電泳技術(shù)生化實(shí)驗(yàn)

1、Electrophoresis Theory ,Methods and Aplications第十八第十八 電泳技術(shù)電泳技術(shù)電泳的概念電泳的概念 電泳是指荷電的膠體顆電泳是指荷電的膠體顆粒在電場中的移動。粒在電場中的移動。 電泳技術(shù)的高度特異性，電泳技術(shù)的高度特異性，使混合物可以進(jìn)行電泳使混合物可以進(jìn)行電泳分析。甚至結(jié)晶純化的分析。甚至結(jié)晶純化的樣品也可在電泳分析中樣品也可在電泳分析中分出兩條帶或更多的電分出兩條帶或更多的電泳帶。泳帶。 電泳方法的溫和性，對電泳方法的溫和性，對不穩(wěn)定的生物大分子的不穩(wěn)定的生物大分子的分離純化有時比其它分分離純化有時比其它分離技術(shù)如沉淀法、離心、離技術(shù)如沉淀法、

2、離心、層析等更為方便，可靠，層析等更為方便，可靠，甚至可作為具有一定規(guī)甚至可作為具有一定規(guī)模的制備方法模的制備方法.第一節(jié) 基本原理 生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的質(zhì)的 H H濃度或與其它大分濃度或與其它大分子的相互作用。在電場中，子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，帶電顆粒向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電遷移的方向取決于它們帶電的符號，這種遷移現(xiàn)象即稱的符號，這種遷移現(xiàn)象即稱為電泳。為電泳。影響電泳速度的相關(guān)因素FE q V=1.1. 帶電顆粒在電

3、場中泳動的速度和帶電顆粒帶電顆粒在電場中泳動的速度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質(zhì)的凈電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質(zhì)粘度成反比。粘度成反比。2.2. 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 E E 愈高，帶電顆粒的泳動速度愈高，帶電顆粒的泳動速度愈快，反之亦然。愈快，反之亦然。3.3. 溶液的溶液的 PH PH 偏離分子的等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，觧離偏離分子的等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，觧離度愈大，凈電荷愈多，泳動速度越快。離度愈大，凈電荷愈多，泳動速度越快。離子強(qiáng)度加大，電流加大，泳動速度加快。子強(qiáng)度加大，電流加大，泳動速度加快。f E q -SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附的反離子吸附的反離子固定基團(tuán)

4、5.焦耳熱：電場強(qiáng)度或電極緩沖液離子強(qiáng)度增高，電流強(qiáng)度也增加，焦耳熱：電場強(qiáng)度或電極緩沖液離子強(qiáng)度增高，電流強(qiáng)度也增加，不僅降低分辨率，即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和；嚴(yán)重時甚至不僅降低分辨率，即電泳譜帶的展寬和組分的熱混和；嚴(yán)重時甚至燒斷或熔化支持介質(zhì)。燒斷或熔化支持介質(zhì)。6.6.篩孔：人為控制電泳介質(zhì)的有效篩孔。根據(jù)要求調(diào)節(jié)、控制、基篩孔：人為控制電泳介質(zhì)的有效篩孔。根據(jù)要求調(diào)節(jié)、控制、基質(zhì)中交聯(lián)劑的濃度或篩孔的大小，影響顆粒移動的速度。質(zhì)中交聯(lián)劑的濃度或篩孔的大小，影響顆粒移動的速度。4.電滲：支持物周圍的離子層在電場作用下移動。是支電滲：支持物周圍的離子層在電場作用下移動。是支持物本身

5、所帶的電荷吸附溶液中性質(zhì)相反的離子，在持物本身所帶的電荷吸附溶液中性質(zhì)相反的離子，在電場中移動的結(jié)果。其帶電愈高，電滲力愈大。電場中移動的結(jié)果。其帶電愈高，電滲力愈大。生物大分子遷移的方式生物大分子遷移的方式1. 分子的尺寸大小和形狀；分子的尺寸大小和形狀；2. 分子帶電荷的性質(zhì)與量；分子帶電荷的性質(zhì)與量；3. 分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。電泳的基本分類電泳的基本分類1.移動界面電泳移動界面電泳 moving boundary electro.2.區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 zone electrophoresis3.穩(wěn)態(tài)電泳穩(wěn)態(tài)電泳 steady state electrophor

6、esis 界面移動電泳界面移動電泳: : 在界面移動在界面移動電泳儀的中間漏斗裝上待測電泳儀的中間漏斗裝上待測溶膠，溶膠，U U型管上端裝電極，底型管上端裝電極，底部兩個活塞的內(nèi)徑與管徑相部兩個活塞的內(nèi)徑與管徑相同。同。 實(shí)驗(yàn)開始時，打開活塞，實(shí)驗(yàn)開始時，打開活塞，使溶膠進(jìn)入使溶膠進(jìn)入U U型管，使兩壁液型管，使兩壁液面等高。接通電源，小心打面等高。接通電源，小心打開活塞，觀察液面開活塞，觀察液面 的變化。的變化。根據(jù)通電時間和液面升高或根據(jù)通電時間和液面升高或下降的刻度，計算電泳速度。下降的刻度，計算電泳速度。若是無色溶膠，用紫外吸收若是無色溶膠，用紫外吸收或其它光學(xué)方法讀出液面的或其它光學(xué)

