外，更多用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維束的追蹤。因?yàn)?，尚未髓鞘完全的纖維束（如嬰兒皮質(zhì)脊髓側(cè)束），或髓化受到損害而產(chǎn)生潰變的纖維束，在與正常已髓化的纖維對(duì)比之下可以區(qū)別。用勞克堅(jiān)牢藍(lán)（Luxol fast blue）類(lèi)染料染色也可顯示髓鞘，操作時(shí)也較容易。但染色作用較慢，染色也較淺。l 鍍銀法（鍍銀法（silver impregnation ）l鍍銀法又名浸銀法，是用硝酸銀鍍?nèi)旧窠?jīng)元，一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，鍍銀法為神經(jīng)形態(tài)學(xué)的發(fā)展

10、作出了重大貢獻(xiàn)，此法于上一世紀(jì)七十年代由意大利解剖學(xué)家Golgi創(chuàng)建，故稱(chēng)為Golgi氏法。到目前Golgi原法己有許多改良法，經(jīng)Cox改良的Golgi-Cox法，可以較好地顯示神經(jīng)元胞體、突起各部形態(tài)，是多年來(lái)較受歡迎的方法之一。神經(jīng)細(xì)胞化學(xué)性質(zhì)顯示方法神經(jīng)細(xì)胞化學(xué)性質(zhì)顯示方法l1組織化學(xué)方法組織化學(xué)方法l（1）顯示脫氧核糖核酸的孚爾根反應(yīng)法）顯示脫氧核糖核酸的孚爾根反應(yīng)法(Feugen reaction) 利用schiff試劑顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的經(jīng)典方法，其基本原理是組織經(jīng)鹽酸水解后打開(kāi)DNA分子中脫氧核糖和嘌呤堿之間的連接鍵，使其釋放出脫氧核糖核酸中的醛基，醛基與schiff試劑中的亞硫酸

11、品紅結(jié)合，而在核內(nèi)呈紅色反應(yīng)沉淀物。 l（2）顯示多糖的過(guò)碘酸）顯示多糖的過(guò)碘酸-schiff反應(yīng)法反應(yīng)法(Periodic acid Schiff reaction)簡(jiǎn)稱(chēng)PAS法，是顯示組織或細(xì)胞內(nèi)多糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通過(guò)碘酸的氧化作用，打開(kāi)糖分子內(nèi)1，2-乙二醇中的碳-碳鍵或糖中的的氨基，烴氨基衍生物，形成2-醛基，這些醛基與schiff試劑中的亞硫酸品紅反應(yīng)，形成紫紅色化合物。l（3）顯示脂類(lèi)的脂溶性染料法）顯示脂類(lèi)的脂溶性染料法 顯示脂類(lèi)通常用易溶于脂類(lèi)的染料，使之溶于組織或細(xì)胞內(nèi)的脂滴內(nèi)而顯色. 常用的這類(lèi)染料有: 蘇丹III (Sudan III)，蘇丹IV (Su

12、dan IV)，蘇丹黑B (Sudan black B)，油紅O (oil red O)等。l（4）顯示酶的酶細(xì)胞化學(xué)方法）顯示酶的酶細(xì)胞化學(xué)方法 酶顯示法是顯示酶的活性而不是酶的本身，細(xì)胞內(nèi)含有多種酶，每一種酶都可催化一定的化學(xué)反應(yīng)。酶顯示法的基本原理是具有酶活性的組織切片或涂片，在含有酶作用底物和捕獲反應(yīng)產(chǎn)物的捕捉劑的孵育液中，經(jīng)一定pH及一定溫度的孵育，底物被酶催化分解后形成的初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物被捕捉劑捕捉，并在原位沉淀，形成有色的最終產(chǎn)物。2免疫細(xì)胞化學(xué)方法免疫細(xì)胞化學(xué)方法l免疫細(xì)胞化學(xué)方法免疫細(xì)胞化學(xué)方法(Immunocytochemistry)是應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過(guò)抗原與特異性標(biāo)記抗體結(jié)