7、方法讀出液面的變化，變化， 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳: : 區(qū)帶電泳是將惰性的固區(qū)帶電泳是將惰性的固體或凝膠作支持物，在其上面進(jìn)行體或凝膠作支持物，在其上面進(jìn)行電泳，而將電泳速度不同的各組成電泳，而將電泳速度不同的各組成分離。區(qū)帶電泳實(shí)驗(yàn)簡便易行，分分離。區(qū)帶電泳實(shí)驗(yàn)簡便易行，分離效率高，樣品用量少，是分析和離效率高，樣品用量少，是分析和分離蛋白質(zhì)的基本方法。分離蛋白質(zhì)的基本方法。 用濾紙用濾紙作為載體的稱為紙上電泳作為載體的稱為紙上電泳, ,聚丙烯聚丙烯酰胺凝膠電泳酰胺凝膠電泳, ,瓊脂糖凝膠電泳等瓊脂糖凝膠電泳等. .各組分即以不同速度沿載體運(yùn)動，各組分即以不同速度沿載體運(yùn)動，經(jīng)一經(jīng)一 段時間后，

8、形成距起點(diǎn)不同段時間后，形成距起點(diǎn)不同距離的區(qū)帶，區(qū)帶等于樣品中的組距離的區(qū)帶，區(qū)帶等于樣品中的組分?jǐn)?shù)。再用適當(dāng)方法，進(jìn)行分析。分?jǐn)?shù)。再用適當(dāng)方法，進(jìn)行分析。 第二節(jié)第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)一一. .原理原理 以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法。 由于其分辨率高，不僅能分離含有各種大分子混由于其分辨率高，不僅能分離含有各種大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如電荷、合物，而且可以研究生物大分子的特性；如電荷、分子量、等電點(diǎn)及分子構(gòu)型。分子量、等電點(diǎn)及分

9、子構(gòu)型。 聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個優(yōu)點(diǎn)；聚丙烯酰胺凝膠電泳的三個優(yōu)點(diǎn)；A A：可以在天然狀態(tài)分離生物大分子；：可以在天然狀態(tài)分離生物大分子；B:B:可以分析蛋白質(zhì)與別的生物分子的混合物；可以分析蛋白質(zhì)與別的生物分子的混合物；C:C:電泳分離后仍然保持生物活性。電泳分離后仍然保持生物活性。+蛋白質(zhì)分子在常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素蛋白質(zhì)分子在常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分離因素蛋白質(zhì)的電荷量起主要作用蛋白質(zhì)的電荷量起主要作用蛋白質(zhì)的分子大小起主要作用蛋白質(zhì)的分子大小起主要作用蛋白質(zhì)分子的構(gòu)形起主要作用蛋白質(zhì)分子的構(gòu)形起主要作用1.聚丙烯酰胺凝膠的合成聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺丙稀酰胺N,N

10、-N,N-甲基雙丙稀甲基雙丙稀酰胺酰胺聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠催化劑催化劑聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)烯溶液烯溶液濃溶液濃溶液 交聯(lián)劑交聯(lián)劑 凝膠凝膠 結(jié)點(diǎn)結(jié)點(diǎn)T= X100%a+bmC= x100ba+bC=6.5-0.3T2.2.聚丙烯酰胺的聚合及影響因素聚丙烯酰胺的聚合及影響因素 化學(xué)聚合：以過硫酸銨化學(xué)聚合：以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲級乙二胺為催化劑，以四甲級乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。 丙稀酰胺由過硫酸銨丙

11、稀酰胺由過硫酸銨（AP）在堿性條件下產(chǎn)生游離氧自由在堿性條件下產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙稀酰胺成為自由基狀態(tài)而成的。在堿性基引發(fā)單體丙稀酰胺成為自由基狀態(tài)而成的。在堿性 PH 時，時，反應(yīng)速率迅速；而在酸性條件時，同樣濃度溶液，聚合速率反應(yīng)速率迅速；而在酸性條件時，同樣濃度溶液，聚合速率減慢。減慢。 在低溫時聚合，凝膠會變得脆而渾濁，且重復(fù)性差，在在低溫時聚合，凝膠會變得脆而渾濁，且重復(fù)性差，在25 聚合的凝膠則較透明和有彈性。聚合的凝膠則較透明和有彈性。 分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合，分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合，O2使過硫酸銨使過硫酸銨（AP）分解。故在做膠后常要用水進(jìn)行封閉；分解

12、。故在做膠后常要用水進(jìn)行封閉； 金屬離子也干擾凝膠的化學(xué)聚合。金屬離子也干擾凝膠的化學(xué)聚合。光聚合：以核黃素為催化劑在少量的氧存在下光聚合：以核黃素為催化劑在少量的氧存在下, ,分解成無分解成無色的還原型，在少量的色的還原型，在少量的O2條件下，還原型的核黃素氧化條件下，還原型的核黃素氧化成有游離基的黃素環(huán)，聚合反應(yīng)發(fā)生。成有游離基的黃素環(huán)，聚合反應(yīng)發(fā)生。 用量少，不會對樣品有任何不良的干擾現(xiàn)象；故常用于用量少，不會對樣品有任何不良的干擾現(xiàn)象；故常用于樣品膠的聚合；樣品膠的聚合； 聚合的時間可以自由控制聚合的時間可以自由控制 缺點(diǎn)：光照的量不容易掌握，重現(xiàn)性不太好；缺點(diǎn)：光照的量不容易掌握，重

13、現(xiàn)性不太好； 光聚合適合大孔徑凝膠的聚合，化學(xué)聚合適合各種凝膠光聚合適合大孔徑凝膠的聚合，化學(xué)聚合適合各種凝膠的聚合。的聚合。核黃素B1 還原型 游離基 聚合反應(yīng)光照光照O23.聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑和分子篩效應(yīng) 凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質(zhì)，能起到防止對流，凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質(zhì)，能起到防止對流，把擴(kuò)散減到最小，而且能影響大分子顆粒的移動過程。把擴(kuò)散減到最小，而且能影響大分子顆粒的移動過程。 大分子在凝膠中的分離是受其電荷、尺寸、和形狀因素的影響大分子在凝膠中的分離是受其電荷、尺寸、和形狀因素的影響 凝膠的這種用于分離不同尺寸分

14、子的特性是由于它的尺寸篩分能凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力力（Size sieving capacity），故將此現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)，故將此現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)（Molecular sieving effect）. 有效孔徑取決于凝膠的總濃度有效孔徑取決于凝膠的總濃度 T，孔徑隨著孔徑隨著 T% 的增加而減的增加而減小小。 甲基雙丙稀酰胺的濃度為甲基雙丙稀酰胺的濃度為5%5%時，有效孔徑最?。粫r，有效孔徑最??；T= 5%時，甲時，甲基雙丙稀酰胺的濃度為基雙丙稀酰胺的濃度為5%時，孔徑為時，孔徑為20nm。 T T是凝膠溶質(zhì)的總百分濃度，是凝膠溶質(zhì)的總百分濃度，C C是

15、與總濃度相關(guān)的交聯(lián)百分濃度。是與總濃度相關(guān)的交聯(lián)百分濃度。故故T T是決定是決定C C，分離物的分子量的大小又決定了，分離物的分子量的大小又決定了T T的濃度。的濃度。 5 7 9 11 13 15 T%A B凝膠濃度凝膠濃度T對樣品遷移率的影響對樣品遷移率的影響例：混合蛋白質(zhì)例：混合蛋白質(zhì)A,BA,B，A A分子量較小，分子量較小，B B分子帶電荷較多，分子帶電荷較多，T T5 5時，電泳行為主要以電荷起作用，時，電泳行為主要以電荷起作用，B B 遷移速度快。當(dāng)遷移速度快。當(dāng) T T 增加，分子篩效應(yīng)增加，增加，分子篩效應(yīng)增加，B B的遷移速度減慢；的遷移速度減慢；T T 9 9 時，時，A

16、 A，B B的遷移率相同，不能分開，的遷移率相同，不能分開，T T 再增加，凝膠孔徑更小，再增加，凝膠孔徑更小，A A分子比分子比B B分子小，表現(xiàn)較高的遷移率。并且說明電泳只獲分子小，表現(xiàn)較高的遷移率。并且說明電泳只獲得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。遷移率遷移率異常樣本異常樣本:快快Hb(HbH,HbJ) 慢慢Hb (HbG,HbI,HbE二二.儀器的進(jìn)展儀器的進(jìn)展 電泳槽是凝膠電泳的核心電泳槽是凝膠電泳的核心部分，所以變化主要是電部分，所以變化主要是電泳槽的變革。泳槽的變革。水平板狀水平板狀垂直的濾紙條垂直的濾紙條濾紙連接的濾紙連接的水平

17、凝膠水平凝膠園盤電泳槽園盤電泳槽垂直夾心板狀垂直夾心板狀三三. .不連續(xù)凝膠電泳（不連續(xù)凝膠電泳（discdisc）的分離原理）的分離原理(一一).原理原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)，還具有，還具有濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)與與分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質(zhì)與密度相近的但，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同時度有差

18、別的分子可以分離；或電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同時亦可分離。亦可分離。 堿性不連續(xù)分離酸性樣品堿性不連續(xù)分離酸性樣品不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng) 酸性不連續(xù)分離堿性樣品酸性不連續(xù)分離堿性樣品 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離。. .濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 1.凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑（烯）（烯） T T5 5，分離膠一般為小，分離膠一般為小孔徑（濃）孔徑（濃）T T7.57.5。樣品在較烯。樣品在較烯的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，便形成一道柵

19、欄，所有的樣品分子便形成一道柵欄，所有的樣品分子在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得到到濃縮濃縮，然后，再，然后，再依依據(jù)分子量的大據(jù)分子量的大小進(jìn)行小進(jìn)行篩分篩分電泳分離。電泳分離。 2.2.緩沖液的組成緩沖液的組成: :圖示。圖示。PHPH系統(tǒng)的系統(tǒng)的不連續(xù)，各種分子的不連續(xù)，各種分子的電荷電荷之間的差之間的差異進(jìn)行分離。異進(jìn)行分離。 3.3.緩沖體系的不連續(xù)，其中各組成緩沖體系的不連續(xù)，其中各組成的離子、反離子遷移快慢的差別是的離子、反離子遷移快慢的差別是影響樣品濃縮效應(yīng)的重要因素。影響樣品濃縮效應(yīng)的重要因素。 4.4.離子的遷移速率及濃度的不連續(xù)離子的遷移速率及

20、濃度的不連續(xù)又造成電場強(qiáng)度與電導(dǎo)率的變化。又造成電場強(qiáng)度與電導(dǎo)率的變化。分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 移動界面到達(dá)濃縮膠和分離移動界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的膠界面時，凝膠的PHPH變化明變化明顯，緩沖液中甘氨酸的觧離顯，緩沖液中甘氨酸的觧離迅速增加，直至迅速增加，直至50%50%觧離成觧離成 Gly-,-,其分子量小，遷移超其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和電壓梯度和PH PH 值中泳動，值中泳動，依其分子量