13、合，從而顯示細(xì)胞內(nèi)的抗原或抗體成分。這種方法可以定位或示蹤細(xì)胞內(nèi)各種成分，包括各種蛋白質(zhì)、多肽、部分類(lèi)脂質(zhì)和多糖以及細(xì)胞膜表面的膜抗原和受體等等。由于在組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體結(jié)合是不可見(jiàn)的，故需要在抗體上結(jié)合一定的可見(jiàn)的標(biāo)記物質(zhì)。l免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色 l SP法l 1）脫蠟、水化；（石蠟切片，冰凍切片免此步驟）l 2）PBS洗23次各5分鐘；l 3）3%H2O2（甲醇）滴加在切片上，室溫靜置20分鐘；l 4）PBS洗23次各5分鐘； l 5）抗原修復(fù)；（石蠟切片，冰凍切片免免此步驟）l 6）PBS洗23次各5分鐘；l 7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。l

14、8）滴加抗50l，室溫靜置1小時(shí)或者4過(guò)夜或者371小時(shí)。l 9）4過(guò)夜后需在37復(fù)溫45分鐘。l 10）PBS洗3次各5分鐘；l 11）滴加抗4050l，室溫靜置，或371小時(shí)；l 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。l 13）PBS洗3次各5分鐘；l 14）抗30分鐘；l 15）PBS洗3次各5分鐘；l 16）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；l 17）PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘；l 18）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；l 19）自來(lái)水沖洗1015分鐘；l 20）脫水、透明、封片、鏡檢。 3熒光免疫細(xì)胞化學(xué)熒光免疫細(xì)胞化學(xué)l熒光免疫細(xì)胞化學(xué)熒光免疫細(xì)胞化學(xué)( i

15、mmunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用熒光染料作為標(biāo)記物，標(biāo)記上己知的抗原或抗體，再用標(biāo)記上熒光素的抗體或抗原作探針，檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體。當(dāng)熒光素結(jié)合的抗體與被檢抗原或抗體結(jié)合，便可用熒光顯微鏡檢測(cè)到這此抗原或抗體的定位。4免疫細(xì)胞化學(xué)的雙重標(biāo)記（免疫細(xì)胞化學(xué)的雙重標(biāo)記（Double staining）l這一技術(shù)目的是在同一神經(jīng)細(xì)胞胞體或它的突起內(nèi)同時(shí)顯示共存的兩種或兩種以上物質(zhì)以研究這些物質(zhì)在同一神經(jīng)元或它的突起內(nèi)的共存現(xiàn)像，或含有不同化學(xué)物質(zhì)的兩種結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系。 5熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法l熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記法的原理亦如

16、免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記方法，只是第二抗體標(biāo)記物是不同的熒光素，如呈黃綠色熒光的FITC及呈紅色熒光的TRITC，可將兩種不同的特異性一抗混合與切片進(jìn)行孵育，但兩種一抗必須來(lái)自不同種動(dòng)物。然后再與標(biāo)記不同熒光素的兩種針對(duì)第一抗體的二抗混合孵育，使各自與一抗結(jié)合。最后在熒光顯微鏡下用不同的激發(fā)濾片觀(guān)察到兩種不同反應(yīng)產(chǎn)物的不同的熒光。6免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)l免疫電鏡技術(shù)（immunoelectron microscope technique）是免疫細(xì)胞化學(xué)與電子顯微技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，用以在超微結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究。 l此技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題是標(biāo)記物質(zhì)必須是能滿(mǎn)足電鏡顯微技術(shù)要求的電子致密物質(zhì)，目前常