21、的大小而分開。依其分子量的大小而分開。電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 蛋白質(zhì)所帶的凈電的蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率的關(guān)系，在的遷移率的關(guān)系，在同一電場強(qiáng)度中，在同一電場強(qiáng)度中，在單位時間內(nèi)各分子遷單位時間內(nèi)各分子遷移的距離的差別而到移的距離的差別而到達(dá)分離。達(dá)分離。（二）（二）. .操作操作1.垂直柱狀，板狀的垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制；統(tǒng)的組成和配制；2.均一凝膠與梯度凝均一凝膠與梯度凝膠配制；膠配制；3.電極緩沖液系統(tǒng)；電極緩沖液系統(tǒng)；4.樣品的準(zhǔn)備；樣品的準(zhǔn)備；5.加樣要求加樣要求6.電泳電泳7.檢測檢測PH 8.3PH 6.7P

22、H 8.9PH 8.3 垂直柱狀，板狀的垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制統(tǒng)的組成和配制均一凝膠與梯度凝膠配制均一凝膠與梯度凝膠配制連續(xù)均一凝膠電泳效果連續(xù)均一凝膠電泳效果不連續(xù)均一凝膠電泳效果不連續(xù)均一凝膠電泳效果不連續(xù)梯度凝膠電泳效果不連續(xù)梯度凝膠電泳效果均一凝膠是指整塊凝膠為同一均一凝膠是指整塊凝膠為同一濃度或者分離膠為均一濃度的濃度或者分離膠為均一濃度的凝膠。凝膠。梯度膠是指分離膠由一定的濃梯度膠是指分離膠由一定的濃度組成，一般是線性梯度，通度組成，一般是線性梯度，通常從陰極至陽間，梯度濃度逐常從陰極至陽間，梯度濃度逐漸加大，孔徑變小，利用分子漸加大，孔徑變

23、小，利用分子篩作用提高分辨率，適合復(fù)雜篩作用提高分辨率，適合復(fù)雜樣品的分離。樣品的分離。緩沖液系統(tǒng)緩沖液系統(tǒng) 濃縮凝膠緩沖液濃縮凝膠緩沖液0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分離凝膠緩沖液分離凝膠緩沖液1.5mol/L Tris-HCl,PH8.9 電極緩沖液系統(tǒng)電極緩沖液系統(tǒng) 0.025mol/L Tris（三羥甲基氨基甲烷）（三羥甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨甘氨酸酸) PH8.3 樣品緩沖液樣品緩沖液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、甘油、0.05mg/ml溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 樣品緩沖液的要求：樣品緩沖液的要求： 選擇合適的選擇合適的P

24、H與離子強(qiáng)度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、與離子強(qiáng)度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3不連續(xù)電泳濃縮膠和分離膠的配方不連續(xù)電泳濃縮膠和分離膠的配方 貯存液貯存液 凝膠終濃度凝膠終濃度T 4% 7.5% 10% 15% 20% 單體貯液（單體貯液（14.55:0.55） 0.65 3.8 5.0 7.5 10濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(ml) 0.1 0 0 0 0分離膠緩沖液分離膠緩沖液(ml) 0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml) 4.25 10.9

25、 9.7 7.2 4.7真空抽氣真空抽氣10%AP(過硫酸銨過硫酸銨) (ul) 5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺(ul) 2.5 7 7 7 7總體積總體積 5ml 15ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品：是一組（標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品：是一組（5 57 7種）已知的合適的分子量范圍的、種）已知的合適的分子量范圍的、構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì)，溶解在構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì)，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品緩沖液中備用。樣品的濃度樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組分析目的、檢測方法和樣品的組成是關(guān)鍵；成是關(guān)鍵；未知樣品濃度：未知樣品濃度： 0.10.120mg/ml20

26、mg/ml考瑪斯亮籃染色：考瑪斯亮籃染色： 1 12mg/ml2mg/ml銀銀 染染 色色 : 0.02: 0.020.2mg/ml0.2mg/ml 高純度樣品：高純度樣品： 0.50.52mg/ml2mg/ml加樣加樣電泳電泳 光吸收光吸收檢測檢測 考瑪斯亮籃染色考瑪斯亮籃染色 染色染色 銀銀 染染 色色 第三節(jié)第三節(jié) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，主十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，主要用于測定要用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量蛋白質(zhì)亞基的分子量。強(qiáng)還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇能使半光氨酸強(qiáng)還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇能使半光氨酸

27、殘基之間的二硫鍵斷裂。殘基之間的二硫鍵斷裂。 是目前用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量的一種最好是目前用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量的一種最好的方法。的方法。 在蛋白質(zhì)樣品和凝膠中加入在蛋白質(zhì)樣品和凝膠中加入SDSSDS和還原劑后分子被解聚成多肽鏈，它們與和還原劑后分子被解聚成多肽鏈，它們與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物膠束，所帶的電荷大大超復(fù)合物膠束，所帶的電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子原有的電荷差異。電泳的遷移率不過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子原有的電荷差異。電泳的遷移率不再受電荷的影響，而只與蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小有

28、關(guān)。再受電荷的影響，而只與蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小有關(guān)。SDS-PAGESDS-PAGE的幾種方式的幾種方式影響影響SDS-SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)合的因素結(jié)合的因素1.溶液中溶液中SDSSDS單單體的濃度體的濃度2.樣品緩沖液的樣品緩沖液的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度3.二硫鍵是否二硫鍵是否完全被還原完全被還原操操 作作SDSSDS凝膠電泳掃描與染色圖譜凝膠電泳掃描與染色圖譜 蛋白質(zhì)分子的電泳遷蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率與分子量的計算移率與分子量的計算蛋白質(zhì)分子量的計算蛋白質(zhì)分子量的計算1.1.要求一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，其分子要求一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，其分子量應(yīng)包含欲測分子的大?。涣繎?yīng)包含欲測分子的大?。?.2.欲測分子

29、的性質(zhì)欲構(gòu)形與標(biāo)準(zhǔn)欲測分子的性質(zhì)欲構(gòu)形與標(biāo)準(zhǔn)分子類似；分子類似；3.3.標(biāo)準(zhǔn)蛋白與被測分子在同一塊標(biāo)準(zhǔn)蛋白與被測分子在同一塊凝膠上電泳。并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。凝膠上電泳。并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。電泳過程中不正?，F(xiàn)象電泳過程中不正?，F(xiàn)象 紋理現(xiàn)象紋理現(xiàn)象 拖尾現(xiàn)象拖尾現(xiàn)象 蛋白帶歪斜現(xiàn)象蛋白帶歪斜現(xiàn)象 微笑與皺眉現(xiàn)象微笑與皺眉現(xiàn)象 蛋白帶過寬，鄰近泳道蛋白帶過寬，鄰近泳道 相連的現(xiàn)象。相連的現(xiàn)象。微笑與皺眉微笑與皺眉第四節(jié)第四節(jié) 等電點(diǎn)聚焦等電點(diǎn)聚焦-在在PH梯度中的電泳梯度中的電泳 利用蛋白質(zhì)分子和其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，利用蛋白質(zhì)分子和其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的在一個穩(wěn)定的、

30、連續(xù)的、線性的PH梯度中進(jìn)行蛋梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。白質(zhì)的分離和分析。 等電點(diǎn)聚焦技術(shù)分析的對象只限于蛋白質(zhì)和兩性等電點(diǎn)聚焦技術(shù)分析的對象只限于蛋白質(zhì)和兩性分子。分子。 利用載體兩性電解質(zhì)在通電的條件下，能夠形成利用載體兩性電解質(zhì)在通電的條件下，能夠形成連續(xù)的、線性的連續(xù)的、線性的PH梯度，但拆除電源后梯度，但拆除電源后PHPH梯度消梯度消失，因此在聚丙烯酰胺凝膠中加入載體兩性電解失，因此在聚丙烯酰胺凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)變可形成穩(wěn)定的質(zhì)變可形成穩(wěn)定的PHPH梯度，通過電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)梯度，通過電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。的分離和分析。-+兩性電解兩性電解質(zhì)載體質(zhì)載體樣品的加入樣品的加

31、入接通電源，接通電源，開始聚焦開始聚焦聚焦完成聚焦完成蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn)的聚焦效應(yīng)等電點(diǎn)的聚焦效應(yīng)等電點(diǎn)聚焦的分辨率等電點(diǎn)聚焦的分辨率載體兩性電解質(zhì)和載體兩性電解質(zhì)和PHPH梯度范圍的選擇梯度范圍的選擇載體兩性電解質(zhì)的特點(diǎn)載體兩性電解質(zhì)的特點(diǎn)1.1.分子量??；分子量??；2.2.可溶性好；可溶性好；3.3.緩沖能力強(qiáng)；緩沖能力強(qiáng)；4.4.電導(dǎo)性均勻；電導(dǎo)性均勻；5.5.紫外吸收低，不發(fā)熒光；紫外吸收低，不發(fā)熒光；6.6.容易從聚焦的蛋白帶中除去；容易從聚焦的蛋白帶中除去；7.7.無毒、無生物學(xué)效應(yīng)。無毒、無生物學(xué)效應(yīng)。操 作1. .凝膠制備系統(tǒng)用凝膠制備系統(tǒng)用H H2 2O O配

32、制（不含緩沖系統(tǒng)配制（不含緩沖系統(tǒng)）；并含載體兩并含載體兩性電解質(zhì)性電解質(zhì)；2.樣品不含鹽；樣品可以加在凝膠的任何部位，或與凝膠樣品不含鹽；樣品可以加在凝膠的任何部位，或與凝膠一起聚合；一起聚合；3.3.電極溶液是單一的酸和堿分別為陽極與陰極；電極溶液是單一的酸和堿分別為陽極與陰極；4 4. .聚焦時，電泳為穩(wěn)壓，聚焦時間在聚焦時，電泳為穩(wěn)壓，聚焦時間在4 4小時以上，隨著時間小時以上，隨著時間的延長，聚焦效果愈好；聚焦完成時，電流趨近于的延長，聚焦效果愈好；聚焦完成時，電流趨近于0 0。而。而一般的電泳是隨著時間的延長，電泳帶有擴(kuò)散效應(yīng)。一般的電泳是隨著時間的延長，電泳帶有擴(kuò)散效應(yīng)。5 5.