17、用的為HRP、細(xì)胞色素C，近年來(lái)隨著膠體金、納米金技術(shù)的發(fā)展，更廣泛的被采用作為免疫電鏡的標(biāo)記物。 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顯示方法神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顯示方法l過(guò)去長(zhǎng)期以來(lái)用以顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法是基于Cajal鍍銀方法，其原理與神經(jīng)細(xì)胞鍍銀方法相同，但效果不理想。后來(lái)鍍銀方法幾經(jīng)改進(jìn)，效果有所改善。l由于免疫細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用及進(jìn)展，目前已利用針對(duì)特定神經(jīng)膠質(zhì)含有的特異性化學(xué)成分的抗體準(zhǔn)確的顯示特定神經(jīng)膠質(zhì)的數(shù)目及形態(tài)細(xì)節(jié)。如由于星形膠質(zhì)細(xì)胞特異地含有膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP），小突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)半乳糖腦苷脂，小膠質(zhì)細(xì)胞含有植物凝集素BS-1

18、，可以應(yīng)用針對(duì)各該物質(zhì)的免疫細(xì)胞化學(xué)方法，顯示各類(lèi)膠質(zhì)細(xì)胞并得到理想的結(jié)果。立體定位技術(shù)l在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)需要在較少損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的情況下，把細(xì)微的電極或?qū)Ч?，有目的的插入腦的某些深部結(jié)構(gòu)，這種定向安置的技術(shù)為立體定位術(shù)(Stereotaxic technique of brain)。它是在腦內(nèi)進(jìn)行電刺激，記錄細(xì)胞放電，進(jìn)行微量注射及推挽灌流等項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)必不可少的步驟.l某些顱外骨性標(biāo)記與顱內(nèi)結(jié)構(gòu)具有相對(duì)固定的位置關(guān)系， 因此可利用這些骨性標(biāo)記并按大白鼠，兔腦圖譜所提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行操作.根據(jù)鼠腦圖譜(KNIG F.R. and KLIPPEL A.， 1963年)所定標(biāo)準(zhǔn)，取前囟點(diǎn)與人字縫尖(

19、后囟)為連線(xiàn)，前囟高于后囟1mm為鼠腦標(biāo)準(zhǔn)頭位，但不同的鼠腦圖譜頭位標(biāo)準(zhǔn)有所不同。 l兔腦結(jié)構(gòu)定位根據(jù)兔腦圖譜(Sawyer， 1954)規(guī)定(圖3-2-1-1)標(biāo)準(zhǔn)頭位是前囟高于人字縫尖1.5mm，三個(gè)座標(biāo)的定位依據(jù)是：以前囟中心及人字縫尖為標(biāo)記點(diǎn)，在人字縫尖以上1.5mm的一點(diǎn)(假想點(diǎn))與前囟中心連一線(xiàn)作為假想水平線(xiàn)，通過(guò)此線(xiàn)作一與定向器立框平行的平面即為標(biāo)定水平面。 由此平面向下12mm的與其平行的平面即為水平座標(biāo)面(HO).HO平面向下為H-，向上為H+， 通過(guò)前囟中心與人字縫尖，并與水平座標(biāo)平面垂直的平面即為矢狀座標(biāo)面(LPO)。 向左則標(biāo)為L(zhǎng)， 向右則標(biāo)為R，通過(guò)前囟中心與水平及矢

20、狀座標(biāo)面均垂直的平面即為冠狀座標(biāo)面(APO)，向前則為A，向后則為P.三個(gè)座標(biāo)面均以mm記數(shù)，如A2R2H-1.5，P9L0.5H1等。神經(jīng)通路示蹤技術(shù)神經(jīng)通路示蹤技術(shù)l而神經(jīng)通路的追蹤是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的手段之一。目前常用的研究方法主要有：利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的追蹤法，如辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）、熒光染料（fluorscein）、放射性核素、葡萄聚糖（dextran）追蹤法、植物凝集素（lectin）及霍亂毒素（cholera toxin,CT）等等。利用神經(jīng)元胞體受損或軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突的變性，或軸突切斷后胞體的反應(yīng)特性的變性追蹤法，包括