33、PH .PH 梯度的測定及繪制梯度的測定及繪制PHPH曲線；曲線；6 6. .固定染色，對樣品等電點(diǎn)的測定。固定染色，對樣品等電點(diǎn)的測定。PH梯度對凝膠長度梯度對凝膠長度( (cm)的關(guān)系的關(guān)系序號序號123456789101112131415cm0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5PH4.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.8電泳方法的比較電泳方法的比較電泳方法 PAGEDISCSDS-PAGEIEF特征以電荷為主；以電荷為主；以分子量為主；以分子量為主；樣品的結(jié)構(gòu)特樣品的結(jié)構(gòu)特征。征。不連

34、續(xù)的凝膠濃不連續(xù)的凝膠濃度；不連續(xù)的緩度；不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)；不連續(xù)沖系統(tǒng)；不連續(xù)的的PH；不同的；不同的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度陰離子去污陰離子去污劑還原劑劑還原劑使蛋白質(zhì)聚使蛋白質(zhì)聚集體解開集體解開兩性電解兩性電解質(zhì)載體質(zhì)載體濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)結(jié)果分析的蛋白分析的蛋白質(zhì)有活性質(zhì)有活性分析的蛋白分析的蛋白質(zhì)有活性質(zhì)有活性測定蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)亞基的分子亞基的分子量（變性）量（變性）測定蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的等電點(diǎn)第五節(jié)第五節(jié).雙向電泳雙向電泳 生物體中蛋白質(zhì)的數(shù)量與其功能的復(fù)雜性密生物體中蛋白質(zhì)的數(shù)量與其功能的復(fù)雜性密切相關(guān)，在大腸桿菌中有切相關(guān)，在大腸桿菌中有54

35、54種不同的蛋白質(zhì)，而種不同的蛋白質(zhì)，而在典型的人類細(xì)胞中，可表達(dá)的基因約在典型的人類細(xì)胞中，可表達(dá)的基因約50005000個個; ;同同時各種蛋白質(zhì)的含量存在巨大的差異，從時各種蛋白質(zhì)的含量存在巨大的差異，從1010 0.0010.001 總蛋白量，因此對純化、鑒定的要求總蛋白量，因此對純化、鑒定的要求必須是必須是高分辨，高效率高分辨，高效率及及速度快速度快。 以前介紹的方法技術(shù)中唯一能到達(dá)上述要求以前介紹的方法技術(shù)中唯一能到達(dá)上述要求的是高效液相色譜，但由于儀器的昂貴以及需要的是高效液相色譜，但由于儀器的昂貴以及需要標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)操作員的專業(yè)知識等受到限制。因標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)操作員的專業(yè)知識等受

36、到限制。因此此雙向電泳技術(shù)可以有效的克服這些問題。雙向電泳技術(shù)可以有效的克服這些問題?；?本本 原原 理理 傳統(tǒng)的單向電泳方法最多只能分析傳統(tǒng)的單向電泳方法最多只能分析100 100 余種蛋白質(zhì)樣品，余種蛋白質(zhì)樣品，故不適合分析細(xì)胞和亞細(xì)胞中蛋白質(zhì)的混合物。當(dāng)采用兩種故不適合分析細(xì)胞和亞細(xì)胞中蛋白質(zhì)的混合物。當(dāng)采用兩種不同原理的電泳程序，就能使分辨率提高幾個數(shù)量級。不同原理的電泳程序，就能使分辨率提高幾個數(shù)量級。 利用利用SDS-PAGE及及等電點(diǎn)聚焦等電點(diǎn)聚焦相結(jié)合的電泳技術(shù)，將組分復(fù)相結(jié)合的電泳技術(shù)，將組分復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品在一塊凝膠上進(jìn)行互為垂直的兩次電泳，使雜的蛋白質(zhì)樣品在一塊凝膠上進(jìn)

37、行互為垂直的兩次電泳，使各組分依其分子量及等電點(diǎn)的差異，以點(diǎn)的形式分步，再配各組分依其分子量及等電點(diǎn)的差異，以點(diǎn)的形式分步，再配以高靈敏度的（銀染色或標(biāo)記法）檢測技術(shù)，使一塊以高靈敏度的（銀染色或標(biāo)記法）檢測技術(shù)，使一塊30X40cm的凝膠是可分辨的凝膠是可分辨10000個蛋白質(zhì)點(diǎn)及個蛋白質(zhì)點(diǎn)及110ng的量。的量。 雙向電泳圖解雙向電泳圖解操操 作作 雙向電泳一般是指第一向?yàn)榈入婞c(diǎn)聚焦雙向電泳一般是指第一向?yàn)榈入婞c(diǎn)聚焦, ,第二向?yàn)榈诙驗(yàn)樘荻忍荻萐DSSDS電泳電泳. .樣品通過電荷和質(zhì)量的兩次分離后樣品通過電荷和質(zhì)量的兩次分離后, ,可以得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息可以得到分子的等電點(diǎn)

38、、分子量等信息. .分離的結(jié)分離的結(jié)果不是帶果不是帶, ,而是點(diǎn)而是點(diǎn). .根據(jù)坐標(biāo)系統(tǒng)作圖根據(jù)坐標(biāo)系統(tǒng)作圖, ,從左到右是從左到右是等電點(diǎn)等電點(diǎn)PIPI的變化的變化( (增加或降低增加或降低),),從上到下是分子量從上到下是分子量的增加的增加. . 這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高, ,信息最信息最多的技術(shù)多的技術(shù). .聚丙烯酰胺凝膠電泳在測序方面應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳在測序方面應(yīng)用第六節(jié)第六節(jié) 蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡（Protein blotting） 蛋白質(zhì)印跡法是把電泳和層析分離的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)印跡法是把電泳和層析分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定膜上的過程；雖然在轉(zhuǎn)移