21、傳統(tǒng)的鍍銀法如Nauta法與目前常用的變性法與免疫組織化學(xué)方法或原位分子雜交技術(shù)結(jié)合，觀(guān)察當(dāng)切斷束路(或神經(jīng))后起始神經(jīng)元胞體內(nèi)化學(xué)成分的變化利用某些熒光染料如羰花青（carbocyanine）熒光染料DiI、DiA、DiO、DiS在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜擴(kuò)散的神經(jīng)元質(zhì)膜熒光追蹤法Golgi法及活體內(nèi)染料注射法l 常用的HRP追蹤法、熒光素追蹤法、放射性核素追蹤法及Nauta鍍銀法 HRP追蹤法追蹤法 lHRP是從辣根中提取出來(lái)的一組同工酶的混合物。Kristenson 等（1971）和LaVail等（1972）先后將HRP用于追蹤神經(jīng)纖維聯(lián)系，創(chuàng)造了HRP追蹤技術(shù)。HRP在注射部位被神經(jīng)末梢或神經(jīng)元胞

22、體通過(guò)非特異性整體胞飲（bulk endocytosis）的方法攝入，逆向運(yùn)至胞體或順向運(yùn)至末梢。HRP注射于周?chē)窠?jīng)感覺(jué)末梢部位逆向標(biāo)記背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后，還可進(jìn)一步沿背根神經(jīng)節(jié)中樞突順向標(biāo)記其中樞終止部位，稱(chēng)跨節(jié)標(biāo)記（transganglionic labeling）HRP和麥芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）共偶聯(lián)后（WGAHRP）或與霍亂毒素結(jié)合后（CTHRP）可大大提高HRP作為追蹤劑的靈敏度HRP法的基本操作步驟是麻醉動(dòng)物，HRP注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周?chē)鞴?、神?jīng)的一定部位，動(dòng)物存活一定時(shí)間后灌注固定動(dòng)物，取材制作冰凍切片，然后用過(guò)氧化氫及顯色劑來(lái)顯示HR

23、P標(biāo)記。l（一） HRP的配制l中樞神經(jīng)系內(nèi)注射的HRP，一般用蒸餾水或生理鹽水配成30%50%的溶液。微電泳時(shí)可用20%30%的HRP，也可用更低濃度的HRP，l（二） HRP的注射l取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，將其固定于腦定位儀上，切開(kāi)動(dòng)物頭部皮膚，暴露顱骨，選擇適當(dāng)?shù)淖鴺?biāo)，用開(kāi)顱具在顱骨上開(kāi)一小孔，將微玻管或微量注射器直接向腦內(nèi)注射，HRP溶液用微量注射器注入。為了減少推進(jìn)HRP溶液時(shí)液壓對(duì)組織的損傷作用，注射速度很慢。一般約為每10分鐘0.1ul。用千分尺或電動(dòng)自動(dòng)推進(jìn)器來(lái)推進(jìn)。為了減少HRP沿針道擴(kuò)散，在注射后應(yīng)留針1530min再徐徐拔針，將動(dòng)物皮膚縫合，存活。l（三）動(dòng)物的存活l 注射追蹤

24、劑后經(jīng)過(guò)多長(zhǎng)時(shí)間處死動(dòng)物，取決于被運(yùn)送的速度、注射部位與標(biāo)記部位間的距離、示蹤物在標(biāo)記部位逐漸堆積起來(lái)所需的時(shí)間以及示蹤物在標(biāo)記部位被分解的速度等因素。HRP被攝入的過(guò)程很快。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)l5min后即可被攝入神經(jīng)元中，經(jīng)24后HRP已從細(xì)胞外間隙消失，全部進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、血管周細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等)。HRP可在軸突內(nèi)被快速運(yùn)送，通常認(rèn)為順向傳遞速度較快，每天可達(dá)300400nm，逆向傳遞速度約為順向速度的一半。HRP在標(biāo)記部位有一個(gè)聚集的過(guò)程，同時(shí)HRP運(yùn)至胞體后被送入溶酶體中水解。因此，需要在聚集及降解兩個(gè)相反的過(guò)程中求一最佳標(biāo)記效果時(shí)間，約為HRP開(kāi)始到達(dá)標(biāo)記部位后