39、到固定膜上的過程；雖然在PAGE對蛋對蛋白質(zhì)有很好的分離效果及良好的分辨率而廣白質(zhì)有很好的分離效果及良好的分辨率而廣泛應(yīng)用，但進(jìn)一步的分析受到限制。即探針泛應(yīng)用，但進(jìn)一步的分析受到限制。即探針分子很難通過凝膠的網(wǎng)孔而達(dá)到與嵌和在凝分子很難通過凝膠的網(wǎng)孔而達(dá)到與嵌和在凝膠中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合或檢測。膠中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合或檢測。通過轉(zhuǎn)移后，二者的結(jié)合變得容易，并且可通過轉(zhuǎn)移后，二者的結(jié)合變得容易，并且可以進(jìn)行多種分析，因此在免疫檢測中是非常以進(jìn)行多種分析，因此在免疫檢測中是非常重要的手段。重要的手段。操作步驟操作步驟1.SDS電泳的蛋白質(zhì)；電泳的蛋白質(zhì)；2.蛋白質(zhì)樣品直接點(diǎn)樣蛋白

40、質(zhì)樣品直接點(diǎn)樣 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 膜膜（PVDF聚偏氟聚偏氟乙烯膜）乙烯膜）封閉硝酸纖維素膜，防止封閉硝酸纖維素膜，防止蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合 封封 阻（淬滅）阻（淬滅）抗原、抗體的抗原、抗體的特異性反應(yīng)特異性反應(yīng) 反反 應(yīng)應(yīng) 標(biāo)記的抗體與低物標(biāo)記的抗體與低物的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng) 顯顯 色色定量、定性分析定量、定性分析 檢測分析檢測分析基基 本本 慨慨 念念1.探針：用化學(xué)方法將有識別能探針：用化學(xué)方法將有識別能力的物質(zhì)（抗原，激素，核酸力的物質(zhì)（抗原，激素，核酸等）和酶或同位素或熒光物質(zhì)等）和酶或同位素或熒光物質(zhì)結(jié)合成的復(fù)合物的通稱。結(jié)合成的復(fù)合物的通稱。2.固相載體：硝酸纖維素膜，尼

41、固相載體：硝酸纖維素膜，尼龍膜等。龍膜等。3.淬滅（封阻）：與印跡的成份淬滅（封阻）：與印跡的成份親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的，不與待測物親緣關(guān)系很遠(yuǎn)的，不與待測物起反應(yīng)的，將印跡區(qū)域以外全起反應(yīng)的，將印跡區(qū)域以外全部吸附的物質(zhì)。使探針除了與部吸附的物質(zhì)。使探針除了與印跡物結(jié)合，再無其他結(jié)合的印跡物結(jié)合，再無其他結(jié)合的地方。背景干凈，反應(yīng)清晰。地方。背景干凈，反應(yīng)清晰。4.印跡：凝膠電泳后的組分，通過印跡：凝膠電泳后的組分，通過吸附或電轉(zhuǎn)移，也可直接點(diǎn)樣吸附或電轉(zhuǎn)移，也可直接點(diǎn)樣品到固相膜上。品到固相膜上。 抗原抗體的特異性反應(yīng)抗原抗體的特異性反應(yīng)2.二抗體二抗體上結(jié)合酶上結(jié)合酶二抗體二抗體上結(jié)合膠上結(jié)合膠

42、體金顆粒體金顆粒3.生物素標(biāo)生物素標(biāo)記二抗體記二抗體1.抗體上抗體上結(jié)合酶結(jié)合酶抗生物素朊抗生物素朊生物素應(yīng)用例應(yīng)用例3. 豚鼠血清豚鼠血清 兔兔 血清血清 兔抗豚鼠抗體（二抗體）兔抗豚鼠抗體（二抗體） 標(biāo)記二抗體標(biāo)記二抗體 病毒病毒 豚鼠豚鼠 血清血清 抗體（一抗體）抗體（一抗體）2.病毒病毒 SDS-PAGE 轉(zhuǎn)膜（抗原）轉(zhuǎn)膜（抗原） 封閉封閉顯色反應(yīng)：染色、放射自顯影顯色反應(yīng)：染色、放射自顯影點(diǎn)印跡的暴光點(diǎn)印跡的暴光點(diǎn)的顏色深淺顯示樣品的定量結(jié)果點(diǎn)的顏色深淺顯示樣品的定量結(jié)果應(yīng)用方面應(yīng)用方面 定性研究：確定病毒的哪定性研究：確定病毒的哪些結(jié)構(gòu)蛋白起到抗原的作些結(jié)構(gòu)蛋白起到抗原的作用；用；

43、 定量分析：測定抗體的效定量分析：測定抗體的效價。價。第七節(jié)第七節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳適用小分子聚丙烯酰胺凝膠電泳適用小分子DNADNA（5 5500 bp500 bp）的分）的分離，瓊脂糖凝膠適用離，瓊脂糖凝膠適用20020050 Kb DNA50 Kb DNA片段的分離。片段的分離。 瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物, ,為白色的小顆為白色的小顆?；蚍勰盍；蚍勰? ,在水中加熱在水中加熱90-100 3-590-100 3-5分鐘融化成清亮的分鐘融化成清亮的液態(tài)液態(tài). .其凝固點(diǎn)約其凝固點(diǎn)約 45 .45 .并且可以根據(jù)

44、需要配制一定的并且可以根據(jù)需要配制一定的濃度濃度. .原理原理: :1.1.線狀雙鏈線狀雙鏈 DNADNA在一定濃度瓊脂糖凝膠中的泳動距離與分在一定濃度瓊脂糖凝膠中的泳動距離與分子量的對數(shù)成反比子量的對數(shù)成反比; ;2.2.不同的凝膠濃度分離不同的凝膠濃度分離DNADNA片段有不同的有效范圍片段有不同的有效范圍; ;3.3.具有相同分子量具有相同分子量, ,不同構(gòu)型的不同構(gòu)型的DNADNA以不同的速率通過凝膠以不同的速率通過凝膠: :閉環(huán)閉環(huán)(型型)開環(huán)開環(huán)(型型)線型線型(型型););4.4.在低電壓時在低電壓時, ,線狀線狀DNADNA片段的遷移率與所用的電壓呈正比片段的遷移率與所用的電壓