25、一天左右。 l（三）動(dòng)物的固定l動(dòng)物存活一段時(shí)期后，再對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，用灌注固定法對(duì)其進(jìn)行固定。HRP對(duì)固定劑相當(dāng)敏感，選擇固定液是HRP示蹤方法成功與否的一個(gè)關(guān)鍵。當(dāng)初提出HRP方法時(shí)用10%甲醛作固定劑，常用1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的混合溶液。戊二醛1963年由Sabotini等介紹用于組織固定后被普遍認(rèn)為是最好的固定劑之一，多用于保存電鏡標(biāo)本。它能較完好地固定組織的超微結(jié)構(gòu)，雖對(duì)酶有一定程度的破壞作用，但仍有相當(dāng)程度的酶的活性得以保存下來(lái)。其主要缺點(diǎn)是穿透能力太小，如組織塊稍大則其中央部分固定不好，故多在固定液中加入穿透力強(qiáng)的多聚甲醛及采用灌注加浸泡這兩項(xiàng)措施來(lái)彌補(bǔ)之。l（四） 取

26、材l灌注后，立取出腦或脊髓，迅速投入上述固定液中后固定6h左右即可作振動(dòng)切片。若行冰凍切片，將依次移入含10%、20%、30%蔗糖的0.01M磷酸緩沖液（pH7.27.4）中（4OC），直到組織完全下沉后，方可切片。l（五） 切片l 冰凍切片或振動(dòng)切片，片厚2050m。切片收集于含5%蔗糖的0.1mol/L磷酸緩沖液中，pH7.27.4。盡快作呈色反應(yīng)，否則酶的活行隨時(shí)間推移而減弱。l（六） 呈色反應(yīng)l顯示HRP的方法有多種。最初用二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine,DAB）。以后在光學(xué)顯微鏡水平研究 上 ， 多 用 四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 ( 3 , 3 , 5 , 5

27、-tetramethylbenzidine,TMB),因其比DAB更為靈敏，可顯示更多的順行纖維，且無(wú)致癌作用。lDAB的氧化產(chǎn)物呈棕色顆粒，在暗視野下反射出金黃色光；TMB氧化產(chǎn)物呈深藍(lán)色顆粒，在暗視野下呈橙色。DAB和TMB反應(yīng)液的pH值要求不同，DAB要求pH6.0，而TMB則為pH3.3，TMB反應(yīng)產(chǎn)物不如DAB的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，在pH7.0溶液中很快消失，但可用重金屬鹽（例如鈷、鎳、鉬、鎢等）穩(wěn)定之。l（六）結(jié)果觀(guān)察l DAB反應(yīng)物在神經(jīng)元胞體內(nèi)呈褐色圓粒，大小及分布較均勻，可擴(kuò)展至樹(shù)突近段內(nèi)。除顆粒外，胞體內(nèi)應(yīng)無(wú)其他的棕色染色產(chǎn)物。如用Mesulam的聯(lián)苯胺法或TMB法，HRP之反應(yīng)

28、顆粒呈藍(lán)色，在明視野下清晰可辨。如果反應(yīng)的顆粒很多，神經(jīng)元的藍(lán)色很濃時(shí)，用暗視野觀(guān)察反而不清楚;但如顆粒較稀，還是暗視野更靈敏。有些標(biāo)記神經(jīng)元在明視野下僅勉強(qiáng)可辨或幾乎不能分辨，但在暗視野下仍清晰可見(jiàn)。藍(lán)色反應(yīng)的顆粒在暗視野下呈橘黃色。l熒光素追蹤法熒光素追蹤法l熒光染料追蹤法主要用作逆行追蹤。有的染料也可被用于順行追蹤，但標(biāo)記較弱。熒光染料的種類(lèi)很多，按熒光染料的標(biāo)記部位可將它們分為兩類(lèi)，一類(lèi)主要標(biāo)記細(xì)胞核，如核黃(nuclear yellow)和diamidino yellow，另一類(lèi)主要標(biāo)記細(xì)胞漿，如固藍(lán)(fast blue)和熒光金(fluoro-gold)，多數(shù)熒光染料屬后者。不同的染料有不