45、呈正比關(guān)系關(guān)系; ;5.5.在變性條件電泳時在變性條件電泳時, ,核酸的二級結(jié)構(gòu)打開核酸的二級結(jié)構(gòu)打開, ,不論不論DNADNA或或RNARNA分子均以單鏈形式遷移分子均以單鏈形式遷移, ,其遷移率與分子量直接相關(guān)其遷移率與分子量直接相關(guān). .瓊脂糖的種類瓊脂糖的種類1.1. 高純度或超純瓊脂糖高純度或超純瓊脂糖: :應(yīng)用回收的應(yīng)用回收的DNADNA進(jìn)行進(jìn)行克隆克隆, ,酶切酶切, ,標(biāo)記等標(biāo)記等; ;2.2. 低熔點(diǎn)瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖(65)(65):保持回收凝膠中的保持回收凝膠中的樣品的穩(wěn)定性與活性樣品的穩(wěn)定性與活性; ;3.3. 高強(qiáng)度瓊脂糖高強(qiáng)度瓊脂糖: :進(jìn)行大分子的分離或低于進(jìn)行大

46、分子的分離或低于0.5%0.5%時采用時采用; ;4.4. 高篩分瓊脂糖高篩分瓊脂糖: :主要分離主要分離100-1200bp100-1200bp的小的小片段片段DNA,DNA,對相差對相差4 4個堿基的個堿基的DNADNA可以分辨可以分辨. .不同濃度瓊脂糖的不同濃度瓊脂糖的凝膠的濃度凝膠的濃度(%wv)dsDNA片段的分離范圍片段的分離范圍(kb) 0.35-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2緩沖液系統(tǒng)緩沖液系統(tǒng)1.電極緩沖液電極緩沖液:TAE 0.04molL Tris-乙酸乙酸,0.001mol

47、L EDTA,PH8.0TBE 0.045molL Tris-硼酸硼酸,0.001mol L EDTA,PH8.0 TPE 0.09molL Tris-磷酸磷酸,0.002mol L EDTA,PH8.02.加樣緩沖液加樣緩沖液: (6x)0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)+40%(w v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+15%聚蔗糖水溶液聚蔗糖水溶液;0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)+0.25%二甲苯青二甲苯青FF+0.4%啞叮橙啞叮橙+30%甘油水甘油水溶液溶液;(不宜用于

48、不宜用于TBE系統(tǒng)系統(tǒng)) (二甲苯青二甲苯青)-天藍(lán)天藍(lán)-4kb (溴酚藍(lán)溴酚藍(lán))-蘭色蘭色-300bp (啞叮橙啞叮橙)-黃色黃色-50bp核酸的染色核酸的染色 凝膠中的核酸經(jīng)染色后再進(jìn)行觀察與牌照記錄凝膠中的核酸經(jīng)染色后再進(jìn)行觀察與牌照記錄. .溴乙錠溴乙錠(EB)(EB)能能嵌入嵌入DNADNA堿基堿基, ,在紫外光激發(fā)呈現(xiàn)橙紅色熒光在紫外光激發(fā)呈現(xiàn)橙紅色熒光. .靈敏度達(dá)靈敏度達(dá)1-1-10ngDNA.10ngDNA.用非污染性的染料也可進(jìn)行用非污染性的染料也可進(jìn)行.(.(Goldview) )染色方法染色方法: :1.1.凝膠在凝膠在1-5ug EB1-5ug EBmlml的水溶液中

49、浸泡的水溶液中浸泡3030分鐘分鐘; ;2.2.在在0.1%0.1%焦寧的焦寧的0.5%0.5%乙酸乙酸,1mmol,1mmol檸檬酸溶液中浸泡檸檬酸溶液中浸泡; ;3.3.在在0.2%0.2%甲烯藍(lán)的甲烯藍(lán)的0.2mmolNaAc(PH7.4)0.2mmolNaAc(PH7.4)過夜過夜; ;4.4.固定后固定后,0.2%AgNO,0.2%AgNO3 3浸泡浸泡1212分鐘分鐘, ,漂洗漂洗,1.5%NaOH,1.5%NaOH和和0.4%0.4%甲醛顯甲醛顯色色,0.75%Na,0.75%Na2 2COCO3 3終止終止. .應(yīng)應(yīng) 用用1. 核酸分子片段大小鑒定核酸分子片段大小鑒定;2. 核酸樣品濃度的測定核酸樣品濃度的測定;毛細(xì)管電泳技術(shù)簡介毛細(xì)管電泳技術(shù)簡介概概 述述 毛細(xì)管電泳是一系列以內(nèi)徑毛細(xì)管電泳是一系列以內(nèi)徑10-200um10-200um的毛細(xì)管為分離的毛細(xì)管為分離通道，在高電場強(qiáng)度作用下對小分子和大分子的質(zhì)量、通道，在高電場強(qiáng)度作用下對小分子和大分子的質(zhì)量、電荷、淌度（電泳遷移率）進(jìn)行分離的技術(shù)的統(tǒng)稱電荷、淌度（電泳遷移率）進(jìn)